[硕士论文精品]稻曲病菌的分离及其多样性分析

浙江大学硕士学位论文1致谢本论文是在胡东维老师的精心指导下完成的。实验设计、技术指导、论文写作，无不凝聚着胡老师的心血。胡老师学识渊博，思维开阔，让学生领略科学之魅力；作风严谨，一丝不苟，让学生明白成事之不易；德操高尚，率先垂范，让学生感悟为人之至理；平易近人，虚怀若谷，让学生培养创新之习气。这些都给我的学习与成长营造了良好的环境，也使我收获颇多。每当回悟三年的研究生生活时，我总有一份厚重之感。我深深地感谢我的导师胡东维老师我还要感谢课程学习阶段的任课教师们。他们的课程精心准备、内容丰富；他们的思维新颖前沿，见解犀利深刻。听他们讲课时，总使我感到一种方家的大气、一种开拓者的勇气。他们的这些气质一直激励着我开拓进取、奋勇前行。感谢生物技术研究所的各位同学。困难时，和他们一起交流可以增进知识，收获灵感。休闲时，和他们一起活动可以增进感情，收获快乐。他们各有特点各有特长，每个人就像一本书，可以让人去品位去感悟去收获。感谢我亲爱的父母。年龄愈长，愈明白世事艰难，对父母操持家务之不易，感受愈加真切。由是，对父母的爱也就多了一份深沉。感谢我的家人和朋友。在多年的学生和生活中，他们给了我极大的鼓励和支持。这些感谢我要埋在心底，时时去感受。感受他们的亲情，感受他们的无私，感受他们的快乐。王永强2009年12月4日浙江大学硕士学位论文2目录致谢1摘要4ABSTRACT6第一部分文献综述9第一章稻曲病研究进展911稻曲病的田间症状912稻曲病的危害10121稻曲病对水稻产量的危害10122稻曲病对水稻品质的影响1013稻曲病菌的生物学特性1114稻曲病的侵染循环12141稻曲病的侵染源12142稻曲病的侵染时期和侵染途径12143稻曲病的田间寄主1315稻曲病人工接种1416稻曲病发病条件14161气象条件14162品种抗性15163栽培条件1517稻曲病的防治16第二章RDNAITS和RDNAIGS在真菌研究中的应用1821真菌RDNA的结构特点1822RDNAITS和RDNAIGS的常用引物1923RDNAITS和RDNAIGS在真菌研究中的应用20第二部分实验部分21第三章稻曲病菌分离方法的比较研究2131材料与方法21311稻曲球的采集与保存21312分离培养方法21313消毒对厚垣孢子萌发的影响22314扫描电子显微镜样品制备与观察2232结果与分析23321利用不同成熟度稻曲球厚垣孢子分离稻曲病菌23322保存时间对厚垣孢子萌发的影响23323利用不同成熟度稻曲球内层菌丝组织分离稻曲病菌24324利用稻曲球菌核分离稻曲病菌2433讨论25第四章稻曲病菌无性孢子形成过程及厚垣孢子萌发率测定2741材料和方法27411稻曲病菌及其培养27412扫描电子显微镜样品制备与观察27413厚垣孢子萌发试验28浙江大学硕士学位论文342结果与分析28421稻曲病菌无性孢子的形成28422厚垣孢子萌发试验3143讨论31第五章中国不同地理来源稻曲病菌RDNAITS的分析3351材料与方法33511供试菌系33512DNA的提取33513RDNAITS区扩增和序列测定33513RDNAITS序列的比较分析3452结果与分析35521RDNAITS序列分析3553讨论35第六章中国不同地理来源稻曲病菌RDNAIGS的初步分析3761材料和方法37611供试菌株37612DNA的提取38613稻曲病菌RDNAIGS区引物的设计与扩增38614稻曲病菌RDNAIGS区的扩增38615稻曲病菌RDNAIGS扩增产物的回收、克隆、测序及序列分析3862结果与分析39621稻曲病菌RDNAIGS的扩增结果39622稻曲病菌RDNAIGS的序列结构3963讨论41第七章中国不同地理来源稻曲病菌RDNAIGS长度多态性分析4271材料方法4272结果分析43721稻曲病菌RDNAIGS区长度多态性电泳检测结果43721稻曲病菌RDNAIGS区长度多态性的序列分析4473讨论45参考文献46附录1试剂配方51附录2实验方法55硕士期间发表的论文60浙江大学硕士学位论文4摘要稻曲病是一种水稻穗部病害，由稻曲病菌USTILAGINODEAVIRENSCOOKETAKAHASHI在水稻穗部为害产生稻曲球，是一种世界性水稻真菌病害。稻曲病过去仅在中晚稻田零星发生，20世纪80年代以来，随着直立型和密穗型高产水稻品种大力推广及农田肥力的提高，稻曲病的发生日益严重，它不仅影响稻米的产量和品质，而且产生的稻曲病菌毒素，对人和动植物都有毒性，目前已经成为水稻产区的主要病害之一。一般认为厚垣孢子是稻曲病主要的初侵染源，在水稻开花前后从穗部进行侵染；但也有人猜测稻曲病是系统侵染病害。长期以来，由于稻曲病菌的人工接种成功率极其低下，从而制约了稻曲病菌的侵染途径与发育方式的研究。一个行之有效的接种方法一直是稻曲病研究的瓶颈问题。本研究主要包括4个方面1稻曲病菌分离方法的比较研究。2稻曲病菌无性孢子形成过程及厚垣孢子萌发率测定。3中国不同地理来源稻曲病菌RDNAITS的分析。4中国不同地理来源稻曲病菌RDNAIGS的分析。1本文对不同情况下稻曲病菌的分离方法进行了比较研究。结果表明成熟早期稻曲球上的绝大多数新鲜的厚垣孢子具有萌发能力，及时进行分离培养是病原菌成功分离的关键。随保存时间的延长，厚垣孢子萌发能力急剧下降；消毒处理可杀死大部分的厚垣孢子。菌核可长期保存并保持极高的萌发生长能力，是稻曲病菌分离最为理想的材料。稻曲球中部的致密菌丝组织分离难度较大，只能作为稻曲病菌分离的一种补救方法。2分离得到的稻曲病菌在PSA培养基上26黑暗条件下人工培养，在不同培养时期的菌落上取样，进行扫描电镜观察。结果发现，在培养的第7天，菌落表面上部分菌丝开始纠结，形成初期的集结状菌丝结构；第14天，集结状菌丝结构体积增大，数量增多，其上开始产生大量分生孢子；一些分散的菌丝上也可产生少量的分生孢子。第21天，菌落表面产生黄色子实体，子实体的外层是一层菌丝，内部集生大量厚垣孢子。第30天，黄色子实体体积进一步增大，数量浙江大学硕士学位论文5增多，早期形成的子实体开始成熟，并从顶端或一侧破裂，散出厚垣孢子。厚垣孢子形成后，随着保存时间的延长，萌发率急剧下降。3利用ITS4、ITS5扩增稻曲病菌的RDNAITS片段，扩增产物的电泳条带为650BP左右。测序分析结果表明，我国不同地区35个菌系的RDNAITS序列完全一致，即同源性为100。这说明我国不同生态区的稻曲病菌具有高度同源性，其ITS具有高度保守性。将获得序列与GENBANK中的RDNAITS序列进行比对，结果表明，这些序列和GENBANK中的AB116645、AB105954同源性为100。这说明我国的稻曲病菌和日本的稻曲病菌也具有高度同源性。4设计了用于扩增稻曲病菌RDNAIGS区全长的引物UIGSI和UIGSII。利用引物UIGSI和UIGSII对部分稻曲病菌菌系的RDNAIGS区进行扩增，然后克隆、测序。序列分析结果表明，稻曲病菌的RDNAIGS区包括中间易变区和两边的保守区。这些菌系两边的保守区序列相似值达到9944。中间的易变区含有一个77BP的重复单元，重复单元重复次数的不同导致了不同菌系具有不同的长度多态性。为了更直观的检测RDNAIGS的长度多态性，我们设计了针对其中间易变区的PCR扩增引物UIGS和UIGS，能够更清楚的显示不同菌株RDNAIGS的长度多态性。利用引物UIGS和UIGS对35个稻曲病菌菌系进行了多态性检测，共检测到4中多态性类型。具有长度多态性的菌系比例较低，这进一步证明了稻曲病菌遗传稳定和一致性。多态性类型和菌系的地理来源没有明显关系。但不同地理来源的菌系变异比例有很大不同，这需要更多的稻曲病菌系进一步证明。浙江大学硕士学位论文6ABSTRACTRICEFALSESMUTISAWORLDWIDEFUNGALDISEASEINRICECAUSEDBYUSTILAGINODEAVIRENSCOOKETAK,WHICHHARMEDTHEPANICLESOFRICEANDPRODUCEDRICEFASLEBALLSITWASALLALONGIGNOREDBEFORE1980SBECAUSEOFITSOCCASIONALLYHAPPENINGONTHEMIDDLEANDLATERRIPEDRICESINCE1980S,HOWEVER,WITHTHECHANGEOFRICECULTIVARSANDINCREASINGOFFERTILIZATIONINTHEPADDYFIELD,RICEFALSESMUTINCHINAHASBEINGMOREANDMORESERIOUS,WHICHNOTONLYINFLUENCESGREATLYONTHEYIELDANDQUALITYOFRICE,BUTUSTILOXINSALSOCAUSEPOISONINGTOHUMANANDANIMALSUPTONOW,THEDISEASEHASBECOMEONEOFTHEMAJORRICEDISEASESINALLTHEMAJORRICEPRODUCTIONAREASINCHINAITISPRESUMEDTHATCHLAMYDOSPOREMAYBETHEMAJORPRIMARYINFECTIONSOURCEOFRICEFALSESMUTANDBEGINTOINFECTTHEPANICLESOFRICEBEFOREORAFTERFLORESCENCEBUTITISALSOSUPPOSED,HOWEVER,THATTHEDISEASEISOFSYSTEMATICINFECTIONBECAUSESUCCESSFULINFECTIONRATEBYARTIFICALINOCULATIONWASVERYLOW,ITISDIFFICULTTOEXAMINETHEINFECTIONPROCESSANDGROWTHMODEOFPATHOGENINPLANTAHIGHEFFECTIVEINOCULATIONMETHODBECOMESTHEBOTTLENECKFORTHERESEARCHONTHISDISEASETHISSTUDYCONSISTSOF4POINTS1COMPARISONOFISOLATIONMETHODSFORUSTILAGINOIDEAVIRENS,THEPATHOGENOFRICEFALSESMUT2THEPROGRESSOFASEXUALSPOREFORMATIONOFUSTILAGINOIDEAVIRENSANDEXAMINATIONONGERMINATIONOFCHLAMYDOSPORE3ANALYSISOFRDNAITSOFUSTILAGINOIDEAVIRENSISOLATESFROMDIFFERENTGEOGRAPHICALREGIONSINCHINA4PRELIMINARYANALYSISOFRDNAIGSOFUSTILAGINOIDEAVIRENSISOLATESFROMDIFFERENTGEOGRAPHICALREGIONSINCHINA1USTILAGINOIDEAVIRENS,THEPATHOGENOFRICEFALSESMUT,WASISOLATEDFROMVARIOUSDISEASEDSAMPLESTHECOMPARISONOFISOLATIONMETHODSSHOWEDTHATMOSTFRESHCHLAMYDOSPORESFROMEARLIERMATUREFALSESMUTBALLSCOULDGERMINATEAND浙江大学硕士学位论文7ISOLATIONTIMEWASTHEKEYFORTHESUCCESSFULISOLATIONOFTHEFUNGUSPROLONGATIONOFSTOREPERIODRESULTEDINQUICKDECLINEOFTHEGERMINATIONPERCENTAGEOFCHLAMYDOSPORESDECLINEDQUICKLYTHECHLAMYDOSPORESCOULDALSOBEKILLEDINAGREATNUMBERBYSTERILIZINGTREATMENTITWASPROVEDTHATTHESCLEROTIUMWASTHEMOSTIDEALSAMPLEFORISOLATIONOFTHEPATHOGEN,WHICHCOULDKEEPALIVEFORAVERYLONGTIMEHOWEVER,THECENTRALDENSEHYPHAEINFALSESMUTBALLSWEREVERYDIFFICULTTOGROWINTONEWCOLONIESONMEDIUMANDJUSTANALTERNATEMETHODFORISOLATIONOFTHEPATHOGEN2THEISOLATEDUSTILAGINOIDEAVIRENSWASCULTUREDONPSAMEDIUMINDARKAT26CTHESAMPLESWERETAKENFROMCOLONIESOFTHEFUNGUSATDIFFERENTDEVELOPMENTSTAGESANDTREATEDFORSCANNINGELECTRONMICROSCOPYSEMTHEOBSERVATIONFOUNDOUTTHATTHEHYPHAEINTHECOLONYSTARTEDTOINTERTWISTTOGETHERTOFORMHYPHALBINDSANDKNOTS7DAYSAFTERCULTUREON14DAYOLDCOLONIES,THEREWEREMOREANDLARGERCOMPACTHYPHALSTRUCTURESFORMEDINTHESAMETIMEANUMBEROFCONIDIAWEREFORMEDONTHESTRUCTURESWHEREASAFEWCONIDIAWEREPRODUCEDDIRECTLYONTHEINDIVIDUALHYPHAEON21DAYOLDCOLONIES,THEREWEREYELLOWFRUITINGBODIESAPPEAREDTHEFRUITINGBODIESWEREWRAPPEDUPBYALAYEROFHYPHAE,WHILEAGREATQUANTITYOFCHLAMYDOSPORESWEREPRODUCEDONTHEBINDEDHYPHAEINSIDETHEFRUITINGBODIESON30DAYOLDCOLONIES,THEFRUITINGBODIESBECOMELARGERANDOFTENBROKENUPATTHETOPORSIDETHEGERMINATIONRATEOFNEWLYFORMEDMATURECHLAMYDOSPOREWASQUITEHIGH,BUTITWASGRADUALLYREDUCEDASTIMEGOESONWITHIN30DAYS3USETHEPRIMERSITS4、ITS5TOAMPLIFYTHERDNAITSOFTHIRTYFIVEUSTILAGINOIDEAVIRENSTHEPCRPRODUCTIONSWEREABOUT650BPDOCOMPLETEALIGNMENTBASEDONTHESERDNAITSSEQUENCESTHE35RDNAITSSEQUENCESWERECOMPLETESAMETHEIRHOMOLOGYREACHED100THERESULTSSHOWEDTHATUSTILAGINOIDEAVIRENSISOLATINGFROMDIFFERENTPLACESWEREHIGHLYHOMOLOGOUSTHEITSUSTILAGINOIDEAVIRENSOFWASCONSERVATIVEALIGNMENTWASALSOCONDUCTEDWITHAB116645ANDAB105954THEHOMOLOGYWASALSO100THISINDICATEDTHATUSTILAGINOIDEAVIRENSFROMCHINAANDJAPANWEREALSOHIGHLYHOMOLOGOUS浙江大学硕士学位论文84THEPRIMERSUIGSIANDUIGSIIFORAMPLIFICATIONOFIGSINUSTILAGINOIDEAVIRENSWEREDESIGNEDACCORDINGTOPARTIALSEQUENCESOF28SAND18SRDNAAFTERTHEAMPLIFICATIONOFRDNAIGSOF11USTILAGINOIDEAVIRENSISOLATESFROMDIFFERENTREGIONSINCHINA,THEPRODUCTSWEREPURIFIED,CLONEDANDSEQUENCEDTHESEQUENCEALIGNMENTSHOWEDTHATTHERDNAIGSSEQUENCESINDIFFERENTISOLATESCONTAINEDONECENTRALVARIABLEREGIONANDTWOLATERALCONSERVATIVEFRAGMENTSTHESIMILARITYOFTHETWOCONSERVATIVESEQUENCESBETWEENTHE11ISOLATESREACHED9944ANDTHEVARIABLEREGIONCONSISTEDOFVARIOUSNUMBERSOF77BPLENGTHREPEATSANDTHESEQUENCEOFTHEREPEATUNITSWASHIGHCONSERVATIVEASWELLTHELENGTHPOLYMORPHISMOFTHEVARIABLEREGIONCOULDBECHECKEDMORECLEARLYBYTHENEWLYSIGNEDPRIMERPAIRUIGSIIIANDUIGSIVUSINGUIGSIIIANDUIGSIV,WEFIND4LENGTHPOLYMORPHISMWITHIN35ISOLATESTHERATEOFISOLATESWITHLENGTHPOLYMORPHISMWASLOWEACHLENGTHPOLYMORPHISMHADNORELATIONSHIPWITHITSGEOGRAPHICALREGIONTHISRESULTFURTHERDEMONSTRATEDTHATGENETICDIVERSITYOFUSTILAGINOIDEAVIRENSWASLOWTHERATESCOULDVARYINDIFFERENTREGIONSHOWEVER,THISGUESSNEEDMOREISOLATESTOCONFIRM浙江大学硕士学位论文9第一部分文献综述第一章稻曲病研究进展稻曲病（RICEFALSESMUT）是由稻曲病菌USTILAGINOIDEAVIRENSCOOKETAKAH有性态为VILLOSICLAVAVIRENSNAKATAETANAKA1988，日本也有白色稻曲球HONKURAETAL,1991的报道，中国王疏等19961997首先报道发现白色稻曲球，并认为白化菌株具有独立于稻曲病菌的分类地位。有些成熟的稻曲球上可形成菌核。菌核为黑色，质硬，大小不等，小的长为2MM，大的长为20MM，形状为纺缍形，马蹄形等。菌核幼小时埋入病粒的菌组织中，之后表现在病粒的表面，老熟后变黑色，容易剥离而落人田间越冬。12稻曲病的危害121稻曲病对水稻产量的危害稻曲病可引起小穗的不育，影响谷粒的发育，使秕谷率上升，结实率、千粒重、小穗重下降。和正常的田块相比，稻曲病发病田块谷粒空秕率升高409，千粒重下降324，穗重下降255（HEGDEETAL,2000）。王兴国等（1989）对病粒率和产量损失率进行相关性和回归分析，结果表明病粒率和产量损失率极显著相关。122稻曲病对水稻品质的影响我国植病学家朱凤美在50年代便指出稻曲病菌含有C9H6O7有毒色素，后经研究发现此毒素是一种生物碱邓根生,1989。用稻曲球喂养鸡、兔可以引起鸡、兔某些器官的病变（高峻,1987）。目前国外已从稻曲球中分离到六种毒素，分别是USTILOXINA，USTILOXINB，USTILOXINC，USTILOXIND，USTILOXINF,USTILOXINE。用USTILOXINS或USTILOXINA进行一次性注射，可以使小鼠离体的肝细胞和肾管状细胞急剧坏死，并遏制细胞有丝分裂或引起不正常的有丝分裂，与秋水仙素引起的症状相似KOISOETAL,1994。电镜组织化学证明它们可引起老鼠肝、肾、尿道的细胞凋亡和前胃溃疡NAKAMURAETAL,1993。USTILOXINS还能强烈抑制微管蛋白的组合，干扰细胞骨架的形成，对植物和动物细胞都有广泛的生物活性。由此可见，稻曲病对水稻品质有很严重的影响。浙江大学硕士学位论文11稻曲病在一些水稻产区已跃升为作物主要病害，并引起严重的经济损失王政逸等,2000；KOISOETAL,1992。1982年江西省一千万亩水稻发生稻曲病，粮食损失达3000万公斤季宏平等,1995，1994年冀东有100多万亩稻田发生稻曲病，减收稻谷3720万公斤潘勋等,1995。在其它水稻主要产区，稻曲病也已成为水稻重要病害之一季宏平等,2002；高俊等,2001。13稻曲病菌的生物学特性培养基上的稻曲病菌，在2230下均能生长良好，以28生长最快。低于13时，菌丝仍能生长，但速度明显减慢；高于35时，菌丝生长被抑制。PH在28106时，菌丝均能生长。PH为492698时，菌落直径最大。光照对菌丝生长无明显影响陆凡等,1996；陈志谊等,1994。病原菌在不同培养基上的生长速度和状态不同。周永力1999比较了稻曲病菌在7种培养基上的生长状况，发现培养前期稻曲病菌在胁本哲氏培养基上生长最快，培养后期则以大米粒培养基生长的菌落最大。稻曲病菌在PDA、PSA培养上生长缓慢，在PDYP培养基上可产生大量的菌核。VERMA等1988的研究结果表明，有些菌株在培养过程中可以产生厚垣孢子，有些菌株则不产生厚垣孢子。程明渊1996经过实验证实，稻曲病菌在人工培养基过程中形成厚垣孢子的能力与菌株本身有关，有的菌株培养一周即可形成厚垣孢子，而有的菌株在2个月后仍未见有厚垣孢子形成。王疏等1992的实验也表明，有的菌株人工培养20天即可形成大量厚垣孢子，也有菌株要培养70天才形成厚垣孢子。在人工培养条件下，稻曲病菌厚垣孢子的产生有两种情况，其一是首先形成白色菌丝，然后菌落中间或边缘的菌丝颜色变黄，逐渐向上突起，形成子实体。子实体逐渐由鲜黄色变为黄褐色。形成的子实体外面有一层菌丝包被，菌丝层破裂后散出黄色厚垣孢子；其二是不形成子实体，厚垣孢子直接由一根或几根菌丝直接产生。厚垣孢子数量较少，没有外层菌丝包被。周永力1999发现稻曲病菌有的菌株可以产生分生孢子，有的菌株则不产生分生孢子。王疏1998利用四种培养对稻曲病菌进行培养，在培养144小时后，浙江大学硕士学位论文12产孢量最多的是PS，其次为PD，YPPD，PW。先将稻曲病菌转入三角瓶液体培养基中，26培养79天，再把培养的菌丝液滴注到平面培养基上，暗培养35天，液体内可形成大量分生孢子王疏等,1998；缪巧明等,1994；FUJITAETAL,1989。把稻曲病菌菌丝转入PS培养液中振荡培养7天，也能产生大量的分生孢子陆凡等,1996。14稻曲病的侵染循环141稻曲病的侵染源病原菌以繁殖体、厚垣孢子、菌核、稻曲球的方式越冬，但对于越冬后它们在病害发生中的作用，研究者们有很大的争议。国外比较认同的观点为病原菌以菌核和厚垣孢子越冬。越冬菌核产生的子囊孢子为主要的初侵染源，侵害花器和幼颖，厚垣孢子则在再侵染中起决定作用。但是，国内研究表明，菌核在广东、河北、湖北等部分地区未被发现，并且落入土壤的菌核受水浸、微生物的影响，易于腐烂，而厚垣孢子的发芽力可以超过10个月。陈永坚认为厚垣孢子是主要的初侵染源董柯等,1989；刘安国等,1989。另外，带菌种子也是重要的初侵染源黎毓干等,1986。142稻曲病的侵染时期和侵染途径邓根生等1990在孕穗期前套袋保护的水稻不发病，而在孕穗期后套袋保护的水稻发病，这表明稻曲病的侵染时期应该是孕穗期。陈永坚用室内越冬的厚垣孢子接种水稻萌发种子、芽鞘、苗期叶片、秧苗根系，其病穗率分别为204、395、1258和968；用室外田地的越冬厚垣孢子接种根系、穗苞，也均可发病，浸根接种的发病率为3333。由此他认为，水稻从种子萌发期到抽穗期均能受病原菌侵入，但以水稻抽穗前12周为病菌侵入的主要时期黎毓干等,1986；王国良,1992；陈永坚等,1994；缪巧明等,1994。国外学者利用厚垣孢子和子囊孢子悬浮液注入叶鞘接种，获得成功。他们认为侵染应该发生在抽穗前的短期内。HASHIOKA1951观察到999的稻曲球内含有完整的花序，由此表明侵染大多发生于开花期前。浙江大学硕士学位论文13RAYCHAUDHURI描述了两种侵染途径一种侵染发生在开花早期，侵染子房，但花柱、柱头、花药保持完好，接着花柱、柱头、花药为病原菌所分解吸收；另一种侵染途径发生在谷粒成熟期，孢子在颖片上繁殖，吸收养分膨胀，使内外颖分开，病原菌吸收胚乳的养分而急速地生长，最后整个谷粒被病原菌所取代。GALLOWAY认为稻曲球即不是种传也不是土传病害。然而LIETAL认为稻曲病是种传系统性病害。IKEGAMI用孢子悬浮液接种萌发水稻种子的胚芽鞘，水稻发病，而且在分蘖期分蘖顶端发现菌丝，但在穗原基未发现菌丝。杜毅1985从种子处理入手，做药剂浸种，结果对稻曲病无防效；水稻催芽后接种病原菌亦未发病，证明了稻曲病不是系统浸染。KULKARNI和MONIZ用骆驼毛刷蘸厚垣孢子悬浮液接种受精和未受精的子房获得成功，但对稻种的涂抹未能致病。他们认为土壤中厚垣孢子萌发产生分生孢子通过风雨传播引起初次侵染。许多报道认为晚熟品种发病较重的现象陈志谊等,1994；陈嘉孚等,1992，再侵染可能是其重要原因。OU认为气传的子囊孢子和分生孢子引起花器上的局部病斑，在田间发病前的一周，厚垣孢子可被大量捕捉到，并且随着开花期的到来，孢子数量也相对增多。由此可见，稻曲病在田间的再次侵染以气传为主杜毅,1990。厚垣孢子有黄色、黄绿色、黑色三种，黄绿色为过渡阶段，存在时间很短。黄色孢子萌发率高，当其颜色变深时，很快丧失萌发能力或进入休眠。黑色孢子对不良环境抵抗力强，为越冬型孢子，打破休眠，萌发率可达30。黄色厚垣孢子的田间飞散是主要再侵染方式，但由于粘性物质的存在，厚坦孢子也不容易从稻曲球上飞离。病菌产生的子囊孢子、分生孢子等主要借风雨传播，气流、雨水是田间传播主要方式，土壤中菌核、厚垣孢子借灌溉传播，带菌种子的调动是主要的远距离传播方式。143稻曲病的田间寄主稻曲病除了水稻外，田间还有其它寄主。1979年，SHARMABCONIDIAFORMEDONSOMEINDIVIDUALHYPHAEAT14DAYOLDCOLONYCCONIDIAFORMEDINLARGEAMOUNTSONHYPHALBINDSAT14DAYOLDCOLONY浙江大学硕士学位论文30图2稻曲病菌厚垣孢子的形成。A培养21天的菌落上形成的子实体；B子实体里形成大量的厚垣孢子；C侧生在菌丝上的厚垣孢子；D厚垣孢子通过短柄与菌丝相连。FIG2FORMATIONOFCHLAMYDOSPORESOFUSTILAGINOIDEAVIRENSAFRUITINGBODIESFORMEDINCOLONYAFTER21DAYSINPSABGREATAMOUNTOFCHLAMYDOSPORESFORMEDINTHEFRUITINGBODYCCHLAMYDOSPORESPRODUCEDLATERALLYONTHEHYPHAEDCHLAMYDOSPORESCONNECTSPOREFORMINGHYPHAEWITHSHORTSTALKS图3菌丝结（束）上的厚垣孢子。浙江大学硕士学位论文31FIG3CHLAMYDOSPORESONHYPHALBINDSANDKNOTS422厚垣孢子萌发试验于厚垣孢子形成后的第2天、5天、10天、20天，将其置于无菌水中萌发20H。结果发现，每个厚垣孢子萌发后可形成12个圆球形透明的小孢子（图4）。刚成熟的子实体里的厚垣孢子萌发率高达90；保存5天后，其萌发率仍可保持在80以上。此后，子实体里厚垣孢子的萌发率急速下降。第10天萌发率为363，第20天萌发率为29，第30天只有极个别孢子能够萌发。这和田间稻曲球上的厚垣孢子萌发率下降速率是类似的。说明稻曲病菌厚垣孢子寿命比较短，只能在较短时间内保持萌发能力。图4厚垣孢子形成后不同保存时期的萌发率FIG4THEGERMINATIONRATEOFMATURECHLAMYDOSPOREDURINGSTORAGE43讨论稻曲病菌在人工培养过程中，14天以前，菌丝幼嫩，菌落生长迅速，产生的无性孢子以分生孢子为主；而14天以后，菌丝老化变黄，菌落生长缓慢，产生的无性孢子以厚垣孢子为主。陈丽等2007发现，稻曲病菌在液体培养前期主要产生分生孢子，只有在培养后期漂浮的菌落表面可产生厚垣孢子，并推测暴露于空气可能有利于诱导厚垣孢子的产生。综合本文结果来看，可能前期培养基营养丰富也是有利于产生分生孢子的重要原因。浙江大学硕士学位论文32在稻曲病菌无性孢子形成的过程中，本文发现了菌丝束、菌丝团和黄色子实体等特化菌丝结构，在这些结构中无性孢子大量产生，似乎孢子产生的速度也大大加快。在有子实体形成的地方，子实体的周围很容易再形成新的子实体。这些子实体连接或集生在一起，形成子实体群。在菌落表面没有这些结构的地方，无性孢子产生数量极少，仅散生于个别菌丝上。人工培养条件下，稻曲病菌的厚垣孢子呈球形，表面密生刺突。此点与田间稻曲球上厚垣孢子基本形态相一致的，只是人工培养基上厚垣孢子的体积相对小一些KIM,2006KIMANDPARK,2007陈丽等,2007。稻曲病菌在人工培养条件下生长缓慢，而寄生在感病水稻上的稻曲病菌营养与生存环境较好，可能更有利于其生长发育。25条件下，子实体里和稻曲球上厚垣孢子的萌发率均有随保存时间的推移而快速下降的趋势。因此厚垣孢子在作为接种体使用时应尽早使用。本实验过程中，曾试图采用方中达2007打破真菌孢子休眠的常规方法，促使形成20天的稻曲病菌稻曲病菌厚垣孢子萌发，但未收到明显的效果。人工培养基上和稻曲球上的厚垣孢子是否存在休眠期还需要做进一步的研究。致谢浙江大学分析测试中心电子显微镜室的洪健教授、何黎平老师、黎军英老师、徐颖老师和孟春梅老师提供了技术指导和帮助，向他们特表深切的谢意。浙江大学硕士学位论文33第五章中国不同地理来源稻曲病菌RDNAITS的分析在1991年和1997年，日本和中国相继报道了稻曲病菌的白化菌株TANAKAETAL,2008；王疏等1997在对白化菌株的生物学特性、酯酶同功酶和RAPD的扩增谱等特征进行分析后，认定它是不同于稻曲病菌的一个新种，UALBICANS。ZHOU等2004研究表明，我国浙江、辽宁、云南3个省份的稻曲病菌菌系的RDNAITS序列高度保守。但是我国的气候环境复杂多样，不同地区的气候环境有很大差异，在更广泛的范围内是否存在更为复杂的多样性变异并不清楚。为此，本试验在全国范围内不同生态区采集稻曲病标样，对更广泛范围内的稻曲病菌的RDNAITS序列进行进一步的分析。51材料与方法511供试菌系供试菌系分别从辽宁、陕西、河南、安徽、福建、浙江、广西、云南等8个省份18个不同生态地区的稻曲病标样分离而来，共分离了35个稻曲病菌菌系（表1）。获得的稻曲病菌菌系在4黑暗条件下PSA马铃薯200G,蔗糖20G,琼脂20G,水1L固体培养基上保存。512DNA的提取保存的供试菌系活化后，用接种针将菌块转接到PS液体培养基，26黑暗条件下130R/MIN振荡培养7天。采用CTAB法提取DNA；提取的DNA溶解在TE中，琼脂糖凝胶电泳检测后保存于20下保存备用。513RDNAITS区扩增和序列测定利用引物ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）、ITS5（GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG（HTTP/WWWBIOLOGYDUKEEDU/FUNGI/MYCOLAB/PRIMERSHTM）扩增稻曲病菌基因组的浙江大学硕士学位论文34ITS片段，PCR反应体系为10BUFFER5L，10MMOL/LDNTP1L，25MMOL/LMG23L，10MOL/L引物各1L，TAQDNA聚合酶05L，DNA模板1L，DDH2O补足50L。扩增程序为945MIN；9440S，5340S，721MIN，35个循环；7210MIN。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，直接送上海英骏生物技术有限公司进行双向测序。513RDNAITS序列的比较分析将获得的稻曲病菌菌系的RDNAITS序列整理，然后登录在GENBANKHTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/GENBANK/INDEXHTML中（表1）。用DNAMAN对获得的序列与GENBANK中已有的稻曲病菌菌株的RDNAITS序列（AB092943AB092957、AB092689、AB116645、AB105954）进行比较，分析同源性。表1不同地理来源的稻曲病菌菌系和GENBANK通道号TABLE1THEORIGINSANDGENBANKACCESSIONNUMBERSOFUSTILAGINOIDEAVIRENSISOLATES菌系ISOLATES地理来源ORIGINSGENEBANK通道号ACCNO菌系ISOLATES地理来源ORIGINSGENEBANK通道号ACCNOAH04安徽桐城FJ848705LN06辽宁沈阳FJ848732FJ01福建沙县FJ848706YN01云南文山FJ848733GX01广西全州FJ848707YN02云南马关FJ848734GX0201广西凌云FJ848708ZJ01浙江三门FJ848735GX0202广西凌云FJ848709ZJ0201浙江杭州FJ848736GX03广西三江FJ848710ZJ0202浙江杭州FJ848737GX04广西龙胜FJ848711ZJ04浙江上虞FJ848738GX07广西南宁FJ848712参考菌系HN01河南武陟FJ848713REFERENCEISOLATESHN02河南开封FJ848714UVIRENSA辽宁AB092689HN03河南信阳FJ848715UVIRENSA辽宁AB092943SX0101陕西汉中FJ848716UVIRENSA浙江AB092944SX0102陕西汉中FJ848717UVIRENSA浙江AB092945SX0103陕西汉中FJ848718UVIRENSA浙江AB092946SX0104陕西汉中FJ848719UVIRENSA浙江AB092947SX0201陕西湄县FJ824824UVIRENSA浙江AB092948SX0202陕西湄县FJ848720UVIRENSA浙江AB092949SX0203陕西湄县FJ848721UVIRENSA浙江AB092950SX0204陕西湄县FJ848722UVIRENSA浙江AB092951SX0205陕西湄县FJ848723UVIRENSA浙江AB092952SX0206陕西湄县FJ848724UVIRENSA日本AB092953SX0207陕西湄县FJ848725UVIRENSA云南AB092954SX0208陕西湄县FJ848726UVIRENSA日本AB092955LN01辽宁沈阳FJ848727UVIRENSA日本AB092956LN02辽宁沈阳FJ848728UVIRENSA辽宁AB092957浙江大学硕士学位论文35LN03辽宁沈阳FJ848729UVIRENSB日本AB116645LN04辽宁沈阳FJ848730UVIRENSB日本AB105954LN05辽宁沈阳FJ848731ACHINESEACADEMYOFAGRICULTURALSCIENCES,INSTITUTEOFCROPBREEDINGANDCULTIVATION,KEYLABORATORYOFCROPGENETICANDBREEDING,BEIJING,CHINABTHEAGRICULTURALHIGHTECHRESEARCHCENTER,MEIJOUNIVERSITY,TEMPAKUKU,NAGOYA,JAPAN52结果与分析521RDNAITS序列分析利用ITS4、ITS5扩增稻曲病菌的RDNAITS片段，扩增产物的电泳条带为650BP左右。测序分析结果表明，我国不同地区35个菌系的RDNAITS序列完全一致，即同源性为100。这与周永力等2003对我国浙江、辽宁、云南3个省份稻曲病菌ITS序列的分析结果一致。这说明我国不同生态区的稻曲病菌具有高度同源性，其ITS具有高度保守性。将获得序列与GENBANK中的RDNAITS序列进行比对，结果表明，这些序列和GENBANK中的AB116645、AB105954同源性为100。这说明我国的稻曲病菌和日本的稻曲病菌也具有高度同源性。53讨论本文通过对中国8个省份18个不同生态区稻曲病菌的ITS序列分析，进一步证明来自不同生态区的稻曲病菌的ITS序列是完全一致的。ITS序列表明，不同地理来源菌系的ITS区具有高度的保守性，不能提供不同地理来源菌系之间的差异信息。周永力等2004利用RAPD技术对中国8个省9个地区的55个菌系和日本的1个菌系进行了群体遗传结构的分析结果表明，不同地理来源的菌系难以划分地理宗谱。潘雅姣等2006采用AFLP技术分析同一稻田不同水稻品种上稻曲病菌的遗传多样性，初步推断稻曲病菌与水稻品种不存在明显的专化性。由此可以看出，稻曲病菌多样性的分化的程度相对较低；ITS序列的多态性分析难以对稻曲病菌种内水平的多样性进行评估。对于稻曲病菌多态性的分析需要在具有更大变异能力的序列基础上进行。浙江大学硕士学位论文36致谢浙江大学农业与生物技术学院植保系张敬泽老师对本章实验和论文写作给予了指导。在此，向他表示衷心的感谢浙江大学硕士学位论文37第六章中国不同地理来源稻曲病菌RDNAIGS的初步分析周永力等（2004）利用RAPD方法对来自中国辽宁、湖北、浙江、云南等8个省份56个稻曲病菌菌株的群体遗传结构进行了分析，结果表明，稻曲病菌遗传稳定，不同地区、不同年度稻曲病菌的DNA多态性没有明显差异。潘雅姣等（2006）利用AFLP技术对北京昌平同一块稻田中不同水稻品种和育种中间材料上稻曲病菌的遗传多样性进行分析，初步推断稻曲病菌和水稻品种间不存在明显的专化性互作。核糖体DNARDNA的编码区具有保守性，非编码区却变异丰富。RDNA基因间隔区间IGSINTERGENICSPACER被认为是RDNA中变异最快的区域，被广泛用于真菌同属不同种间和种内不同种群间的比较研究（梁宏,2006）。为此，本文对中国不同地理来源稻曲病菌的IGS序列进行了初步分析，试图从另外一个角度揭示稻曲病菌的遗传结构和多样性。61材料和方法611供试菌株供试菌株分别从辽宁、陕西、河南、安徽、福建、浙江、广西、云南等8个省份不同生态地区的稻曲病标样分离而来表1。分离得到的稻曲病菌菌株在4黑暗条件下PSA固体培养基上保存。表1不同地理来源的绿核菌菌株和GENBANK登录号TABLE1THEORIGINSANDGENBANKACCESSIONSOFUSTILAGINOIDEAVIRENSISOLATES菌株ISOLATES菌株地理来源ORIGINSGENBANK登录号GENBANKACCESSIONSSY03辽宁沈阳GQ374788SY04辽宁沈阳GQ374789SY05辽宁沈阳GQ374790SX0103陕西汉中GQ374791HN01河南武陟GQ374792浙江大学硕士学位论文38HN03河南信阳GQ374793AH04安徽桐城GQ374794FJ01福建沙县GQ374795ZJ0202浙江杭州GQ374796GX03广西龙胜GQ374797YN01云南文山GQ374798612DNA的提取供试菌株经活化后转接到PS培养基中，26黑暗条件下振荡130RPM培养7天。菌丝经布氏漏斗过滤并蒸馏水多次洗涤后，置于研钵中并加液氮研磨。采用CTAB法提取DNA；提取的DNA溶解在TE中，琼脂糖凝胶电泳检测后保存于20下备用。613稻曲病菌RDNAIGS区引物的设计与扩增首先利用引物LR10R、LR12HTTP/WWWBIOLOGYDUKEEDU/FUNGI/MYCOLAB/PRIMERSHTM对ZJ0202、SX0103两个菌株RDNA28S的部分片段进行PCR扩增和测序，并依据测序结果GQ374799和GQ374800和已知序列结果AB116645和AB105954设计出扩增稻曲病菌RDNAIGS区的引物UIGSCTGCTGGATAATGGCTGAACG和UIGSCACGGTTATCCAAGTAGCAAG。614稻曲病菌RDNAIGS区的扩增利用引物UIGS、UIGS对部分稻曲病菌的RDNAIGS区进行扩增。PCR反应体系包括2GCBUFFER5MMOL/LMG2PLUS25L，DNTPMIXTURE各25MMOL/L8L，引物10MOL/L各1L，TAKARALATAQDNA聚合酶5U/L05L，DNA模板1L，DDH2O补足50L。扩增程序为945MIN；941MIN，5645S，724MIN，36个循环；7210MIN。615稻曲病菌RDNAIGS扩增产物的回收、克隆、测序及序列分析将614中PCR产物用1的琼脂糖凝胶电泳，并用DNA回收试剂盒爱浙江大学硕士学位论文39思近生物技术有限公司纯化。纯化后的产物连接到载体PGEMTEASYPROMEGA上，4过夜。转化大肠杆菌DH5感受态细胞，用含XGAL和IPTG的抗性平板筛选。挑取白色菌落培养，经菌液PCR和质粒酶切验证后，送上海英俊生物技术有限公司进行测序。获得序列登录到GENBANK中，并利用DNAMAN软件对所测序列进行比对分析。62结果与分析621稻曲病菌RDNAIGS的扩增结果对不同地理来源稻曲病菌RDNAIGS的扩增结果表明，利用引物UIGS、UIGS能够对稻曲病菌的RDNAIGS区进行很好的扩增，所有测试菌株均得到明亮的扩增条带图1。稻曲病菌RDNAIGS区的长度约为2250BP3000BP。图1不同地理来源稻曲病菌RDNAIGS的扩增结果FIG1AMPLIFICATIONOFRDNAIGSOFUSTILAGINOIDEAVIRENSISOLATESFROMDIFFERENTREGIONSINCHINA622稻曲病菌RDNAIGS的序列结构用DNAMAN对不同地理来源稻曲病菌的RDNAIGS序列进行分析，结果表明，稻曲病菌的RDNAIGS区两端的序列高度保守，中间靠近第940BP处有以77BP为单位的重复序列TAAGTCACGTGGGATCACAGAAGGAAGACATAGGGTAGCTCCGATGTTC浙江大学硕士学位论文40TGCTATGTAGAGGTCACGTGACATTGGG。其中GX03菌株有4个重复单元，长度为438BP；SY05菌株有7个重复单元，长度为708BP；其余9个菌株均为3个重复单元，长度为399400BP图2。将SY05和GX03菌株多出的插入片段去掉后，11个菌株RDNAIGS序列的一