葡萄糖酸氧化杆菌产木糖醇发酵条件优化及关键酶基因的克隆与表达

浙江大学硕士学位论文葡萄糖酸氧化杆菌产木糖醇发酵条件优化及关键酶基因的克隆与表达姓名林燕清申请学位级别硕士专业生物化学与分子生物学指导教师张建国20120309化疾咎谴嫉姆吞跫杏呕覩中克隆得纪亚饷珹基因及木糖醇脱氢酶疞，装液量，接种量诟梅吞跫拢珼木酮糖的产率就L堑牟看锏木糖醇对木糖醇脱氢酶活性有明显的抑制作用。在转化实验中，用事短桥嘌腉转化率低这一难题提供了线索。克隆自的木糖醇脱氢酶与已报道的序列相似性仅为，是一个新的木糖醇脱氢酶基因。酶学性质研究鷈猘瑆，甇瑆甌痬瑀甌瑀痭痳；籇籜感谢潘海峰师兄、宋卫斌师兄和鲍文娜师姐，在我刚开展课题时给予各方面的引导和帮助，使我能快速并顺利的开展课题研究。感谢程永青、王莉、兰翔、李博义对我学习和生活的关心和帮助。感谢杭州宝晶生物公司的工作人员胡海燕、杨丹燕和范娇阳在我科研工作和生活上提供的帮助和支持。感谢两年多来与我朝夕相处的同窗舍友，正因有她们的陪伴，我的研究生生活才如此多姿，与她们共同经历的这段美好回忆，将是我一生的财富。感谢生化所研究生班的同学们在我任职班级团支书期间给予的全力支持和配合。感谢浙江大学生化所其余实验室的老师、学长学姐和同学在这两年多的工作学习中对我的帮助和鼓励。最后，感谢我的父母、男朋友余美琼及其他亲人，感谢你们默默的关心、包力，不辜负你们的期望。林燕清英文缩写词表瓸木糖醇简介全球糖尿病患者约为亿，占总人口的，他们不宜摄入食糖，但又喜生长、不影响体内胰岛素水平】。此外，研究表明，食用木糖醇能增加骨钙水平而有效防止骨质疏松】。在各类糖醇中，木糖醇甜度最高，与蔗糖相当，且能量比蔗糖低；感好，表木糖醇与蔗糖理化性质比较微生物转化法目前，丝状真菌如疞木糖的培养基中疞木糖醇】。真菌中，利用木糖产木糖醇的菌主要是酵母，假丝酵母属鏑，属冒屠辖湍甘如疞，木糖醇转化率，木糖醇的体积细菌可将木糖还原为木糖醇，如脚诤疞木糖产生木糖醇的路径同酵母。年，和提出以葡萄糖为底物产生木糖醇【】。将就L亲D咎谴肌俊捎诟米婕叭治铮肪吨芷诔每偎拷湍甘、德巴利氏酵母属、的葡萄糖培养基中发酵迹珼阿拉伯醇的转化率为【】。一诤的葡萄糖培养基中发酵阿拉伯醇，阿拉伯醇的体积产率达糖为原料生产木糖醇可由两步法实现，即葡萄糖先转化成技癉一阿拉訢阿拉伯醇转化成木糖醇。年，等报道了畂木糖醇涉及两个催化反应即纪亚饷呋疍阿拉伯醇脱毛籜苯又至课痸保等报道的畂阿拉伯醇的培养基中发酵陨辖霾行初步研究。锪浚核淙籊獶阿拉伯醇转化为木糖醇的产率从等对就L遣挠跋臁缘诙阶究翁庖环矫婵疾炝颂荚炊訥】尤新我国甜味剂生产发展和研发方针】食品工业科技，甁，琀细蕴鋘瓵珿，【縈甈，珼甅，甅緽，縀珻現甈猘甁伯醇条件的优化【浚镅縕，珼，【】，篶产木糖醇发酵条件优化前言的培养条件进行初应中，辅酶被还原，第二步反应中，辅酶被氧化。本章的出发点首先，用微生实验材料型高速离心机上海培清科技有限公司型蒸发光散射检测器上海精宏实验设备有限公司上海精宏实验设备有限公司上海精科实业有限公司型电热恒温鼓风干燥箱型漩涡混合器瑞士梅特勒托利多集团上海生工生物技术有限公司北京鼎国生物技术有限公司北京鼎国生物技术有限公司北京鼎国生物技术有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司浙江省建德市莲花化工有限公司国药集团化学试剂有限公司购自中国微生物菌种保藏中心。疞，酵母抽提物疞，碳酸钙疞，琼脂种子培养基甘油疞，酵母抽提物疞，蛋白胨发酵培养基疞，。疞，培养条件，划实验方法转化液或发酵液中的木糖醇、己虳。木酮糖采用高效液相色谱法猵定量】。具体分析方法如下贩治銮按恚喝庋穕“，流动相为魉賚。漂移管的温测活体系、贠和的变化量。培养基对菌生长的影响在不同生长培养基中的增值情况。各温度对菌体生长的影响由于该菌的生长对温度敏感，为了促进菌体生物量的增长，本课题对不同温养基嘌耙毫恐峙嘌露热鲋馗础又至。根据培养由于该菌严格好氧，为了找到适合菌体生长的装液量，对不同装液量条件下菌体生物量的增长情况进行考察，装液量、。接种量门嘌于痬条件下培养根据培养缶旱腛判断最适装液量。、呐嘌械纳榭觯菖嘌痬条件下培养扛鯟浓度三个重复。根据培养皃卸献钍蔆浓度。生长曲线测定涤细胞，并用转化液阿拉伯醇浓度为，于。，于，疞。制，在发酵的前中肌木酮糖及木糖醇的浓度。碳源等因素对菌体生长及转化可能有重要影响，因此对这些因素进行的影响进行舛及。，发酵的发酵培养基中置于发酵舛鸵褐械纳锪考癉木酮糖及寂取渲蟹团嘌蠨阿拉伯醇初始浓度为。每组实验平行重复三次。结果与讨论培养条件优化培养基对菌生长的影响在不同生长培养基中的增值情况。具体在各种生长培养基中的生长情况见图鲁量蔷培养物的酸化将降低菌的转化活性，因此本课题采用培养基魑狦温度对茵体生长的影响本课题考察不同温度条件下菌体生物量的增长情况，结果如图所示。由长最好，且在培养了笈嘌旱膒，酸化程度有限。因此在后续鲞疞，经比较当酵母抽提物为疞时，疞，甘油疞，蛋白胨痳跫屡嘌鳪疞，甘油疞，蛋白胨生长曲线养条件培养畂，历畂的休止细胞进行转化实验；其次，用畂试验的结果如表所示。从表可知，菌体在发酵过程中，以阿拉伯醇为底物产表发酵与休止细胞转化对产木糖醇的影响发酵过程凸拗校，发酵生产木糖醇的过程曲线珼，獂瑇畂挥贕由于隚酶偕虼薌由图可以看出在这整个发酵过程中，分成两个阶段，第一个阶段，菌体獶高木糖醇的产率。因此提高木糖醇的产率和转化效率的一个关键在于找到限制甲狣木酮糖的最适培养通过影响生物膜两侧的氧化还原电位从而影响能量代谢，从而影响菌体较高，综上；为较适合的发酵条件。琷鼍羞谝訢阿拉伯醇为底物进行培养及氧化发酵时，发酵液的迅速酸化，导致菌体生长及发酵反应被抑制，甲狣木酮糖的最适培养温度微生物的生长和产物的形成是一系列化学反应的结果，像其他化学反应一甲狣木酮糖的最适装液量溆嘧榈姆褪奔湮甲狣木酮糖的最适接种量种量为保珼木酮糖的产量、得率及转化效率最高。蛉狈晁嵬亚饷付荒芙腥人嵫吠揪的氢酶的活性有抑制作用。图荚炊訥鶧木酮糖的影响獂转化能力的影响碳源不仅可以作为微生物生长的物质和能量来源，在微生物代谢中也起着重獶木酮糖转化所示，推测包括荚谀诘娜缟纤鎏荚矗訥不同碳源中菌体生长情况、菌破胞液木糖醇脱氢酶活性及细胞转化实验的结甘油、木糖醇支持菌体生长，而乳糖，木糖及果糖对菌的生长有明显的抑制作用。将用各种碳源培养的菌，加入转化，测定转化率图甀所示。在转化实验中，用事短桥嘌腉的转寂嘌腉的转化能力最低，仅为对照的。暑移移锪沁够峨咖小幢童毛垂姜琲小结发酵过程曲线，根据发酵过程曲线，再影响甲狣木酮糖的效率。木糖醇脱氢酶的活性有明显的促进的抑制作用。在转化实验中，用事短桥嘌腉中木糖醇琀琇【縋，甅【啃烨煅簦胫颈螅镉窕醵簦履苎醵訪苏氨酸发酵的影响】微生物学通报，琀琇，一一七中纪亚饷复呋疍阿拉伯醇脱氢快速生成就L牵褼木酮糖的率高，而木糖醇的产率却很低，的阿拉伯醇脱氢酶【】；有来源于细菌的，如，其中酵母来源的阿拉伯醇脱氢酶属于纪亚饷福呋疍一阿拉伯醇脱氢生成送L荹】，而细梢砸訢阿拉伯醇为底物生产木酶属于短链脱氢酶家族，但短链脱氢酶家族各成员间，氨基酸序列相似性很低的来自包括醋酸杆菌在内的细菌的木糖醇脱氢酶则相对较少。中纪亚饷复呋疍醇脱氢酶和木糖醇脱氢酶进行研究。为了该转化路径中的脱氢酶，通过查阅已报道的与本研究所用菌亲缘关系较纯化出重组蛋白，对其酶学性质进行研究。材料敲顾氐腖嘌柿甌，的固体培养基中，倒置培养过夜浚羧粜钥寺贚腖嘌校妫痬。提物疞，甘油疞，蛋白胨、质粒抽提试剂盒阿拉伯醇脱氢酶基因引物设计的纪亚饷富蛐蛄屑袄醋訟虹木糖醇脱氢酶基因引物设计通过的菘饣竦糜隚亲缘关系较近计引物疪現疪。根据拼接所获得的木糖醇脱氢酶编码基因开放性阅读框，籵鯨，；从逑担富撼逡錶“竘，无菌水，总体积为“渲心逦狦注和延伸时问根据情况调整。菌液，在冰上放置痬，离心甅重悬细胞沉淀。或用于直接做转化实验，或存于冰箱。培养基，痬培养坎加诤溴龋吲哚瓺半乳糖苷甤猤，和异丙基硫代吡喃半乳糖苷甌简称腖狝平板上，于生长，部分茵液送上海生工公司测序。和分别带砒，和识别位点訥基因组为尽栋装呱秆竦么鴓甌腅将带有刈橹柿捅泶镏柿腅羧洌又钟，。于盖琼脂糖凝胶电泳检测，肛琹康幕蚰咎谴纪亚饷负蚿连接产物命名为构建木糖醇脱氢酶工程菌用氯化钙介导法将连接产物疎将菌涂布桨澹生长訤疪R锝幸鹇銹验证。痬条件下培养部分菌液送测序。将测序验证没有突变的菌液保存于及进行诱导表达实验。感受态细胞，木糖醇脱氢酶表达条件羧浣又钟培养痬培养罯为，分别加入“罶上样缓冲液，于沸水中煮辉俳酚将带有腅，痬将带有腅将带有腅，痬条件淀两次，再在痬的条件下离心痬的条件下离心镍柱与榘彼岬那缀托源炕渲心咎谴纪亚饷窩端带一个六组氨酸标签。疞洗杂缓冲液疞，疞，觳庠拥鞍紫闯銮榭觯为以下，停止洗杂。渲帽曜嫉鞍字嗜芤海康呐G逖5鞍祝肙谱鞅曜记撸喝绫曜嫉鞍字嗜芤河疞配制成不同的浓度，并测定，以W葑辏曜嫉鞍缀课嶙六个点为疞考马斯亮蓝试剂换乖从逑档某煞郑獂酶活定义一个酶活力单位逦蒷或所对木糖醇脱氢酶酶活性及稳定性的影响的生成量。其中，通过不同的缓冲液调节应条件下进行催化反应，测定残余酶活。不做任何处理的酶液于最适条件下将酶液分别于、。、中保温偃敢杭尤胱钍饰露忍跫路从金属离子对木糖醇脱氢酶酶活性的影响结果与讨论阿拉伯醇脱氢酶基因片段获得阿拉伯醇脱氢酶的基因片段，用碇悄旱缬痉治鯬产物，结果如图基因氢酶的基因片段，用碇悄旱缬痉治鯬产物，结果如图所示，产中的纪亚饷赣隚基因组中克隆因。甲狣木酮糖的转化效率最高。能将伎焖俚难趸蒁木酮糖。的条带，测序及通过根据上述所获得的序列及基因组序列设计引物疪現疪，以蜃槲D澹寺咎谴纪亚饷和说幕蚱危琼脂糖凝胶电泳检测结果如图所示。其中包含木糖图中木糖醇脱氢酶撕端基因片段的电畂霾木糖醇脱氢酶说幕蚱；为引物研咖咎谴纪亚饷端的基因片段电泳图，其中直鹞A礁鼍銹产物的使用鲜鏊竦玫娜鲂蛄薪衅唇樱竦靡桓的开放的开放性阅读框的序列相似性为没虻牡锹己臛行分析，发现本课题从中所获得的木糖醇脱氢酶基因与虻南嗨菩宰罡摺】，为图中木糖醇脱氢酶基因的克隆注珼；瞻锥哉眨，利用引物，以覩从覶图木糖醇脱氢酶基因的核糖体结合位点起始密码子。膞嗨菩晕的琒利用甧痬将木糖醇脱氢酶的氨基酸序列与上述来自短链脱氢酶家族的脱氢酶或还原酶的氨基酸糖醇脱氢酶中也是保守的。其中完全保守的氨基酸有个。七个甘氨酸事雾删赫势争嘲囊脚狪螴籌籗【鯮鶥鵄錝黟多尉一一蝗镺从闢】娅一一一一蹦鵙，埽一图的多重比对中木糖醇脱氢酶与短链脱氢酶家族其他成员痳注瑇醋訥籌醋訪籄醋訥在短链脱氢酶家族中，有三个保守区域在催化过程中与辅酶相互作用的氮新的基因，且所编码的木糖醇脱氢酶属于短链脱氢酶家族。木糖醇脱氢酶重组菌株筛选，并将阳诱导，总蛋白甈慕峁缤所示。从图中可以看出，重组木糖醇脱氢酶的条带在白纯化过程中，发现本课题所获得的木糖醇脱氢酶主要位于细胞质，是可溶性蛋入賏图刈槟咎谴纪亚饷傅腟电泳结果赴呀庖海，的赴呀庖海，经诱对木糖醇脱氢酶酶活性及稳定性的影响糖醇氧化与木酮糖还原的最适分别为痬和活性显著下降。痬氧痬酶的稳定性试验的结果如图荆咎谴纪亚饷冈趐范围理后，其酶活比未进行处理的酶高。本文尚未对此现象进行深入研究。但在缓冲液中的谷氨酸脱氢酶，在条件下所测得的活性高五倍，这种现象被称为激活钝化平衡现象。研究人员对于这种现象的解释是谷氨酸脱氢酶在响酶活发生激活钝化平衡现象。唬对木糖对木糖醇脱氢酶稳定性的影响还原活性痬图露榷阅咎谴纪亚饷富钚缘挠跋乖睢生痬木糖醇脱氢酶的温度稳定性试验结果如图荆咎谴纪亚饷冈保温螅洳杏嗟幕乖盍源锏阶罡呋盍均，残余的氧化活力达。说明该酶的还原活性具有良好的温度稳定性。乖钚痬金属离子对木糖醇脱氢酶酶活性的影响底物专一性及酶学参数测定和分别为能将话伎焖俚难趸蒁木酮糖。被嵝蛄邢嗨菩晕】，而来自的，所编码。最高活性为获得的纪亚饷肝狽依赖型脱由于缺乏糖酵解途径和三羧酸循环途径及的代谢特点导致产生的很有限，从而导致该路径中的两步反应在速率及产率的差异，也是木糖醇产率低的原因之一。猘，珻猘【縃琖，川，【甋【縃琒琒，【緾甌，猟緾，縍琓，緾，甅琀琇，琓，琖，【】琍琄，【】，。【】，篋】【】，琄，结论痬，就L亲蚀，其发酵条件为疞，酵母抽提物疞，装液量，接种量，发酵时賋五、克隆自木糖醇脱氢酶与已报道的序列相似性仅为。是一个新的木糖醇脱氢酶基因。酶学性质研究