[硕士论文精品]海带多糖l01对肾上腺素直接损伤内皮细胞的干预作用_肖素君

海带多糖L01对肾T腺素直接损伤血L管内皮细胞的干预作用2007级硕士研究生学位论文海带多糖L01对肾上腺素直接损伤内皮细胞的干预作用摘要目的建立肾上腺素直接损伤家兔股动脉内皮细胞的血栓模型，研究海带多糖L01对肾上腺素致血管内皮细胞C损伤的干预作用，从VEC形态学结构和抗凝血功能两方面探讨海带多糖L01对VEC的保护作用。方法将实验家兔分成五组生理盐水组、肾上腺素组、海带多糖低剂量组、海带多糖高剂量组和依诺肝素组，通过插管于股动脉游离段分别注入生理盐水、生理盐水一肾上腺素液、低剂量海带多糖一肾上腺素液，高剂量海带多糖一肾上腺素液和依诺肝素一肾上腺素液，保留25MIN后，动脉插管连接生物信号记录系统BL系统，观察血压曲线，当曲线变为直线即为血栓形成，记录血栓形成时间，以此来评估内皮细胞抗凝血功能的改变。取与药物接触的股动脉段，用4多聚甲醛固定，切片HE染色，观察血管内皮层的完整情况，以此来评估内皮细胞结构损伤程度。同时将标本作TF蛋白免疫组化，以未脱落棕色内皮层长度与血管内壁总长的比值表示内皮细胞层的完整程度，以血管平均灰度值表示TF在内皮层和内皮下组织的表达情况，从另一方面来评价内皮细胞功能受损程度。结果肾上腺素组1999A192MIN血栓形成时间显著短于其它各组PO05，海带多糖低剂量组血栓形成时间3304士305MIN较海带多糖高剂量组469钍43LMINBY显缩短PO05。病理图像分析仪检测内皮层完整程度显示，海带多糖高剂量组6435339与海带多糖低剂量组内皮细胞51774239的完整度均高于肾上腺素组38134340PO05THEOCCLUSIONTIMEINTHELOWDOSEGROUPS3304J305MINARESHORTERTHANHI曲DOSEGROUPS4694士431MINP005THEINTEGRATEDDEGREEOFVASCULARENDOTHELIALLAYERMEASUREDBYPATHOLOGYANALYZERDISPLAYEDTHATTHEINTEGRATEDDEGREEINHIGLL64354339ANDLOWDOSELAMINARANLO151774239GROUPSAREHIGHERTHANTHEADRENALINGROUP38134340PO05。表15组动脉血栓形成时间比较工趣，NLO组别平均血栓形成时间MIN生理盐水组肾上腺素组海带多糖低剂量组海带多糖高剂量组依诺肝素组5738士3851999士192330443054694士43L5469A435单因素方差分析ANOVA，方差齐，SNK法比较两组间的差异性。肾上腺素组较其它各组明显缩短P005其余各组，P005，其余各组两两比较，P001，差别有统计学意义。图35组血管内膜完整程度比较FI03COMPARATIONOFTHEINTEGRITYDEGREEINTHEVECOF5GROUPS18加如约加O海带多塘L01对肾F偶索直接损伪M管内皮自Q胞曲F顶作用2007级顾L研究生学位论史ADRENALINGROUPENOXAPARINGROUPLL01GROUPHL01GROUP图4股动脉病理组织切片既染色，X40FI94N曲OL雌JCLISET,ONOFFRMORALARTERYHESTAINING，X40THEMORPHOLOGICOBSERVATIONOFFRMOLARTERYENDOTHELIALD却LAYSTHATTHEENDOTHELIUMALEINTACTANDSMOOTHINSALINE,ENDOTHELIUMRUPTARAADBREAKSONINADRENALINEGROUP,ADTHEENDOTHERLALAREPARTLYAMOTIEINLOWDEINMINARALL01GROUP，THEENDOTHELINMINH唔HANDLOWD嘴EOFINMINARALL01GROUPSAREINTEGRATEDANDCADSEESEPARATIONFROMTHEHYPEDERMIS，WHILEC02PSESURFACEAPPEARSHUTNOTBR曲BOFFINEUOXAPARINGROUP海带多略LOI对忖L。脾索直接损伤M管内皮自腿的十预作川2007级L。QF究生学位论文“2薄IJO_、，7，亨JVFTLL01GROEPHL01GROUP用5肢动脉TF免疫组化X40FI95LMMUNOHISTHCHEMICAILYSTAINOFFEMORALARTERYWITHTFANTIGENX40THEIMMUNOBISTOCHEMICAILYSTAINOF缸MO憎IAHERYWITHTFANTIGENDBPBYSTHATTHEENDOTHEFIUMANDSUBENDOTHELIALTISSUEAREDYEDBROWNINADRENALINEGROUP,ANDTHEENDOTHELIALATEDYEDBROWNMADDERINLOWDOSELAMINARALLOIGROUP,THEENDOTHELIALA陀DYEDLIGHTYELLOWINOTHERSGROUP曼_海带多糖L01对肾上腺素直接损伤血管内皮细胞的干预作用讨论血管内皮细胞VEC是一个多功能内分泌器官，能分泌多种因子如血管舒张物质和血管收缩物质、促凝物质和抗凝物质、炎性物质和抗炎物质、纤溶和抗纤溶物质、氧化和抗氧化物质等，调节血管张力、血小板功能、血浆促凝因子激活、活化凝血因子的清除以及纤溶过程，介导炎症和促进血管修复等，使机体处于稳态。内皮细胞能同时释放舒缩血管物质，双向调节血管张力。舒血管物质主要有内皮依耐性舒张因子NO、PGL2、内皮依耐的超极化因子；缩血管物质主要有血栓素AZTXA2、血管紧张素ANGII以及内皮素ET。内皮细胞释放的NO被认为是一个重要的抗粥样硬化分子【71。它可以减少单核细胞和淋巴细胞趋化因子MCP及粘附分子的合成【8】，抑制促炎因子和促粥样硬化的形成。同时，内皮细胞释放的ET1能够增加诱导单核细胞，激活巨噬细胞，促进粘附分子，从而加剧粥样硬化【9】。VEC还能感知血流力度，血液中物理、化学、体液因素等变化，通过合成和分泌各种生物活性物质做出不同的应答。同时还是多个配体的靶器官，感受血管内不同的生理或化学刺激，调节细胞和机体的生理活性，干预多种与血管有关的生理和病理生理过程。VEC的完整性是预防血栓形成的一个重要基础，其抗血栓功能是VEC在生理状态下最基本的功能。在生理条件下，VEC通过抗血小板、抗凝血和促纤溶来抑制血栓形成【LO】。内皮细胞合成和释放前列环素PGL2，内皮衍生松弛因子EDI强来抑制血小板聚集；分泌抗凝血酶I、分泌肝素样粘多糖、参与蛋白C系统的抗凝来抑制血液凝固；合成和释放纤溶酶原活化剂来激活血栓溶化【L。在病理因素刺激下，内皮细胞做出适应性改变，持续过度的改变即为内皮功能紊乱，具体表现为屏障作用减弱、内分泌功能紊乱、内皮抗凝特性改变等。一方面，它可合成血管性假血友病因子VWF，VWF在调节血海带多糖L01对肾上腺素直接损伤血管内皮细胞的干预作用2007级硕士研究生学位论文小板粘附到血管壁的过程中起着重要的作用。同时，还合成血小板活化因子PAF、血栓素A2TXA2等，促进血小板向受损血管壁的粘附和聚集；另一方面，它可表达组织因子研、凝血因子V、X等，促进血液凝固；此外，VEC还可分泌和释放纤溶酶原激活物抑制物PAIPAI通过与TPA结合而抑制血栓的溶解【121。实验结果表明，肾上腺素能够直接损伤血管内皮结构，促使动脉血栓形成。我们在过去的研究中也发现，于人脐静脉内皮细胞培养液中加入肾上腺素，可使培养液中的血管血友病因子VWF的水平呈明显上升的趋势【13】，组织途径纤溶酶原激活物TPA与组织途径纤溶酶原激活物抑制物TPAI比值含量下降141。由此说明肾上腺素既能够损伤VEC结构，也能够破坏VEC调节促凝与抗血栓平衡功能。这与实验结果相符。已有研究揭示肾上腺素对VEC的损伤作用与其代谢产物有关，肾上腺素在A型单胺氧化酶作用下，脱氨生成23，4二羟苯基一2羟基乙醛、过氧化氢和甲胺MA，后者在氨基脲敏感胺氧化酶SSAO作用下生成甲醛、过氧化氢和氨【51，YOSHIRO等【151认为甲醛与自由基可通过产生活性氧而致细胞损伤，并呈协同作用。过氧化氢是SSAO氧化脱氨反应产物之一。在FE2存在时，由FENTON反应转变为毒性更大的羟自由基，破坏细胞膜屏障【L6】。由此可见，肾上腺素过度脱氨是VEC损伤的一个危险因素。机体在应激状态，肾上腺髓质释放大量肾上腺素，继而产生过量的脱氨产物，对VEC生成损伤，因此我们的研究也为进一步研究肾上腺素损伤机制和防护打下了实验基础。在体内，生理性止血与血栓形成的凝血过程基本上都是通过组织因子TF与凝血因子VIIAFVIIA形成复合物而启动的。FALATI17】等采用共聚焦广视野显微镜实时监测活体小鼠微循环中血栓形成过程，发现TF不仅参与血栓形成的始动过程，而且还参与血栓的不断增大以及血栓形成的整个过程，即血栓形成是循环中的TF不断覆盖在血栓表面，反复启动凝血，最终使血海带多糖L01对肾上腺素直接损伤血管内皮细胞的干预作用2007级硕士研究生学位论文栓不断增加的过程，因此，对于TF的研究是医学科研热点。TF是正常止血和血栓形成过程中的一个主要调节因子，它是一个单链跨膜的糖蛋白，属于细胞因子超家族。基因编码的前体蛋白为295个氨基酸，经过加工剪掉32个氨基酸后成为含263个氨基酸的TF蛋白。TF的结构包含3个有明显特征的区域组成部分细胞外区219个氨基酸、单一跨膜区23个氨基酸和一个短的胞质段21个氨基酸，与FVII结合位点位于胞外区。TF表达于各种正常组织中，如脑、肺、胎盘、肝、脾、肾、皮肤以及粘膜等重要器官巨噬细胞、成纤维细胞、血管外膜、部分上皮细胞，而其中以脑、肺和胎盘组织中含量最为丰富。生理状态下大部分血管内膜以外的组织细胞如血管外膜、平滑肌细胞、成纤维细胞均可固有性地表达TF抗原和MRNA。循环中的是否含有以及是否能启动凝血尚存在争议，循环中的吓主要来源于血液中的一些细胞成分，单核细胞MNC是最早发现能够表达TF的细胞，也是目前惟一被公认能自身合成TF的细胞。现在已经确定嗜酸性粒细胞也表达，可能与嗜酸性粒细胞增多症血栓倾向有关【18】。但是在正常情况下，TF在与血管接触的内皮细胞表面含量甚微，活性很低。因此，TF不与循环血液接触，以保持血液流动流畅，维持血液循环功能正常，只有当血管壁受损，内膜结构裸露，内皮功能紊乱，内皮细胞在刺激因素作用下释放和表达大量TF。多种因素参与调节内皮细胞合成和表达TF，包括促炎性细胞因子如耵师Q，IL1P等、胺类如5羟色胺、组织胺等和生物介质如VEGF、凝血酶、OXLDL等【191，以及在内皮细胞WEIBELPALADE体中表达的粘蛋白P选择素也能诱导TF在内皮细胞中表达释放TF。目前血管紧张素ANGII能刺激内皮细胞表达TF已得到证实【201。在这些刺激因素中，VEGF和TNF0【发挥主要作用。内皮细胞表达的TF暴露于循环血液，和血浆中的F结合，并使FVIIA的活性增强1000倍，在CA2存在下加速FVIIA活化FX，同时活化FIX。FXA又反馈性海带多糖L01对肾上腺素直接损伤血管内皮细胞的干预作用2007级硕士研究生学位论文地活化FVU变成FVIIA，内皮细胞、F和FIX加速这一反馈过程。这些过程最终导致凝血酶产生，凝血酶进而催化纤维蛋白原转变成纤维蛋白并聚合成纤维蛋白血块。临床上与许多疾病如败血症、癌症及其动脉粥样硬化疾病都与TF的高表达有关12122。而常见的冠心病、心肌梗死以及脑梗死等血栓性疾病的发生、发展均与凝血机制异常、血管内皮细胞功能受损和单核细胞表达TF增加引起的病理性血栓形成有关。TF抗原、TF活性和TFMRNA已被证实存在于粥样斑块中的不同细胞中，包括内皮细胞、血管平滑肌细胞SMCS，尤其是富含脂质的泡沫细胞。斑块的凝固活性和血栓形成于其TF含量直接相关。是造成冠状动脉粥样硬化斑块不稳定的重要因素之一【231。有资料表明脑血管病的基本病理表现为动脉粥样硬化，其斑块中含有大量TF，其粥样斑块发生破裂，泡沫细胞及其碎片即可释放TF入血【24】，这可能是急性脑梗死发病时血浆TF水平增高的重要原因。因此，观察血管内皮细胞TF的表达与调控因素，在医学上有着重要意义。目前，很多的研究都从TF着手评价以及研究抗血栓药物。SONE25】等报道，他汀类药物辛伐他20MGD治疗有高胆固醇血症的冠心病患者14周后，活性明显低于用药前，治疗前的TF活性与治疗后的变化率高度负相关仁O482，P0005。路一平，邱健【26】的研究显示，在高血糖、高血脂的情况下，阿托伐他汀不仅能够调节血脂，还具有不依赖降脂作用的抗血栓、抗炎作用，可有效地降低主动脉TFMRNA的水平、稳定斑块，对糖尿病大血管病变的发生、发展起到一定的防治作用。大量实验表明，许多植物来源的单体化合物具有抗血栓的形成的作用，而且毒副作用较小，因此，开发纯天然的抗血栓药物是目前研究新型抗血栓药物的有效途径。中药成分肉桂酸CD蹦通过抑制对转录因子NFKB活化而发挥抑制TNF伐诱导内皮细胞TF表达的作用【271，TNFA诱导内皮细胞表达主要涉及到蛋白激酶CPKC、蛋白酪氨酸激酶PTK、丝裂素活化蛋白激酶MAPK等海带多糖L0对肾上腺素直接损伤血管内皮细胞的干预作用途径，其最后环节是通过NFRBIR,B实现的。熊石龙等研究表明川芎嗪也能抑制TNF0【诱导的内皮细胞TF促凝活性、抗原以及TFMRNA表达，而且这种作用呈剂量和时间依从性【281。姜黄素CUR可以有效抑制LPS诱导的MNC的TF的表达，这种作用与CUR加入的时间有关，呈现明显的预防作用291。丝虫抗凝蛋白NAPC2通过与FXA或FX结合，从而干扰TFVIIA的催化作用，II期临床试验已经证明在冠状动脉血管成型术中，NAPC2与阿司匹林、氯吡格雷、肝素联合使用可以安全有效地抑制凝血酶的生成。本试验结果也显示，海带多糖L01能减少内皮细胞TF蛋白的表达。在低剂量浓度的海带多糖L01作用下，TF蛋白内皮平均灰度值的表达较肾上腺素组高，免疫组化染色较肾上腺素组棕褐色着色较浅，低剂量海带多糖L01组与肾上腺素组比较，P001，而高剂量海带多糖L01能进一步抑制TF蛋白的表达，内皮平均灰度值进一步升高，免疫组化染色呈淡黄色肾上腺素组，低剂量海带L01组、高剂量海带多糖L01组比较，P001但高剂量L01组与低剂量L01组之间差别无统计学意义。说明海带多糖L01抗凝作用与其抑制血栓形成过程中RRF蛋白的表达有关，具体机制还需进一步研究。依诺肝素通过增强抗凝血酶、HCII对XA等因子的灭活起抗凝作用。此外，肝素样物质对VEC具有保护作用，陈兆荣等用扫描电镜技术，发现肝素能够拮抗注射去甲肾上腺素引起的家兔动脉形态学改变【30】。在本实验中，依诺肝素与肾上腺素混合后被注入游离的血管段，作用25RNIN后被洗去，不与血液接触，因而其抗血栓作用与抗凝无关，而与保护VEC有关。TFPI组织因子途径抑制物是TF内源性抑制因子，可抑制XA及VLLATF复合物，从而特异抑制TF介导的血栓形成过程。无肝素刺激时，TFPI与血管内皮表面的多聚葡胺结合。大量报道证明，肝素抗凝作用与动员结合在内皮细胞的TFPI释放有关。肝素可与TFPI结构中羧基端的氨基酸结合。注射肝素后，肝素与TFPI竞争内皮细胞结合位点，使其释放TFPI，海带多糖L01对肾上腺素直接损伤血管内皮细胞的二F预作用促进TFPI抑制FVIIA，与FXA更高效结合，发挥抗凝作用【3L】。正常人静脉注射肝素后2“3MINTFPI即可升高，随着肝素浓度下降，TFPI也降低。也有研究显示，肝素能在转录水平抑制内皮细胞和单核细胞TFMRNA的表达132。最新研究也显示，肝素可抑制炎症介质脂多糖诱导的内皮细胞TF活性、抗原及MRNA表达P对。在本实验中，依诺肝素组能减少TF蛋白的表达，TF蛋白内皮平均灰度值的表达较肾上腺素组高，免疫组化染色染色着色明显变浅，提示依诺肝素对抑制血栓形成的作用于与抑制TF蛋白的表达有关，具体作用途径以及依诺肝素对TFPI的影响还需进一步实验研究。前期研究表明L01具有抗血栓作用，此作用不仅与其抗凝有关，也与其保护内皮细胞有关，本研究从另一角度支持这一结论。结果表明，肾上腺素可直接损伤VEC结构完整性，打破其抗凝血与止血功能的平衡，易造成血管栓塞。而海带多糖L01能够保护VEC结构完整性，减少TF表达，使血液中的凝血因子和血小板不易被激活，有效地抑制血栓的形成，在心血管疾病的防治上显示出一定价值的研究意义。海带多糖L01对肾上腺素直接损伤血管内皮细胞的干预作用2007级硕士研究生学位论文结论1利用。肾上腺素直接损伤家兔股动脉可以成功地复制动物血栓模型。2海带多糖L01对。肾上腺素引起的内皮细胞损伤具有保护作用。3海带多糖L01能够通过保护VEC结构完整和维护VEC抗凝血功能，表现为减少内皮细胞邛蛋白表达，并使血栓形成时间延长。海带多糖L01对肾上腺素直接损伤M管内皮细胞的干预作用2007级硕1二研究生学位论文参考文献【1】SUMPIOBE，RILEYJT,DARDIKACELLSINFOCUSENDOTHELIALCELLJINTJBIOCHEMCELLBIOL，2002，3415081512【2】MALYMA，TOMASOVP，HAJEKPETA1THEROLEOFTISSUEFACTORINTHROMBOSISANDHEMOSTASISJPHYSIOLRES，2007，56685695【3】谢露，庞辉，刘爱群等海带胞壁多糖对血栓和血小板功能的影响J】中国病理生理杂志，2004，20132543【4】谢露，黎静，刘爱群海带多糖L01抑制血小板活性与血管内皮细胞保护作用阴中国病理生理杂志，2007，2346746775】BOORPJ，TRENTMB，LYLESGA，ETCMETHYLAMINEMETABOLISMTOFORMALDEHYDEBYVASCULARSEMICARBAZIDESENSITIVEAMINEOXIDASEJTOXICOLOGY,1992，7332512586YUPH，LAICT,ZUODMFORMATIONOFFORMALDEHYDEFROMADRENALINEINVIVO；APOTENTIALRISKFACTORFORSTRESSRELATEDANGIOPATHYJNEUROCHEMRES，1997，225615620【7】NAPOLIC，DENIGRISF,WILLIAMSIGNARROS,ETA1NITRICOXIDEANDATHEROSCLEROSISANUPDATEJNITRICOXIDE，2006，15262798WAIDOWT，WITTW，WEBERE，ETCNITRICOXIDEDONORINDUCEDPERSISTENTINHIBITIONOFCELLADHESIONPROTEINEXPRESSIONANDACTIVATIONINENDOTHELIALCELLSJNITRICOXIDE，2006，15103113【9BOHMF,PERNOWJ,THEIMPORTANCEOFENDOTHELIN一1FORVASCULARDYSFUNCTIONINCARDIOVASCULARDISEASEJCARDIOVASCRES，2007，76818【10】彭黎明，邓承祺现代血栓与止血的实验室检测及其应用【M】北京人民卫生出版社20048【1L】王振义，李家增，阮长耿血栓与止血基础理论与临床M】3版上海上海海带多糖L01对肾上腺素直接损伤血管内皮细胞的干预作用2007级硕七研究生学位论文科学技术出版社，20042112GARYHGIBBONSENDOTHELIALFUNCTIONASADETERMINANTOFVASCULARFUNCTIONANDSTRUCTURE，ANEWTHERAPEUTICTARGETJAMJCARDI011997，795131713】谢露，刘爱群，黎静，等海带多糖对肾上腺素致血管内皮损伤的防护作用中国应用生理杂志J】，2007，232143146【14】刘爱群，谢露，龙敬伦海带多糖对内皮细胞的保护作用【J】，中国公共卫生，2008，3334336【15SAITOYNISHIOK，YOSHIDAYETA1CYTOTOXICEFFECTOFFORMALDEHYDEWITHFREERADICALSVIAINCREMENTOFCELLULARREACTIVEOXYGENSPECIESJTOXICOLOGY,2005，21023235245【16】YUPH，WRIGHTS，FANEH，LUNZR，GUBISNEHARBERLEDPHYSIOLOGICALANDPATHOLOGICALIMPLICATIONSOFSEMICARBAZIDESENSITIVEAMINEOXIDASEJBIOCHIMBIOPHYSACTA，2003，164712193199【17】MOFE，MUNTEANAG，CHENCC，ETA1CYR61CCN1ISESSENTIALFORPLACENTALDEVELOPMENTANDVASCULARINTEGRITYJMOLCELLBIOL，2002，222487098720【18MOOSBAUERC，MORGENSTERNE，CUVELIERSL，ETA1EOSINOPHILSAREMAJORINTRAVASCULARLOCATIONFORTISSUEFACTORSTORAGEANDEXPOSUREJBLOOD，2007，10939951002【19】STEFFELJ，LUSCHERTF，TANNERFCTISSUEFACTORINCARDIOVASCULARDISEASESMOLECULARMECHANISMSANDCLINICALIMPLICATIONS【J】CIRCULATION，2006，11372273120】HEM，HEX，XIEQ，ETA1ANGIOTENSINIIINDUCESTHEEXPRESSIONOFTISSUEFACTORANDITSMECHANISMINHUMANMONOCYTESJTHROMBRES，2006，117579590海带多糖LOI对肾上腺素直接损伤血管内皮细胞的干预作用2007级硕士研究生学位论文【21NADIRY，BRENNERB，ZETSERA，ETA1HEPARANASEINDUCESTISSUEFACTOREXPRESSIONINVASCULARENDOTHELIALANDCANCERCELLSJTHROMBHAEMOST，2006，4112443245122】STEFFELJ，LUSCHERTF，TANNERFCTISSUEFACTORINCARDIOVASCULARDISEASESMOLECULARMECHANISMSANDCLINICALIMPLICATIONSJCIRCULATION，2006，1135722731【23】MACKMANNROLEOFTISSUEFACTORINHEMOSTASIS,THROMBOSIS，ANDVASCULARDEVELOPMENTJ】ARTERIOSCLERTHROMBVASCBIOL，2004，2461015102224JANDDERS,SITZERM，WENDTA，ETA1EXPRESSIONOFTISSUEFACTORIN11IGHGRADECAROTIDARTERYSTENOSISASSOCIATIONWITHDESTABILIZATIONJSTROKE，2001，324850854【25SONJW，KOH，AHNJY，JINDK，ETA1EFFECTOFSTATINONPLAQUESTABILITYANDTHROMBOGENICITYINHYPERCHOLESTEROLEMICPATIENTSWITHCORONARYARTERYDISEASEJINTJCARDIOL，2003，8817782【26】路一平，邱健，阿托伐他汀对鼠糖尿病动脉粥样硬化主动脉组织因子表达的影响J】实用医学杂志，2006年第22卷第9期9981000【27李小飞，文志斌，何晓凡等，肉桂酸对肿瘤坏死因子诱导血管内皮细胞组织因子表达的作用及其机制【J】血栓与止血学，2004年第10卷第4期14815128】熊石龙，文志斌，王前等川芎嗪对肿瘤坏死因子致血管内皮细胞组织因子表达的影响J】中国现代医学杂志，2007年10月第17卷第19期，23302333【29何美霞，曾进胜，连亚军等姜黄素对单个核细胞组织因子表达的影响【J】血栓与止血学，2005年第11卷第4期，150153【30】陈兆荣，吴葆杰F氐效价肝素对兔动脉内皮细胞的影响【J】山东医科大学学报，1986，241293130海带多糖LOI对肾上腺素直接损伤血管内皮细胞的干预作用2007级硕士研究生学位论文31】ZHIYIYE，TAKANOR，HAYASHIKSTRUCTURALREQUIREMENTSOFHUMANTISSUEFACTORPATHWAYINHIBITORTFPIANDHEPARINFORTFPIHEPARININTERACTIONJTHROMBRES，1998，8926327032】PEPEG,GIUSTIB，ATTANASIOM，ETA1TISSUEFACTORANDPLASMINOGENACTIVATORINHIBITORTYPE2EXPRESSIONINHUMANSTIMULATEDMONOCYTESISINHIBITEDBYHEPARINJSEMINTHROMBHEMOST，1997，2313514133VIGNOLIA，MARCHETTIM，BALDUCCID，ETA1DIFFERENTIALEFFECTOFTHELOWMOLECULARWEIGHTHEPARINMDALTEPARIN，ANDUNFRACTIONATEDHEPARINONMICROVASCULARENDOTHELIALCELLHEMOSTMICPROPERTIESJHAEMATOLOGICA，2006，9120721431海带多糖L01对肾上腺素直接损伤觑管内皮细胞的干预作用2007级硕士研究生学位论文综述组织因子在血栓性疾病中的研究进展摘要组织因子TF属于细胞因子超家族成员，是一种单链跨膜糖蛋白，是凝血因子VIIA与凝血因子VII的受体，凝血因子VIIA的辅因子。冠心病CHD、脑梗死CI、糖尿病合并血管病变是临床上常见的血栓性疾病。血栓性疾病血栓形成基本上是由TF与FVII结合引起外源性凝血途径启动。文章重点探讨TF特性以及在血栓性疾病中的表达，以及在血栓形成中的作用和研究进展。关键词组织因子，血栓形成，动脉粥样硬化血栓栓塞性疾病为临床常见病，严重威胁着人类的生命和健康。动脉粥样硬化AS是冠心病CHD、脑梗死CI、糖尿病合并血管病变的病理基础。研究表明AS的细胞与非细胞成份中均含有TF其中以无细胞的脂质核最为丰富。而大多数的人AS斑块的凋亡细胞和微粒中的高密度区域中也表达TFTLL。斑块破裂后，斑块内TF与循环血液接触，启动凝血级联反应，促进血栓的形成。因此，TF被认为是一种新的动脉粥样硬化血栓形成疾病的药物靶目标。本文将就TF在血栓性疾病中的表达，以及在血栓形成中的作用综述如下。1TF的一般特性11TF的来源与结构TF是由位于1号染色体的LP2223位点的124KB的基因编码的，该基因由6个外显子和5个内含子组成。外显子1编码信号肽，外显子2编码239，外显子3编码40105，外显子4编码106165，外显子5编码166218，外显予6编码219263。此外，在由其前体蛋白转化为成熟TF过程中还去海带多糖LOI对肾上腺素直接损伤血管内皮细胞的干预作用2007级硕士研究生学位论文掉32个残基诱导序列【2】。TF是一种47KD的跨膜单链糖蛋白，在CD系统为CDL42。人TF含263个氨基酸，它包括三个结构域胞外区1219，跨膜区220242，以及胞浆区243263。胞外区有两个双硫键，其中CYSL86CYS209是TF与FVII结合及其复合物的活性所必须的结构，参与凝血过程并涉及信号转导。胞质段CYS245通过硫酯键与棕榈酸或硬脂酸发生结合，并且在CYS245附近有4个碱性氨基酸残基，它们的带正电基团与膜磷脂带负电基团相互作用，这均有利于TF锚定在胞膜上。胞质尾在信号传递中起着重要的作用。12TF的分布在生理情况下，除与血液直接接触的血细胞和内皮细胞外，其余大部分组织细胞均表达TF尤以血管外膜、器官包膜、皮肤表皮及粘膜等处较为丰富，犹如袖套状围绕血管与被套状包绕器官，在体内形成一个分布广泛的止血屏障。这种分布即使循环血液不直接接触E避免血管内凝血；又使血液一旦流出血管，接触1F便立即启动凝血。THIRUVIKRAMAN【3】等用地高辛或生物素标记的因子VIIA和XA作探针来检测TF在组织和细胞的分布，研究表明TF在脑、肺和胎盘较其它部位正常组织中含量丰富。但即使在含量丰富的脑组织中，TF的含量也是极其少的，每105分子蛋白中只含有1分子的TF。血管内皮细胞与血液中的单核细胞正常时不表达TF，只有在受促炎性细胞因子与损伤因素作用时呈现诱生性表达。根据TF合成情况，体内细胞可分为三类，固有性表达TF细胞，如脑部星状胶质细胞，胎盘滋养层细胞等；不表达TF的细胞，为淋巴细胞、血小板等；诱生性表达TF细胞，如血管内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞。实验表明固有性TF表达以镶嵌蛋白形式存在，诱生性TF表达主要以小囊泡形式释放。经典的凝血学说认为，循环中无TF的存在而不能独立地启动凝血。但近年的研究却认为外周血中含有TF或含TF微粒，在特定的条件下，甚至在生理条件下，循环中的TF也能启动凝血。循环中的TF主要来自于血海带多糖L01对肾上腺素直接损伤血管内皮细胞的干预作用2007级硕士研究生学位论文液中的一些细胞成份【4】。而单核细胞MNC是最早发现能够表达TF的细胞，也是目前唯一一种被公认能自身合成邗的细胞。静息状态下，血小板中TF存储在A颗粒内，当受到刺激时，如ADP、胶原、凝血酶等作用下，血小板以微粒的形式释放TF，成为血浆中TF的主要来源之一【5】。血液中其它的细胞成分，如淋巴细胞己被证明不表达TF而中性粒细胞中是否含有TF尚存在争议。血源性的TF在启动凝血过程中的功能意义还存在很多争议，MANNANDCOLLEAGUES认为健康人血液中的TF含量极微。无法启动凝血过程而形成血栓【6。但血源性的TF在凝血过程中有着特殊的作用。首先，处于循环中的血细胞释放的TF更易于优先激活同处于循环中的凝血因子，从而引发凝血反应；其次，许多凝血因子激活的主要场所主要是血小板提供的磷脂催化表面，而且活化的白细胞也可提供磷脂表面，与血管壁来源的TF激活的凝血因子从血管壁部位弥漫到血小板表面之间的距离相比，血细胞来源TF激活的产物可在其自身提供的磷脂表面进行反应，从而大大缩短了凝血因子之间的距离，加速凝血反应进程，这可能在病理血栓快速形成过程中有重要意义81。TF抗原和MRNA主要表达在血管外膜成纤维细胞，血管中膜也有散在的分布。在生理状态下，血管内膜TF含量以及活性都很甚微，但是在病理情况下，血管受损，内皮细胞TF表达能被凝血酶、肿瘤坏死因子TNFA、血管内皮生长因子VEGF等诱导上调。13TF表达的信号转导可以引起内皮细胞表达TF的刺激因子，包括细胞因子TNFQ、IL1、IL8、LPS，生长因子如血管内皮细胞生长因子VEGF、FEG，缺氧等。其中，VEGF和TNFQ发挥主要作用。目前己知，涉及到诱导TF表达的信号转导关键酶主要有以下五种磷脂酶CPHOSPHOLIPASEC，PLC、磷脂酰肌醇3激酶PHOSPHATIDYLINOSITOL3KINASES，P13K、丝裂原活化蛋白激酶海带多糖LOI对肾上腺素直接损伤皿管内皮细胞的干预作用MITOGENACTIVATEDPROTEINKINASES，MAPK、蛋白激酶CPROTEINKINASESC，PKC、蛋白酪氨酸激酶PROTEINTYROSINEKINASE，PTKS，这些信号酶分别介导相同或者不同的信号途径。有研究证实，VEGF与内皮细胞表面受体KDR、FLT1结合后，其VEGFR2KDR二聚化、自身磷酸化，募集并活化磷脂酶C，引起细胞内钙储池的CA2释放，从而激活下游的PKCL9PLC在VEGF诱导的TF表达中为关键的信号酶。蛋白激酶C作为PLC的下游信使，PKC的活化是RAFMEKERK信号通路的上游，参与内皮细胞的增殖及血管渗透性作用。VEGF还可通过P38和细胞外信号调节激酶EXTRACELLULARSIGNALREGULATEDKINAS，ERK来诱导内皮细胞TF的表达。TNFQ可以通过MAPK中所有的三条途径P38MAPK、P4442MAPK、JNK诱导TF表达，目前认为P38MAPK和P4442MAPK所起作用较JNK重要【101。而VEGF协同TNFA诱导内皮细胞表达TF的共同交点可能在MAPK激酶MEK。近期研究可以推测出，在生理状态下，血浆中的胰岛素或胰岛素样生长因子不断激活P13K从而抑制TF的表达。除了主要的能是内皮细胞表达TF的细胞因子VEGF与TNFA外，其它细胞因子以及蛋白也能调节血管内皮细胞TF的表达。如凝血酶可以通过RHORHOK和P38MAPK途径的激活和AKT去磷酸化作用介导人内皮细胞TF的表达；组胺也可诱导内皮细胞TF，组胺由肥大细胞、T淋巴细胞、单核巨噬细胞、内皮细胞和聚集的血小板分泌。入AS斑块上的内皮细胞和平滑肌细胞可表达HL受体，JAN11】等发现，在血管细胞中，组胺可通过P38MAPK、ERK及JNK介导H1受体诱导内皮细胞表达TF。组胺可以通过H1受体诱导内皮细胞表达P选择素和NOS，它也可以刺激平滑肌细胞增殖，对AS的发生发展有重要的影响。内皮细胞表达下调是通过磷脂酰肌醇激酶PHOSPHATIDYLINOSITOL3KINASE，P13K通路来实现的，P13K激活可导致其下游AKT活化。AKT通过激海带多糖LOI对肾上腺素直接损伤血管内皮细胞的干预作用2007级硕匕研究生学位论文活其下游各种效应器来影响细胞功能，它可活化内皮一氧化氮合酶ENDOTHELIUMNITRICOXIDESYNTHASE，ENOS，促进一氧化氮产生NITRICOXIDE，NO产生，而NO是一个强有力的血管舒张剂，能够一直平滑肌细胞增殖和血小板聚集，也能抑制TF在巨噬细胞和平滑肌细胞中的表达。而VEGF以及TNF0【能抑制P13K和其下游AKT而使内皮细胞1F表达增加。14TF在血液凝固中的作用当血管损伤或者血管内皮和单核细胞受到一些因素如细菌内毒素、肿瘤坏死因子等刺激时，TF与血液接触，并作为FVII和或FVIIA的受体与其形成复合物，使无活性的FVII变成有活性的FVIIA，FVIIA使FX转变为有活性的FXA，进而使纤维蛋白原变为纤维蛋白，完成外源性凝血途径。同时，FVIIA与组织因子形成的复合物能使FIX激活成FIXA，从而使外源性凝血途径与内源性凝血途径联系起来【12】。此外，由于血小板表面含有TF，其活化后本身能够形成一个纤维蛋白生成体系不断生成纤维蛋白，从而可以稳定和巩固新形成的血栓，血小板TF可以促使整个凝血过程发生在细胞表面，促进了纤维蛋白的不断生成【13】。15TF的信号转导功能近来研究表明，TF细胞信号转导功能有两种机制1依赖于因子VIIA的蛋白水解活性的信号转导功能【14】。FVIIA与细胞膜上TF结合引起细胞内反应，使表达TF的细胞内钙浓度改变、短暂胞内蛋白磷酸化。细胞外TF因子A信号可激活P4442丝裂原活化蛋白激酶MITOGENACTIVATEDPROTEINKINASE，MAPK，同时也可导致P38MAPK和CJUN氨基末端激酶CJUNTERMINALNH2KINASE，JNK两条通路上关键部分的磷酸化，从而诱导促炎细胞因子、生长因子和转录因子的表达。同时，TF因子VIIA通过G蛋白耦联蛋白酶激活受体2GPROTEINCOUPLED，PROTEASEACTIVATEDRECEPTOR2,PAR2，促进肿瘤和血管的生长【15】。HJORTOEGM等证实PAR2特异抗体能阻断FVIIA诱导的乳腺癌细胞迁移和IL8基因表达。这说明TF的信号转导与海带多糖L01对肾上腺素直接损伤血管内皮细胞的干预作用2007级硕士研究生学位论文PAR2的活化有关。在肿瘤细胞、成纤维细胞或角质化细胞上的TF与因子A结合可使VEGF、早期生长反应基因LEARLYGROWTHRESPONSEGENEL，EGR1和24以及IL8表达增加。有证据表明在角质化细胞上，邗与因子VIIA的结合可使一些损伤修复相关的基因表达上调。2依赖于TF胞质区的信号转导功能。近来研究表明TF的胞质区可能与核因子KB的激活及促炎细胞因子产物的产生有关。TF胞浆区可能通过调节TFVIIA诱发的信号而间接影响细胞信号传递。也有研究表明TF胞质区可能间接调整TF因子VIA介导的细胞信号转导，AHAMED掣1刀研究显示TF因子A因子XA通过激活PAR2诱导TF胞质区磷酸化，而这种TF胞质区磷酸化对PAR2介导的血管发生起负性调节作用具体机制不明。OTT等发现邗的刺激细胞迁移的功能是通过TF胞质区激活鸟苷三磷酸酶LGTPASEL，RACL和P38MAPK，而不依赖于FVIIA蛋白水解活性。16TF的非凝血功能目前，已有很多资料表明，TF还具有许多非凝血的功能。主要包括以下几个方面TF与恶性肿瘤。恶性肿瘤中通常存在邛于VEGF的高度表达，TF能促进肿瘤血管的新生。1F影响胚胎发育，剔除TF基因可以导致胚胎死亡，TF与胚胎血管的发育有关。TF可以上调多种促炎性蛋白，与败血症以及DIC的发生有关。同时，TF还可以促进平滑肌的增殖与迁徙。TFVIIA也可促进血管平滑肌增殖与迁徙。1F的这些非凝血功能几乎都是通过TFVLLA做作用于蛋白酶活化受体PAR2实现的。信号转导途径较为复杂，但主要是与MAPK和P13KPKB两个途径有关，这些途径最后激活EGR1核转录因子，引起多个基因转录，包括促炎细胞因子、生长因子、转录调节因子等，从而引起非凝血功能。2TF与血栓性疾病21TF在血栓性疾病中的表达211TF在内皮细胞的表达海带多糖LOI对肾一I腺素直接损伤血管内皮细胞的干预作用当内皮细胞如冠状动脉，脑动脉等血管内膜受到损伤后，内膜结构裸露，内皮功能紊乱，在内皮细胞WEIBELPALADE体中表达的粘蛋白P选择素也能诱导TF在内皮细胞中表达释放TF。P选择素和TF的相互作用通过位于血液与动脉内膜界面的CD40CDL54受体相互作用而加速纤维蛋白单体的沉积。同时，血管紧张素IIANGII与ANGII型受体结合，诱导细胞内的氧化应激反应，NFKB和API激活，刺激内皮细胞表达1F【181因此，伴有血浆ANGII增高的患者血液促凝活性更高，从而当合并内皮细胞损伤时，引起血栓的形成。此外，氧化型低密度脂蛋白OXLDL也能有效地诱导内皮细胞表达TFTL9】212TF在单核巨噬细胞的表达AS斑块中的耶主要来源于巨噬细胞、血管平滑肌细胞、泡沫细胞、尤其是泡沫细胞最多。单核细胞浸润至血管中膜层，转变成巨噬细胞和泡沫细胞。细胞外的脂质也有活化的1F。人体AS斑块中的许多炎性介质如肿瘤坏死因子一A、白介素1、以及动脉损伤、血流动力因素等可诱导或上调TF的表达【201。单核巨噬细胞在收到炎性因子如肿瘤坏死因子仅TNFQ和脂质OXLDL、脂多糖LPS、动脉损伤等刺激都表达TF。巨噬细胞在表达吓的同时还表达因子，TF含量与泡沫细胞、巨噬细胞和淋巴细胞凋亡释放的包含邗的微粒有关。动脉粥样硬化斑块的不同部位的巨噬细胞都发现了TF的过度表达。研究表明，脂质丰富的粥样斑块比纤维斑块TFMRNA和蛋白表达水平要高，主要是由于粥样斑块内含有大量的巨噬细胞【2L】。巨噬细胞转化成泡沫细胞后，TF的表达较巨噬细胞有显著地增加，这表明巨噬细胞转化为泡沫细胞后，血栓形成能力进一步加强，这也是斑块破裂后血栓并发症频繁发生的原因之一【22】。TF在细胞表面发挥功能，其活性高度依赖于磷脂酰丝氨酸PHOSPHATIDYLSERINE，PS的存在，活化的TF可以促进血管新生和平滑肌细胞迁移，与斑块的增长及稳定性有关。另外，脂质含量丰富的脆性斑块带有薄纤维帽、广泛巨噬细胞浸润和大量的海带多糖L01对肾上腺素直接损伤血管内皮细胞的干预作用2007级硕E研究生学位论文TF表达，比含胶原丰富的纤维性斑块更易破裂。22TF为血栓性疾病的危险因子冠心病CHD、脑梗死CI、糖尿病是威胁人们生命健康的重要的血栓性疾病。动脉粥样硬化是血管系统疾病的主要病理基础。现代细胞分子生物学技术显示，动脉粥样硬化病变都具有平滑肌细胞增生，大量胶原纤维、弹力纤维和蛋白多糖等结缔组织基质形成，以及细胞内外脂质积聚的特点。病变常累及弹性及大中等肌性动脉，一旦发展到足以阻塞动脉腔，则该动脉所供应的组织或器官将缺血或坏死。以往的研究人为AS引起的冠状动脉管腔进行性狭窄是由于斑块中平滑肌细胞SMC持续增生而引起的。但现在的研究表明，大多数发生梗塞的病例是因斑块表面形成血栓，从而使冠状动脉闭塞。同时，AS的发展与慢性炎症过程密切相关，因为OXLDL不仅通过清道夫受体给MOMC输送胆固醇以促进泡沫细胞的形成，而且本身作为促炎因子引起免疫性炎症反应，促炎物质N旺一Q、MCP1、IL一113等与OXLDL刺激MOMC与泡沫细胞TF的表达上调，致使AS斑块中心富含TF在AS进程的各个阶段都有表达。粥样硬化斑块的内皮细胞以及巨噬细胞表面均可以检测到TF，而表达最为丰富的是粥样斑块的脂质核心，在动脉粥样硬化斑块中，脂核内TF染色比斑块的其它部分强，在该区域发现血小板和纤维蛋白沉积水平比其它部位高，而其脂核内血栓形成的潜力是斑块细胞部分的6倍【2引。这表明斑块是否易于形成血栓与脂核TF含量直接相关。很多粥样斑块状态不稳定，一旦斑块在基质金属蛋白酶特别是MMP9作用下，AS破裂。粥样斑块破裂后，粥样斑块中的TF暴露于血液中，与血液中的凝血因子结合，从而启动内外源性凝血途径，激活纤维蛋白原，以及形成凝血酶。引起斑块表面血栓的形成，阻塞血管。研究发现，在斑块的形成过程中，血浆TF特异性的促凝活性不断升高，这说明在AS病变的早期就有TF的活化以及释放。因此认为，斑块破裂不是启动TF活性增强以及启动凝血途径的惟一海带多糖L01对肾上腺素直接损伤血管内皮细胞的干预作用必要的条件。近年来也有研究表明，在冠状动脉粥样斑块中约有14是相对稳定不易破裂的，但是斑块表面