食品毒理学·食品中化学毒物的一般毒性作用

第五章 食品中化学毒物的一般毒性作用,主要教学内容：,急性、亚慢性、慢性毒性作用的概念；急性、亚慢性、慢性毒性试验的目的和 方法。,化学毒物： 指在一定条件下，以较小剂量给予时，可与生物体相互作用，引起生物体功能性或器质性损害的化学物质。一般毒性作用： 外来化学物在一定剂量、一定接触时间和接触方式下对试验动物产生的综合毒效应。分类（根据接触毒物的时间长短）： 急性毒性、亚慢性毒性和慢性毒性。,0 概述,第六章 化学毒物的一般毒性作用,一、急性毒性的概念二、急性毒性分级三、急性毒性试验的目的三、急性毒性试验的方法,第一节 急性毒性的作用,一、急性毒性的概念（acute toxicity）指机体（实验动物或人）一次或24h内多次接触外源化学物后，在短期内所发生的毒性效应，包括一般行为和外观改变、大体形态变化以及死亡效应。,第一节 急性毒性作用,1、急性接触的次数（一次或多次：经口、经注射；经呼吸道和经皮肤染毒指一个特定期间内）2、中毒效应出现的时间（一般为7-14d） 急性毒性效应一般是指机体接触化学物后，在较短时间内观察到的毒性症状。 3、中毒效应的强度 与毒物性质和染毒剂量大小有关。,急性毒性概念中的几个问题,二、急性毒性分级,二、急性毒性分级,表5-3 我国农药的急性毒性分级,二、急性毒性分级,表2-1 化学物质的急性毒性分级,1、测试和求出毒物的致死剂量，以及其他急性毒性参数，通常以LD50为最主要的参数。2、初步评估毒物对机体的毒效应特征、靶器官、剂量-反应关系，以及对人体产生损害的危险性。3、为亚慢性、慢性毒性试验研究以及其他毒理试验提供接触剂量和观察指标选择的依据。4、为毒理学机制研究提供线索。,三、急性毒性试验的目的,四、急性毒性试验的方法,（一）急性毒性参数1. 皮肤-皮下系数指化学物对同一种系试验动物、相同年龄与性别条件下，经皮肤LD50与皮下注射LD50的比值（皮肤LD50/皮下LD50）。 比值越接近1，化学物经皮肤吸收的危险性越大。,四、急性毒性试验的方法,2. 经口-腹注系数化学物对同种系、同年龄、同性别的实验动物经口LD50与腹注LD50的比值（ 经口LD50/腹注LD50）。比值越接近1，化学物经口吸收越完全。,四、急性毒性试验的方法,3. 急性毒作用带 指毒性上限（以LD50表示）与毒性下限（急性阈值）的比值，即 Zac=LD50/Limac Zac的数值大小反映急性阈剂量距离LD50的宽窄。 该值越大，毒作用带越宽，引起急性中毒死亡的危险性越小。因阈值很难求出，采用累积死亡率的15.9%和84.1%来计算，即LD84/LD16代替之。,（二）急性毒性试验程序包括实验动物、染毒途径、染毒剂量、观察周期、观察指标的选择、计算方法和评价等。一般来说，一个新化学物在研制初期就要进行急性毒性试验。如果急性毒性试验通不过，则后面的所有试验都不必进行了。,四、急性毒性试验的方法,1.试验动物 动物种类：大鼠、小鼠、兔、狗等。选定动物后，首先进行动物检疫，检疫期一般12周，狗应做肠道寄生虫检查或直接驱虫治疗。,四、急性毒性试验的方法：急性毒性试验程序,（1）实验动物的个体选择通常要求刚成年的动物，且为健康未曾交配和受孕的动物。小动物年龄与体重有关，故以体重来表示，体重变异范围小于20%。大鼠180240g、小鼠1825g、家兔22.5kg、豚鼠200250g、狗1015kg。,四、急性毒性试验的方法：急性毒性试验程序,（2）实验动物的性别通常要求为雌雄各半。但如有资料或预试验发现化学物对雌、雄动物毒效应有明显的性别差异，则应单独分别试验并求出雌、雄性动物各自的LD50值。,四、急性毒性试验的方法：急性毒性试验程序,四、急性毒性试验的方法：急性毒性试验程序,（3）试验动物的数量 根据组数和每组数量决定； 不同的LD50计算方法对组数要求不同，一般为46组； 大、小鼠等小动物：每组数量10只，狗等大动物为6只。,（4）给药前禁食处理采用经口途径染毒，在试验给药前应作禁食处理，减少食物的干扰。大鼠在前一天傍晚下班时或晚间将饲料撤掉。小鼠由于其消化吸收和代谢速度较快，可隔夜禁食，也可禁食4h以上。大动物在染毒前不喂食，染毒后继续禁食34h。,四、急性毒性试验的方法：急性毒性试验程序,（5）随机分组 依据统计学原则（随机分组表），进行随机分组； 目的：减少个体间差异对试验结果的干扰，提高每组试验动物间的均衡性。,四、急性毒性试验的方法：急性毒性试验程序,2.染毒剂量选择与剂量分组 了解：化学物的化学结构、纯度、杂质成分、理化性质特别是挥发性、溶解性等。 确定LD50计算公式，再设计剂量分组。如寇氏法、Bliss法，一般设58个剂量组；霍恩氏法设4个剂量组。 计算试验所需受试物的总量，一次备齐全部实验的用量。 应以同一批号为宜。,四、急性毒性试验的方法：急性毒性试验程序,四、急性毒性试验的方法：急性毒性试验程序,一般推荐，染毒最大量：经口20ml/kg（对空腹动物）；经皮2ml/kg（根据体表面积计算，限于染毒的准确性）；静脉1ml/kg（5min以上）；肌内注射0.5ml/kg（一个部位）；鼻：猴或犬每鼻孔0.1ml。,以改良寇氏法经口染毒为例：先查阅文献，找出与受试物的化学结构和理化性质相似的化学物的毒性资料，取其与本试验动物相同品系或物种经口染毒的LD50值作为预试验的估计毒性中值；再以剂量差4倍（其对数值lg4=0.6）设计剂量组，形成35个剂量组。,四、急性毒性试验的方法：急性毒性试验程序,四、急性毒性试验的方法：急性毒性试验程序,四、急性毒性试验的方法：急性毒性试验程序,若待测化学物缺乏相应毒性资料，可参考其他途径染毒资料；若资料全无，可以1mg/kg为最低剂量组（lg1=0）。若经预实验表明，待测化学物致死剂量范围较窄，表5-5的剂量组间距可缩小至1.6倍，即lg1.6=0.2，则剂量范围缩小为15.9100.5mg/kg。当预实验表明化学物毒性很大或很小时，最低组剂量可下调或上调，再依以上原则分组进行再次预实验。,四、急性毒性试验的方法：急性毒性试验程序,通过以上方法找出待测化学物的大致致死剂量范围（从010%至90%100%）后，就可设计正式剂量分组。改良寇氏法最后设立5个剂量组，小鼠每个剂量组10只，雌雄各半。按下式计算剂量分组：,四、急性毒性试验的方法：急性毒性试验程序,若试验动物给予高剂量5g/kg时，仍无明显中毒症状，或虽中毒但没死亡，此时可不再求其LD50，因此时表明化学物毒性不大。预试验也可先以5g/kg剂量为限度剂量进行试探，来决定是否需要正式求LD50。急性毒性试验除设立几个剂量组外，是否设正常和溶剂对照组，根据需要确定。,3.试验期及中毒效应观察急性毒性试验一般是以死亡为主要记录内容。 除此之外还要注意： 中毒体征及发生过程； 死亡情况和时间分布； 体重 病理形态学变化。,四、急性毒性试验的方法：急性毒性试验程序,（1）中毒体征及发生过程应详细观察和记录动物出现的中毒体征、发生时间和体征发展的经过。 如活动增加，骚动、跳跃、呼吸困难、皮肤颜色变化，或者闭目静卧、四肢无力、步态蹒跚、口鼻青紫。B. 机体对毒物作用的反应可以表现出各个系统的特征。,四、急性毒性试验的方法：急性毒性试验程序,（2）死亡情况和时间分布 急性毒性试验中实验动物的死亡数是计算LD50值的依据，动物死亡数量每增加或减少一只都会对LD50值产生明显影响，因此应认真观察和记录。分析中毒死亡时间的分布规律，也可以提供重要信息。,四、急性毒性试验的方法：急性毒性试验程序,（3）体重实验动物体重变化指标，可以反映动物中毒后综合性整体变化，是一个比较客观简便的量化指标。因此在观察实验动物中毒体征的同时，对存活动物应定期多次称量动物的体重变化，一般为每周1次或2次。,四、急性毒性试验的方法：急性毒性试验程序,（4）病理检查 对死亡动物应及时进行大体解剖，肉眼观察大体病理变化，如脏器外观、大小、色泽的变化，有无充血、出血、水肿或其他改变，如有改变须取材作组织病理学检查。对存活动物在观察期结束时亦应进行解剖检查，必要时做组织病理学检查。,四、急性毒性试验的方法：急性毒性试验程序,观察时间和周期高剂量组动物染毒后常在数分钟或数十分钟内出现死亡，染毒以后应即刻开始观察动物的中毒表现和死亡情况。给药当天应连续或多次观察，以后可根据情况，每天2次或多次观察直到试验周期结束。急性毒性试验观察周期一般为7-14天。,四、急性毒性试验的方法：急性毒性试验程序,四、急性毒性试验的方法：急性毒性试验程序,4. LD50的计算（平均法）也称阶梯法、上-下法。不将试验动物分组，先以一个剂量试验，若死亡，则以下一个较小剂量试探；若死亡，则继续下一个较小剂量试探；若出现存活，则再以较大的上一个剂量试探，以此类推。适用：快速发生中毒反应及死亡的化学物。特点：节省试验动物，一般1214只。,四、急性毒性试验的方法：急性毒性试验程序,求解LD50的公式：,LD50求解举例（教材P73）,某化学物给小鼠经口染毒，以10mg/kg剂量试探，预计使用4个剂量组，剂量组距为对数值0.2（即1.58倍），设计使用12只小鼠。结果如下表：,计算过程,这里n=12， xf =(12.59*2)+(10.00*5)+(7.94*4)+(6.31*1) =113.25 (xf)2 = 12 825.56 x2f = (12.592*2)+(10.002*5)+(7.942*4)+(6.312*1) = 1109 nx2f = 13 308 LD50= (xf) /n=113.25/12=9.44 mg/kg S=D/n2*(n-1)1/2=(13308-12825.56)/(144*11) = 0.55即：此化学物小鼠经口LD50=（9.440.55）mg/kg,1、经口（胃肠道）染毒 灌胃 喂饲 吞咽胶囊,三、染毒方法,2、经呼吸道染毒研究生产条件下以气体、蒸气、粉尘、烟、雾等形式存在于车间空气中的工业毒物，评价环境空气污染物，以吸入为给药途径的药物，常常采用经呼吸道染毒的途径。,三、染毒方法,3、经皮肤染毒 经皮肤染毒的方式：先使用化学法脱毛（常用脱毛剂为硫化钡加滑石粉1：4或硫化钠加淀粉1：4）或机械法脱毛（剪剃去毛），将动物脊柱两侧背毛脱去，去毛面积常为体表面积的10。局部涂敷受试物并以玻璃纸覆盖固定一定时间接触染毒。,三、染毒方法,4、经注射途径染毒对注射药品或需作比较毒性观察的药品进行急性毒性试验时，须作经注射途径染毒。注射途径可分为静脉注射或滴注、腹腔注射、肌内注射、皮下注射、皮内注射、椎管内注射等。,三、染毒方法,一、蓄积作用的概念二、蓄积作用的研究方法,第二节 蓄积作用,第二节 蓄积作用,一、蓄积作用的基本概念外源化学物进入机体后，经过代谢转化排出体外，或直接排出体外。但是当其连续地、反复地进入机体，而且吸收速度或总量超过代谢转化排出的速度或总量时，化学物质就有可能在体内逐渐增加并贮留，这种现象称为化学物质的蓄积作用。,第二节 蓄积作用,二、蓄积作用的研究方法试验目的：求出外源化学毒物的蓄积系数，了解蓄积毒性的强弱，并为慢性毒性试验及其他有关毒性试验的剂量选择提供参考。 常用研究方法： 蓄积系数法、生物半减期法。,第二节 蓄积作用：研究方法,（一）蓄积系数法是一种以生物效应为指标，用经验系数（K）评价蓄积作用的方法，即将多次染毒与一次染毒所产生的毒性效应（或死亡）进行比较。蓄积系数：多次染毒使半数动物出现效应（或死亡）的蓄积剂量LD50（n)与一次染毒使半数动物出现相同效应（或死亡）的剂量LD50（1）的比值，即：,第二节 蓄积作用：研究方法,K值越小，表示化学毒物的蓄积性越大。实验动物对化学毒物发生过敏现象，则可能出现K1。随着化学毒物蓄积作用减弱，K值增加，通常认为K5，其蓄积毒性极弱。,1、固定剂量法测定蓄积系数法,实验动物:大、小鼠； 染毒途径：多用经口灌胃或腹腔注射。 具体步骤： 先求出某毒物的LD50，然后选取相同条件的40只（或更多）实验动物，随机分为两组，一为染毒试验组，一为对照组，每组至少20只，雌雄各半。 在1/201/5 LD50的范围内选定一个剂量，每日以固定剂量，定时和相同途径对试验组进行染毒，观察记录动物死亡数。,1、固定剂量法测定蓄积系数法,当试验组累积发生一半动物死亡即可终止试验。 此时，计算累积总接触剂量，根据公式计算K值，然后依上表进行评价。若接触剂量已累积达到5个LD50剂量，也可终止试验，此时计算出K5。 固定剂量法试验期为25100天。,2、定期递增剂量法,试验方案同上，以4天为一期，实验开始时按0.1LD50剂量给予试验组染毒，每期增加1.5倍。第一个四天按0.1LD504天第二个四天按0.15LD504天第三个四天按0.22LD504天依次类推。这一方案试验期最长28天。,2、定期递增剂量法,在试验期间，当化学毒物引起动物累积死亡一半时即可终止试验，计算K值进行评价。一般来说，在试验第21天也可结束试验，因为这之前如果动物没有死亡或死亡数不足一半，说明其累积量已达5.26LD50，即K5。本方法剂量设计方案见表6-6。,二、蓄积作用：研究方法,（二）生物半减期法（t1/2） 是用毒物动力学原理描述化学毒物在机体内的蓄积作用。 化学毒物在体内蓄积的速度和量与机体单位时间内吸收该物质的速度以及清除速度有关。,（二）生物半减期法,tl/2较短的化学物达到蓄积极限所需的时间也短，t1/2长者达到蓄积极限的时间也长。,（二）生物半减期法,一种化学毒物若以tl/2相等的时间间距染毒，其在体内经过6个t1/2的接触期就可以基本上达到蓄积的极限，此时理论蓄积量达到极限的98.4。此后即使继续接触该物质，机体内的蓄积量基本上也不会增加。,一、亚慢性毒性二、慢性毒性作用,第三节 亚慢性、慢性毒性作用,一、亚慢性毒性作用,(一)亚慢性毒性的概念 指人或试验动物连续接触较长时间、较大剂量的外源化学物所出现的中毒效应。 接触时间：介于单次染毒和动物寿命的范围。 较大剂量：大于慢性染毒的低剂量，小于急性毒性剂量。,（二）亚慢性毒性试验的目的1、研究受试物亚慢性毒性剂量-反应（效应），确定（NOAEL)和（LOAEL)，提出安全限量参考值。2、观察受试物亚慢性毒性效应谱、毒作用特点和毒作用靶器官。3、观察受试物亚慢性毒性作用的可逆性。4、为慢性试验的剂量设计和观察指标选择提供依据。5、为在其他试验（急、亚急、其他动物物种的亚慢性试验等）中发现的或未发现的毒作用提供新的信息。,二、亚慢性毒性作用：试验目的,1、实验动物的选择（l）物种和品系物种：啮齿类(大鼠、家兔)，非啮齿类(狗、猴)。 大鼠：常用Wistar和Sprague-Dawley。 犬：多使用Beagle犬。,（三）亚慢性毒性试验设计,（2）性别、年龄和动物数 性别：一般每组雌雄各半； 年龄：大鼠68周龄（体重80100g） 动物数：大鼠、小鼠每组不少于20只； 犬、猴每组不少于6只。,（三）亚慢性毒性试验设计,（3）微生物学寄生虫学等级和饲养环境：实验动物分四级：普通级、清洁级、无特定病原体级（SPF级）、无菌级。犬和猴分为普通级和SPF两级。亚慢性毒性试验，应使用清洁级及以上等级大小鼠，并饲养在屏障环境内进行试验。,（三）亚慢性毒性试验设计,2、染毒途径和染毒期限要求： 尽量选择和人类接触途径相似的方式； 与预期进行的慢性毒作用研究的接触途径相一致。途径：以经口、经呼吸道和经皮染毒为多。 染毒频率：每日一次，连续给予，如试验期为3个月或超过3个月时，也可每周6次。,（三）亚慢性毒性试验设计,3、剂量分组和剂量设计 一般至少应设3个剂量组和1个阴性（溶剂）对照组。高剂量组应能引起明显的毒性或少量动物的死亡（少于10%）。低剂量组应无中毒反应，相当于未观察到有害作用剂量（NOAEL）。高低剂量组间设置1个中剂量组，比较理想的中剂量组约相当于观察到有害作用的最低剂量（LOAEL）。,（三）亚慢性毒性试验设计,高剂量：采用急性毒性的阈剂量，或1/51/20的LD50剂量。 高、中、低剂量组距以35倍为宜，一般不少于2倍。,（三）亚慢性毒性试验设计,4、观察指标 包括：一般性指标和特异性指标。 一般性指标： 指非特异性指标，能综合反应化学物对机体的毒 性反应。 如动物体重、食物利用率、中毒症状、血液学和 生化检查、脏器系数和病理学检查。,（三）亚慢性毒性试验设计,（三）亚慢性毒性试验设计,特异性指标： 指反映化学物对机体毒性作用本质的指标，利 于取得中毒机制的线索。 如：化学物的化学结构、急性或亚急性毒作用 的特征。,（四）亚慢性毒作用评价,评价指标：亚慢性最大无作用剂量（NOAEL）、观察到损害作用的最低剂量（LOAEL）。,二、慢性毒性作用,（一）慢性毒性的概念（chronic toxicity） 指实验动物或