激光扫描共聚焦显微镜技术讲座

激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜LASERSCANNINGCONFOCALMICROSCOPELSCM采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上，使用紫外或可见光激发荧光探针，采用共轭聚焦原理和装置，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套集观察、分析和输出为一体系统。它把光学成像的分辨率提高了3040，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。LSCM的发展的发展1957年年提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，并获提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，并获得了美国的专利。得了美国的专利。1967年年成功的应用共聚焦显微镜产生了一个光学横面。成功的应用共聚焦显微镜产生了一个光学横面。1970年年牛津和阿姆斯特丹同时向科学界推荐了一种新型牛津和阿姆斯特丹同时向科学界推荐了一种新型的扫描共聚焦显微镜。的扫描共聚焦显微镜。1984年年BIORAD公司推出了世界第一台共聚焦显微镜品。公司推出了世界第一台共聚焦显微镜品。1987年年WHITE和和AMOS在英国在英国自然自然杂志发表了杂志发表了“共聚焦共聚焦显微镜时代的到来显微镜时代的到来”一文，标志着一文，标志着LSCM已成为进行已成为进行科学研究的重要工具。科学研究的重要工具。随后随后ZEISS、LEICA、MERIDIAN等多家公司相继开发出不同型等多家公司相继开发出不同型号的共聚焦显微镜。随着技术的不断发展和完善，产品号的共聚焦显微镜。随着技术的不断发展和完善，产品的性能也不断改进和更新，应用的范围也越来越广泛。的性能也不断改进和更新，应用的范围也越来越广泛。HIPPOCAMPUSNEURONSEXPRESSINGGFPLSCM与普通荧光显微镜的图像质量比较与普通荧光显微镜的图像质量比较荧光显微镜LSCM显微镜成像清晰度的决定因素1分辨率2球差3色差1、分辨率指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力,通常是用显微镜所能分辨清楚最近的相邻两点间的距离来表示。人眼及各类显微镜的分辨率人眼及各类显微镜的分辨率人眼分辨率人眼分辨率020MM光学显微镜分辨率光学显微镜分辨率025MM共焦显微镜分辨率共焦显微镜分辨率018MM电子显微镜分辨率电子显微镜分辨率020NM2、球差由主轴上某一物点向光学系统发出的单色圆锥形光束，经该光学系列折射后，不能聚焦成一点,使成像模糊不清,形成一弥散光斑俗称模糊圈，则此光学系统的成像误差称为球差。3、色差由白色物点向光学系统发出一束白光，经该光学系列折射后，组成该束白光的红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各色光，不能会聚于同一点，即白色物点不能结成白色像点，而结成一彩色像斑的成像误差，称为色差。LSCM的重要组件的重要组件激光光源激光光源自动显微镜自动显微镜扫描模块（包括共聚焦光路通道和针孔扫描模块（包括共聚焦光路通道和针孔、扫描镜、检测器）、扫描镜、检测器）数字信号处理器数字信号处理器计算机以及图象输出设备（显示器、彩计算机以及图象输出设备（显示器、彩色打印机）等。色打印机）等。激光器激光器显微镜物镜显微镜物镜载物台载物台计算机系统图像分析与控制系统计算机系统图像分析与控制系统激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜VS荧光显微镜荧光显微镜激光扫描共聚焦显微镜荧光显微镜激光扫描共聚焦显微镜中常见的激光器激光器激光器AR激光器458NM,476NM,488NM,514NMHENE543NM,633NM固体激光器UV405NM激光器的特点1方向性好激光基本延直线传播2单色性好108NM3高亮度激光方向性好,其在空间上的能量分布是高度集中的。4偏振性激光为平面偏振光,光纤耦合显微镜显微镜LEICADMIRBE倒置荧光显微镜物镜物镜LSCM物镜的重要参数NA数值孔径又叫做镜口率，简写为NA。是物镜的主要技术参数，是判断物镜性能高低的重要标志。NANSINA/2N物体与物镜间媒质的折射率A2物镜孔径角的一半溴萘折射率166，香柏油1515，玻璃152，水的为13，空气为1。香柏油与玻璃折射率相似，故光折射少，透光率高，成像清楚。NA越大放大倍数越大，分辨率越高，NA越大视场宽度与工作距离越小MAGNIFICATIONNUMERICALAPERTUREWORKINGDISTANCEMMACHROMATCORRECTION4X010300010X02561020X04021040X06506560X080030100XOIL1250184X20X10X40X60X100X载物台载物台计算机系统计算机系统图像分析与控制系统图像分析与控制系统分析软件控制软件N激光共聚焦显微镜原理激光共聚焦显微镜原理图1共聚焦显微镜简化原理图用于激发荧光的激光束LASER透过入射小孔LIGHTSOURCEPINHOLE被二向色镜DICHROICMIRROR反射，通过显微物镜OBJECTIVELENS汇聚后入射于待观察的标本SPECIMEN内部焦点FOCALPOINT处。激光照射所产生的荧光FLUORESCENCELIGHT和少量反射激光一起，被物镜重新收集后送往二向色镜。其中携带图像信息的荧光由于波长比较长，直接通过二向色镜并透过出射小孔DETECTIONPINHOLE到达光电探测器DETECTOR（通常是光电倍增管（PMT）或是雪崩光电二极管（APD），变成电信号后送入计算机。而由于二向色镜的分光作用，残余的激光则被二向色镜反射，不会被探测到。共轭图图2探测针孔的作用示意图（解释了出射小孔所起到的作用探测针孔的作用示意图（解释了出射小孔所起到的作用）只有焦平面上的点所发出的光才能透过出射小孔；焦平面只有焦平面上的点所发出的光才能透过出射小孔；焦平面以外的点所发出的光线在出射小孔平面是离焦的，绝大部以外的点所发出的光线在出射小孔平面是离焦的，绝大部分无法通过中心的小孔。因此，焦平面上的观察目标点呈分无法通过中心的小孔。因此，焦平面上的观察目标点呈现亮色，而非观察点则作为背景呈现黑色，反差增加，图现亮色，而非观察点则作为背景呈现黑色，反差增加，图像清晰。在成像过程中，出射小孔的位置始终与显微物镜像清晰。在成像过程中，出射小孔的位置始终与显微物镜的焦点的焦点FOCALPOINT是一一对应的关系（共轭是一一对应的关系（共轭CONJUGATE）,因因而被称为共聚焦（而被称为共聚焦（CONFOCAL）显微技术。）显微技术。普通光学显微镜与激光共聚焦显微镜的区别LSCM扫描图像方式扫描图像方式N单一光学切片扫描单一光学切片扫描SINGLEOPTICALSECTION,XYN时程活细胞扫描时程活细胞扫描TIMELAPSELIVECELLIMAGING,XYTN三维扫描及重构三维扫描及重构3DRECONSTRUCTION,XYZN四维扫描四维扫描4DIMAGING,XYZTZXYXY平面单一光学切片扫描单一光学切片扫描SINGLEOPTICALSECTION,XYOPTICALSECTIONSCOLLECTEDSIMULTANEOUSLYATTHREEDIFFERENTEXCITATIONWAVELENGTHS488,568,AND647NANOMETERSTHESPECIMENISTHEFRUITFLYTHIRDINSTARWINGIMAGINALDISKXYXY平面时程活细胞扫描时程活细胞扫描TIMELAPSELIVECELLIMAGING,XYTXYXY平面TIMETIMELAPSEIMAGINGOFALIVINGFRUITFLYEMBRYOINJECTEDWITHCALCIUMGREENISPRESENTEDINFIGURE2THESERIESOFIMAGESSHOWSTHECHANGEINDISTRIBUTIONOFTHEFLUORESCENTPROBEOVERTIME0S10S20S30S三维扫描及重构三维扫描及重构3DRECONSTRUCTION,XYZPERIPHERALNERVOUSSYSTEMOFAFRUITFLYEMBRYOZXYXY平面三维扫描及重构三维扫描及重构3DRECONSTRUCTION,XYZ一种高分辨率的显微成像技术一种高分辨率的显微成像技术1用激光做光源，激光单色性好，光源波长相同，用激光做光源，激光单色性好，光源波长相同，从根本上消除了色差。从根本上消除了色差。2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个带采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个带有小孔的挡板，将焦平面以外的杂散光挡住，消有小孔的挡板，将焦平面以外的杂散光挡住，消除了球差，并进一步消除了色差。显微图象的清除了球差，并进一步消除了色差。显微图象的清晰度和细节分辨能力。晰度和细节分辨能力。3采用点扫描技术将样品分成无数个点，用十分细采用点扫描技术将样品分成无数个点，用十分细小的激光束逐点逐行扫描成像，再通过电脑组合小的激光束逐点逐行扫描成像，再通过电脑组合成一个整体。传统的光镜在场光源下一次成像，成一个整体。传统的光镜在场光源下一次成像，标本上每一点都会受到相邻点的衍射光和散射光标本上每一点都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无法相的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。比的。4用计算机采集和处理光信号，并利用光电倍用计算机采集和处理光信号，并利用光电倍增管放大信号，它代替了人眼和照相机进增管放大信号，它代替了人眼和照相机进行观察，摄像，得到的图像是数字化的，行观察，摄像，得到的图像是数字化的，可以在电脑中进行处理，进一步提高图像可以在电脑中进行处理，进一步提高图像的清晰度。的清晰度。5观察活细胞、活组织在不损伤细胞的前提下,对活组织、活细胞进行观察和测量，这不仅省去了繁琐的样品前期处理过程如脱水、脱蜡、染色等而且观察过的样品还可以继续用于其他的研究。这种功能对于细胞培养、转基因研究尤为重要。这可以说是最大的优势。6生化成分精确定位观察配合专用的分子探针,对于要检测的成分不仅可以定位到细胞水平,还可以定位到亚细胞水平和分子水平。7动态观察在同一样品平面上随时间进行连续扫描,就可分析细胞结构、内含、和标记等动力学变化。目前在这方面做得最多的是使用观察心肌或平滑肌细胞内游离钙、钠、钾离子浓度或的动态变化。8定量测量首先应用专一的荧光探针对样品进行染色,样品的荧光强度和所测成分的含量呈正比,如果其余条件固定,通过对比各组样品之间的荧光强度值,可得出特定成分的含量比。应用范围应用范围细胞生物学细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动细胞生物学细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器结构和分布变化性、受体、细胞器结构和分布变化生物化学酶、核酸、生物化学酶、核酸、FISH（荧光原位杂交）、受体分析（荧光原位杂交）、受体分析药理学药物对细胞的作用及其动力学药理学药物对细胞的作用及其动力学生理学膜受体、离子通道、细胞内离子含量、分布生理学膜受体、离子通道、细胞内离子含量、分布动态神经生物学神经细胞结构、神经递质的成分、运输动态神经生物学神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递、递质受体、离子内外流、神经组织结构、细胞和传递、递质受体、离子内外流、神经组织结构、细胞分布分布微生物学和寄生虫学细菌、寄生虫形态结构微生物学和寄生虫学细菌、寄生虫形态结构病理学及临床应用活检标本诊断、肿瘤诊断、自身免疫病理学及临床应用活检标本诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病诊断、性疾病诊断、HIV等等遗传学和组胚学细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三遗传学和组胚学细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结构、染色体分析、基因表达、基因诊断维结构、染色体分析、基因表达、基因诊断LSCM在生物学上的应用在生物学上的应用N荧光组织化学荧光组织化学N动态荧光测量动态荧光测量细胞内钙测量、细胞内细胞内钙测量、细胞内PH测测量、细胞膜流动性测量、膜电位测定量、细胞膜流动性测量、膜电位测定N细胞间隙连接的细胞间通讯细胞间隙连接的细胞间通讯荧光探针的选择荧光探针的选择合适的荧光探针是有效地进行实验并获取理想实验结果的保障。1现有仪器所采用的激光器2荧光探针的光稳定性和光漂白性3荧光的定性或定量定性单波长激发探针定量双波长激发比率探针4荧光探针的特异性和毒性。5荧光探针适用的PH不同的荧光探针在不同标本的效果常有差异，故除综合考虑以上因素以外，有条件者应进行染料的筛选，以找出最适的荧光探针。许多荧光探针是疏水性的，很难或不能进入细胞，需使荧光探针与AM（乙酰羟甲基酯）结合后变成不带电荷的亲脂性化合物方易于通过质膜进入细胞，在细胞内荧光探针上的AM被非特异性酯酶水解，去掉AM后的荧光探针不仅可与细胞内的靶结构或靶分子结合且不易透出质膜，从而能有效的发挥作用。常见应用及其荧光探针常见应用及其荧光探针1细胞内游离钙细胞内游离钙共聚焦激光扫描显微镜常用的有共聚焦激光扫描显微镜常用的有FLUO3、FLUO4、RHOD1、RHOD2、INDO1、FURA2等等，前四者为单波长荧光探针，利用其单波长激，前四者为单波长荧光探针，利用其单波长激发特点可直接测量细胞内发特点可直接测量细胞内CA2动态变化，为钙动态变化，为钙定性探针；后两者为双波长激发探针，利用其定性探针；后两者为双波长激发探针，利用其双波长激发特点和比率技术，能定量细胞内钙双波长激发特点和比率技术，能定量细胞内钙，为钙定量探针。，为钙定量探针。FURA2激发峰为激发峰为340/380NM，发射波长在，发射波长在505520NM之之间。间。FURA2可以和钙离子结合，结合钙离子后在可以和钙离子结合，结合钙离子后在330350NM激发光下可以产生较强的荧光，而在激发光下可以产生较强的荧光，而在380NM激发激发光下则会导致荧光减弱。这样就可以使用光下则会导致荧光减弱。这样就可以使用340NM和和380NM这两个荧光的比值来检测细胞内的钙离子浓度，这两个荧光的比值来检测细胞内的钙离子浓度，可以消除不同细胞样品间荧光探针装载效率的差异，荧可以消除不同细胞样品间荧光探针装载效率的差异，荧光探针的渗漏，细胞厚度差异等一些误差因素。光探针的渗漏，细胞厚度差异等一些误差因素。2DNA和和RNA核酸的荧光探针核酸的荧光探针AO吖啶橙吖啶橙与与DNA结合，发射波长结合，发射波长525NM，显，显绿色绿色与与RNA结合，发射波长结合，发射波长650NM，显红色。，显红色。PI既可标记既可标记DNA又可标记又可标记RNA，如为获得单独，如为获得单独的的DNA或或RNA分布，染色前可用分布，染色前可用RNA酶或酶或DNA酶处理细胞。酶处理细胞。PI不能进入完整的细胞膜，故不能不能进入完整的细胞膜，故不能标记活细胞内的标记活细胞内的DNA和和RNA。DAPI与双链与双链DNA结合荧光增强结合荧光增强20倍，与单链倍，与单链DNA结合无荧光增强。荧光强度比结合无荧光增强。荧光强度比HOECHST低，低，光稳定性强于光稳定性强于HOECHST。3膜电位膜电位共聚焦激光扫描显微镜则可利用荧光探针在共聚焦激光扫描显微镜则可利用荧光探针在细胞膜内外分布的差异测出膜电位，不但可以观细胞膜内外分布的差异测出膜电位，不但可以观察细胞膜电位的变化结果，更重要的是可以用于察细胞膜电位的变化结果，更重要的是可以用于连续监测膜电位的迅速变化。连续监测膜电位的迅速变化。DIBAC43带负电荷慢反应染料。本身无荧光带负电荷慢反应染料。本身无荧光，当进入细胞与胞浆内的蛋白质结合后才发出荧，当进入细胞与胞浆内的蛋白质结合后才发出荧光，测量时要求细胞浸在荧光染料中。当细胞内光，测量时要求细胞浸在荧光染料中。当细胞内荧光强度增加即膜电位；反之，即膜电位降低。荧光强度增加即膜电位；反之，即膜电位降低。RHODAMINE123主要用于线粒体膜电位测量。主要用于线粒体膜电位测量。是一种亲脂性阳离子荧光探针，当线粒体膜内侧是一种亲脂性阳离子荧光探针，当线粒体膜内侧负电荷增多时，荧光强度增加，与负电荷增多时，荧光强度增加，与DIBAC43的的表示形式相反。表示形式相反。4细胞内活性氧基细胞内活性氧基活性氧活性氧ACTIVEOXYGENSPECIES可影响细胞代可影响细胞代谢，与蛋白质、核酸、脂类等发生反应，有些反谢，与蛋白质、核酸、脂类等发生反应，有些反应是有害的，因此测量活性氧在毒理学研究中有应是有害的，因此测量活性氧在毒理学研究中有一定的意义。常用荧光探针有一定的意义。常用荧光探针有DICHLORODIHYDROFLUORESCEINDIACETATE2，7二氯二氯二氢荧光素乙酰乙酸、二氢荧光素乙酰乙酸、H2DCFDA，其原理是不，其原理是不发荧光的发荧光的H2DCFDA进入细胞后能被存在的过氧进入细胞后能被存在的过氧化物、过氧化氢等氧化分解为二氯荧光黄（化物、过氧化氢等氧化分解为二氯荧光黄（DICHLOROFLUORESCEIN，DCF而产生荧光。而产生荧光。5细胞间通讯细胞间通讯荧光光漂白恢复荧光光漂白恢复FLUORESCENCERECOVERYAFTERPHOTOBLEADING，FRAP技术可用于检测细胞缝隙技术可用于检测细胞缝隙连接通讯。该方法的原理是一个细胞内的荧光分连接通讯。该方法的原理是一个细胞内的荧光分子被激光漂白或淬灭，失去发光能力。而临近未子被激光漂白或淬灭，失去发光能力。而临近未被漂白细胞中的荧光分子可通过缝隙连接扩散到被漂白细胞中的荧光分子可通过缝隙连接扩散到已被漂白的细胞中，荧光可以逐渐恢复。由于光已被漂白的细胞中，荧光可以逐渐恢复。由于光漂白过程是不可逆的，因此可通过观察已发生荧漂白过程是不可逆的，因此可通过观察已发生荧光漂白细胞其荧光恢复过程的变化量来判断细胞光漂白细胞其荧光恢复过程的变化量来判断细胞缝隙连接的通讯功能。缝隙连接的通讯功能。6细胞膜流动性细胞膜流动性荧光光漂白恢复荧光光漂白恢复FRAP技术。利用技术。利用NBDC6HPC标记膜磷脂，然后用高强度的激光束照标记膜磷脂，然后用高强度的激光束照射活细胞膜表面的某一区域射活细胞膜表面的某一区域12M，使该区域，使该区域的荧光淬灭或漂白，再用较弱的激光束照射该区的荧光淬灭或漂白，再用较弱的激光束照射该区域。可检测到细胞膜上其他地方未被漂白的荧光域。可检测到细胞膜上其他地方未被漂白的荧光探针流动到漂白区域时的荧光重新分布情况。荧探针流动到漂白区域时的荧光重新分布情况。荧光恢复的速率和程度可提供有关的信息。光恢复的速率和程度可提供有关的信息。7细胞亚微结构细胞亚微结构细胞器探针）细胞器探针）共聚焦激光扫描显微镜可获得较高分辨共聚焦激光扫描显微镜可获得较高分辨率的细胞内率的细胞内线粒体、高尔基复合体、内质网、线粒体、高尔基复合体、内质网、溶酶体等细胞器图像溶酶体等细胞器图像，同时还可动态观察活细，同时还可动态观察活细胞状态下细胞器的形态学变化情况，此外还可胞状态下细胞器的形态学变化情况，此外还可通过光学切片即断层扫描技术进行三维重建，通过光学切片即断层扫描技术进行三维重建，显示细胞器的空间关系及其变化。适用于线粒显示细胞器的空间关系及其变化。适用于线粒体的荧光探针较多，如体的荧光探针较多，如MITOTRACKER、DASPMI、DASPEI、JC1、罗丹明、罗丹明123等。高尔基复等。高尔基复合体常用的荧光探针有合体常用的荧光探针有NBD酰基鞘氨醇（酰基鞘氨醇（CERAMIDE）、）、BODIPY酰基鞘氨醇。内质网主酰基鞘氨醇。内质网主要用要用DIL、DIOC63。溶酶体的荧光探针有。溶酶体的荧光探针有DAMP、NEUTRALRED。8PH值值正常细胞胞浆内的正常细胞胞浆内的PH一般在一般在6874的范的范围，而某些细胞器如溶酶体的围，而某些细胞器如溶酶体的PH则在则在4560之之间。根据检测对象间。根据检测对象PH的不同将荧光探针分为用的不同将荧光探针分为用于偏中性和酸性两类。常用于偏中性于偏中性和酸性两类。常用于偏中性PH即细胞即细胞胞浆胞浆PH检测的荧光探针有检测的荧光探针有SNARF类类SNARF1、SNARFCALCEIN、SNAFL类类SNAFL1、SNAFLCALCEIN、BCECF等，这些探针均为疏水性探针等，这些探针均为疏水性探针，须使用其，须使用其AM形式。形式。FITCDEXTRAN则适用于则适用于PH范围范围46之间，如溶酶体之间，如溶酶体PH的检测，该探针也的检测，该探针也不能透过质膜，但可通过细胞胞饮作用进入溶酶不能透过质膜，但可通过细胞胞饮作用进入溶酶体，因此应选择分子量稍小的体，因此应选择分子量稍小的DEXTRAN葡聚糖葡聚糖。9标记抗体、配体等常用的荧光探针标记抗体、配体等常用的荧光探针共聚焦激共聚焦激光扫描显微镜不仅可用免疫荧光分析固定的细胞光扫描显微镜不仅可用免疫荧光分析固定的细胞或组织切片，还可用于分析活细胞，得到特异性或组织切片，还可用于分析活细胞，得到特异性抗体或其他荧光免疫探针识别靶分子的表达、定抗体或其他荧光免疫探针识别靶分子的表达、定位、分布变化等信息。位、分布变化等信息。10F肌动蛋白荧