吴茱萸中黄酮类化合物的提取与分析 论文正文

毕毕毕毕业业业业论论论论文文文文（设计设计设计设计）题题题题目目目目吴茱萸中黄酮类化合物的提取与分析指导老师指导老师指导老师指导老师专业班级专业班级专业班级专业班级生物技术及应用0701姓姓姓姓名名名名学学学学号号号号2010年年年年5月月月月30日日日日职业技术学院毕业论文（设计）I摘摘摘摘要要要要为了研究开发吴茱萸中黄酮类化合物，本文研究了不同提取方法对其提取率的影响，并研究了吴茱萸中黄酮测定方法及成分组成。实验结果表明出于提取率和成本能耗方面考虑，发现利用50的乙醇作为吴茱萸黄酮的溶剂效果较佳，提取试剂以4H为最佳，此优化条件下，提取的总黄酮含量336MG/G药材。吴茱萸中的黄酮化合物的组成成分为黄酮类和黄酮醇类。关键词关键词关键词关键词吴茱萸；黄酮类化合物；分光光度法；颜色反应职业技术学院毕业论文（设计）II目目目目录录录录引言11实验材料及仪器211药材212化学试剂213其它材料214仪器22实验方法321总黄酮含量测定方法3211标准溶液的配制3212标准曲线的绘制422吴茱萸中黄酮提取条件的选择4221提取溶剂浓度的选4222提取时间的423吴茱萸黄酮提取液的颜色反应4231盐酸镁粉反应4232浓硫酸试验4233三氯化铝反应4234三氯化铁反应4235氨水反应4236硝酸铝反应5237氢氧化钠试验5238醋酸镁试验53实验结果与讨论531吴茱萸中总黄酮含量测定方法及研究5311显色稳定性实验5312回收实验532吴茱萸中黄酮提取条件的选择5321提取溶剂浓度的选择5322提取时间对提取率的影响633吴茱萸黄酮提取液颜色反应64小结75前景展望7参考文献8职业技术学院毕业论文（设计）1引引引引言言言言吴茱萸，又名辣子、臭辣子树、气辣子、曲药子、茶辣。吴茱萸是中药材中的小品种，分大花、中花、小花。主产于云南、贵州、四川、江西、安徽、浙江。当前吴茱萸中化学成分的研究主要集中在生物碱类，国内外对吴茱萸中黄酮类化合物的研究甚少。GRIMSHAW等1从吴茱萸的叶子中分离得到GLUCOSIDEB4,7DIGLUCOSIDEOF6OR83METHYLBUT2ENYL4,5,7TRIHYDROXYFLAVANONE。ARISAWA等2对吴茱萸叶子甲醇提取物依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，对乙酸乙酯萃取物采用SEPHADEXLH20柱层析分离得到金丝桃苷和EPIMEDOSIDEC。对正丁醇萃取物采用SEPHADEXLH20柱层析分离得到金丝桃苷、芦丁和EVODIOSIDEB。黄酮类化合物具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、抗菌、镇痛、解痉以及增强机体免疫力等功效，对人体肿瘤、衰老、心血管等退行性疾病的治疗和预防有重要意义36。因此开展吴茱萸果实中黄酮类化合物的研究对进一步阐明该药物药效物质基础、更有效地开发和利用该药用植物资源有着重要的意义。职业技术学院毕业论文（设计）21实验材料及仪器11药材吴茱萸EVODIARUTAECARPAJUSSBENTH果实产于湖南浏阳，由中国中医研究院中药研究所何希荣主管中药师鉴定。12化学试剂盐酸，氢氧化钠（AR，杭州化学试剂有限公司），无水乙醇（,安徽特酒厂），无水三氧化铝（AR,北京化学试剂二厂），三氯化铁（AR,上海金山化工厂），亚硝酸钠（AR,上海化学试剂厂），硝酸铝（AR，上海振欣试剂厂），镁粉（AR，上海精化科技研究所），醋酸镁（AR,天津大港亿中化工厂），氨水（AR,杭州瓶窑化工试剂厂）,浓硫酸AR，上海试剂总厂。13其它材料芦丁对照品北京药品生物制品检定所；柱层析用聚酰胺（100200目）浙江省台州市路桥四青生化材料厂。14仪器S54紫外可见分光光度计上海棱光技术有限公司；ZF型三用紫外分析仪上海顾村电光仪器厂。TC15套式恒温器浙江新华医疗器械厂。2实验方法21总黄酮含量测定方法7采用分光光度法测定总黄酮含量，即利用黄酮类化合物与铝盐反应生成红色络合物，以芦丁为对照品在500NM处测定吸光度。职业技术学院毕业论文（设计）3211标准溶液的配制精密称取于120干燥至恒重的芦丁对照品401MG，加入60的乙醇定容成100ML溶液。212标准曲线的绘制精密吸取芦丁标准液020，040，080，120，160和200ML加入10ML容量瓶中，分别加入02ML5NANO2，摇匀，静置6MIN；再分别加入02ML10ALNO33，摇匀，静置6MIN，再分别加入1ML4NAOH，用60乙醇定容至刻度，摇匀，静置15MIN。以空白试剂作对照，在500NM波长处测定吸光度，得到标准曲线A1013198C000302，相关系数R09996，在000802008020G/L范围内呈良好的线性关系。213显色稳定性实验文献12提到黄酮与铝离子的显色反应能迅速完成，但配合物的稳定性不是很高。为了考察吴茱萸黄酮的显色稳定性，对同一样品不同时间间隔（10MIN，15MIN，20MIN，30MIN,40MIN,50MIN）的吸光度进行了考察。214回收实验取已知浓度的样品液4份，分别添加适量芦丁标准品，按文献方法操作7。214样品的测定文献79指出，提取物中鞣质和色素等带有酚羟基的物质会干扰分光光度法的比色测定结果，而聚酰胺树脂对黄酮类物质具有很好的分离效果，同时可以吸附干扰比色测定的其它多元酚和色素，尤其对鞣质具有不可逆吸附，所以先对吴茱萸提取液进行聚酰胺柱层析预处理。聚酰胺柱层析采用95乙醇作为洗脱剂。预处理后的洗脱液再用紫外分光光度法进行测定总黄酮含量。样品中的黄酮总量计算方法按下式进行样品中的黄酮总量以芦丁计10VWVVCV4231式中C样品溶液浓度；V1提取后的定容体积；V2聚酰胺处理时取样量；V3聚酰胺处理后的定容体积；V4样品液测定时的取用量W提取所用的吴茱萸重量MG。22吴茱萸中黄酮提取条件的选择实验装置为1000ML三颈瓶上装2根球形冷凝管，采用可控温电加热套加热提取职业技术学院毕业论文（设计）4溶剂采用乙醇水体系。各取吴茱萸果实200G，乙醇回流提取过滤，残渣用与提取相同的溶剂洗涤并与提取液合并后定容为210ML。取21ML过聚酰胺柱层析，95乙醇洗脱至流出液无黄酮类化合物的显色反应为止洗脱体积150ML左右，洗脱液按标准曲线项下方法测定总黄酮含量，经计算得到不同醇浓度对提取率的影响。221提取溶剂浓度的选择分别采用水、25乙醇、50乙醇、75乙醇、无水乙醇200ML。222提取时间的选择提取时间分别为2H、3H、4H、5H、6H。23吴茱萸黄酮提取液的颜色反应1011231盐酸镁粉反应取总黄酮提取液1ML于试管中，加入少许镁粉，然后再加几滴浓盐酸，水浴加热，观察现象另一试管供试液仅加浓盐酸进行观察，以排除本身的颜色。232浓硫酸试验取总黄酮提取液1ML于试管中，加入浓硫酸数滴，混匀后，喷在滤纸上，吹干，观察现象。233三氯化铝反应用玻璃棒蘸取总黄酮提取液涂于滤纸上，吹干，喷1的三氯化铝乙醇溶液，吹干，观察现象。234三氯化铁反应取总黄酮提取液1ML于试管中，加入数滴1的三氯化铁水溶液，观察现象。235氨水反应用玻璃棒蘸取总黄酮提取液涂于滤纸上，吹干，将滤纸放在氨水上方熏05MIN左右，观察现象。236硝酸铝反应取总黄酮提取液1ML于试管中，加入数滴10的ALNO33溶液，观察现象。237氢氧化钠试验用玻璃棒醮取总黄酮提取液涂于滤纸上，吹干，喷4氢氧化钠溶液，吹干后观察现象。238醋酸镁试验用玻璃棒醮取总黄酮提取液涂于滤纸上，吹干，喷1醋酸镁的甲醇溶液，吹干后观察现象。职业技术学院毕业论文（设计）53实验结果与讨论31吴茱萸中总黄酮含量测定方法及研究311显色稳定性实验测定结果表明见表31，显色时间在半小时内较稳定，随着时间的延长，所测吸光度偏差变大。因此样品溶液配好后应尽快进行测定。表31显色稳定性实验结果时间MIN101520304050样品（吸光值）080508060807081008160827312回收实验测得结果见表32。表32回收实验结果样品总黄酮含量G加标量G测得加标后总黄酮含量G回收率平均回收率RSD（）1197418953988970219743790585398597213319747580978197741974113701398095532吴茱萸中黄酮提取条件的选择321提取溶剂浓度的选择结果见表33。结果表明，乙醇浓度为50时提取液的总黄酮含量最高，为336MG/G药材，所以采用50乙醇作为提取吴茱萸中总黄酮的溶剂效果较佳。表33不同乙醇浓度对总黄酮提取率的影响乙醇浓度（）1007550250总黄酮提取率MG/G药材42326336267212职业技术学院毕业论文（设计）6322提取时间对提取率的影响结果见表34。由结果可知，随着提取时间的增加，总黄酮含量也增加，提取时间为6H时总黄酮含量最高。不过4H已基本提取完全，因此较佳的提取的时间定在4H。表34不同提取时间对提取率的影响提取时间H23456总黄酮提取率MG/G药材16233033633833933吴茱萸黄酮提取液颜色反应吴茱萸黄酮提取液的颜色反应结果见表35。由表35的定性颜色反应，通过查阅手册13可以初步判断，吴茱萸中的黄酮类物质主要是黄酮类和黄酮醇类。其母体结构见图21和图22。OOOOOH图11黄酮类（FLAVONES）化合物的母体图12黄酮醇类（FLAVONOL）化合物的母体表35吴茱萸中黄酮提取液的显色反应结果显色试剂盐酸镁粉浓硫酸三氯化铝三氯化铁氨水硝酸铝氢氧化钠醋酸镁提取液显色粉红色灰黄黄色黄绿色黄色黄色黄色黄色注表示在紫外灯下看有荧光职业技术学院毕业论文（设计）74小结（1）建立了聚酰胺吸附硝酸铝显色测定吴茱萸总黄酮含量的方法，该方法简便、可行，结果准确、可靠。（2）通过对不同溶剂、不同提取时间的研究，得出吴茱萸总黄酮提取的较佳工艺条件为50乙醇作溶剂回流提取4H。在此工艺条件下，吴茱萸总黄酮的得率为336MG/G药材。（3）通过对提取液的各种定性颜色反应，确定吴茱萸中的黄酮类化合物主要为黄酮类（FLAVONES）和黄酮醇类（FLAVONOL）。5前景展望吴茱萸中黄酮类化合物具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、抗菌、镇痛、解痉以及增强机体免疫力等功效，对人体肿瘤、衰老、心血管等退行性疾病的治疗和预防有重要意义。当前国内外对吴茱萸黄酮类化合物的研究还甚少，但是吴茱萸其高效的药效物质基础是应该引起企业的重视。对于吴茱萸资源的全面利用，企业可以根据吴茱萸特有的生理功能开发有关的保健药品和功能性食品，带来创新产品，创造经济效益。本次试验比较简单，不需要用到特别的仪器，提取方法简单方便，能源消耗小，但是吴茱萸中的黄酮化合物含量提取率还是相对比较低，许多的方案有待修正和完善。目前吴茱萸中黄酮化合物等资源的开发将在世界市场是一个热点话题相信将来具有很大的前景。职业技术学院毕业论文（设计）8参考文献1GRIMSHAWJ,LAMERZARAWSKAEANISOPENTENYLFLAVANONEFROMEVODIARUTAECARPAPHYTOCHEMISTRY,1975,148382ARISAWAM,HORIUCHIT,HAYASHIT,ETALSTUDYONCONSTITUENTSOFEVODIARUTAECARPARUTACEAE,CONSTITUENTSOFTHELEAVESCHEMPHARMBULL1993,41814723刘诗平,陈尚猛,朱卫东槲皮素及其衍生物的生物活性研究进展中草药,1991,2241824白凤梅,蔡同一类黄酮生物活性及其机理的研究进展食品科学,1999,208115张德权,台建祥,付勤生物类黄酮的研究及应用概况食品与发酵工业,1999,256526RAFATHSHYDROXGLRADICALSCAVENGINEACTIVITYOFFLAVONOIDSPHYTOCHENISTRY,1987,2624897陈貌连,宋凤瑞,郭明全等刺五加叶中黄酮类化合物的分析分析化学,2002,3066908张中建,阎小伟聚酰胺吸附法测定总黄酮食品工业科技,