[硕士论文精品]茶多酚对放射性颌下腺细胞凋亡与增殖的影响

茶多酚对放射性颌下腺细胞凋亡与增殖的影响茶多酚对放射性颌下腺细胞凋亡与增殖的影响摘要目的研究茶多酚TP对放射性颌下腺细胞凋亡与增殖的影响。方法70只WISTAR大鼠随机分为正常对照组N组10只、照射组R组30只、茶多酚照射组TPRN30只。R组及TPR组均予以60C07射线15GY一次性照射其头颈部，并于照射前14天至标本提取当天分别予以生理盐水R组或茶多酚TPR组灌胃；N组只灌胃生理盐水，不照射。照射结束后3天、6天、30天，R组及TPR组每组各取10只大鼠颌下腺，采用TUNEL法检测腺体细胞凋亡，统计凋亡率；免疫组织化学方法检测腺体增殖细胞核抗原PCNA、B细胞淋巴瘤白血病2BCL2及B细胞淋巴瘤白血病2关联性X蛋白BA【的表达，统计阳性率；另行透射电镜观察颌下腺组织细胞超微结构改变。结果1照射后3，65130D，R组颌下腺细胞的凋亡率均比N组显著增加P005。4透射电茶多酚对放射性颌下腺细胞凋亡与增殖的影响镜观察R组颌下腺细胞胞核异染色质增多，异染色质边集、致密度增大、核深染、发生凋亡改变，各时点的改变差异不明显；TPR组颌下腺细胞超微结构损伤较轻，细胞凋亡改变不典型。结论1茶多酚有抑制大鼠放射性颌下腺细胞凋亡的作用。2茶多酚可通过抑制细胞凋亡而影响大鼠放射性颌下腺细胞的增殖。3茶多酚对大鼠放射性颌下腺细胞超微结构的损伤有一定的保护作用。关键词放射性损伤，颌下腺，茶多酚，凋亡，增殖茎至堂型垫墅竺堡望塑丝塑主皇竺丝堕墅堕竺堡堡主兰竺堡苎THEEFFECTOFTEAPOLYPHENOLSONAPOPTOSISANDPROLIFERATIONOFSUBMANDIBULARGLANDINDUCEDBYIRRADIATIONABSTRACTOBJECTIVETOOBSERVETHEEFFECTSOFTEAPOLYPHENOLSTPINSUBMANDIBULARGLANDCELLSAPOPTOSISANDPROLIFERATIONINDUCEDBYRADIATIONINRATMETHODSSEVENTYRATSWERERANDOMLYDIVIDEDINTONORMALGROUPNGROUP10RATS、RADIATIONGROUPRGROUP30RATSANDTEAPOLYPHENOLSRADIATIONGROUPTPRGROUP30RATSRGROUPANDTPRGROUPWEREIRRADIATEDWITHASINGLEEXPOSUREDOSEOF15GYOF60COTRAYSDELIVEREDTOTHEHEADANDNECKAREATHETWOGROUPSRATSWEREINTRAGASTRICAUYADMINISTEREDWITHNORMALSODIUMRGROUPORTPTPRGROUPFROM14DAYSBEFORERADIATIONTOTHEEXPERIMENTENDEDONDAY3,DAY6,DAY30AFTERRADIATION，TENSUBMANDIBULARGLANDSWERETAKENFROMEACHGROUPSTODOEXAMINATIONTERMINALDEOXYNUCLEOTIDYLTRANSFERASETDTMEDIATEDDUTPDIGOXIGENINNICKENDLABELINGMETHODTUNELWASUSEDTOEXAMINEAPOPTOSISOFTHESUBMANDIBULARGLANDSCELLS，IMMUNOHISTOCHEMICALTECHNIQUEWASUSEDTODETECTTHEPROLIFERATINGCELLNUCLEARANTIGENPCNA、BCELLLYMPHOMALEWKMIA一2BCL2ANDBCL一2ASSACIATEDX4茶多酚对放射性颁I腺细胞凋亡与增殖的影响2007级硕士学位论文PROTEINBAXEXPRESSIONINTHEGLANDSTHEMORPHOLOGICCHANGESOFSUBMANDIBULARGLANDSWEREOBSERVEDBYTRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPYRESULTS1APOPTOSISINDEXINTHECELLSOFSUBMANDIBULARGLANDSWERESIGNIFICANTINCREASEDONDAYS3,DAYS6AND30AFTERIRRADIATIONCOMPAREDWITHNGROUP尸0054TRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPYMORPHOLOGICALCHANGESHETEROCHROMATINIZATIONOFTHENUCLEARANDTHECHANGESOFNUCLEARTENDINGTOAPOPTOSISCANBEOBSERVEREDAFTERIRRADIATIONINTHECELLSOFSUBMANDIBULARGLANDAFTERGAVAGEDWITHTP，THEGLANDINJURYAFTERRADIATIONWASALLEVIATEDBYHISTOLOGICALEXAMINATIONSTHELESIONSOFSUBMANDIBULARGLANDSINTPRGROUPWEREGENTLEFROMELECTRONMICROSCOPESTUDY，ANDTHEAPOPTOSISINCELLNUCLEARWASNOTTYPICALCONCLUSION1TEAPOLYPHENOLSHASTHEEFFECTAGAINSTIRRADIATIONINDUCEDAPOPTOSISINSUBMANDIBULARGLANDS2TEAPOLYPHENOLSCANINFLUENCETHEEXPRESSIONOFPCNAINSUBMANDIBULARGLANDSINDUCEDBYRADIATION3TPCANPROTECTTHEINJURYOFULTRASTRUCTUREINSUMANDIBULARGLANDSFROMRADIATIONLNJUNESKEYWORDRADIATIONINJURY，SUBMANDIBULARGLAND，APOPTOSIS，TEAPOLYPHENOLS，PROLIFERATION5茶多酚对放射性颌F腺细胞凋亡与增殖的影响2007级硕士学位论文英文缩写TPTEAPOLYPHENOLS英文缩略词英文全称TERMINALDEOXYNUCLEOTIDYLTRANSFERASE茶多酚中文译名TUNELTDT。MEDIATEDDUTPDIGOXIGENINNICK原位末端标记法ENDLABELINGMETHODPCNAPROLIFERATINGCELLNUCLEARANTIGENTEMBCL2TRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPYBCELLLYMPHOMALEWKMIA一2BAXBCL2ASSACIATEDXPROTEINIMRTINTENSITYMODULATIONRADIATIONTHERAPY3DCI玎增殖细胞核抗原透射电镜B细胞淋巴瘤白血病2B细胞淋巴瘤8血病2关联性X蛋白调强放射治疗NEDIII】EI】SI。NALC。NFOM谢RADIATIONT11ER印Y三维适形放射治疗独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特鬟L,JJN以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名哆I拐签字日期加，9年莎月，阳学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解广西医科大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权广西医科大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国学术期刊光盘版电子杂志社、中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国优秀博硕士学位论文全文数据库、中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。保密的学位论文在解密后适用本授权书学位论文作者签名巧5移签字日期伽睥莎月,71了导师签字彳孳乞乏导师签字之辱包久签字日期矽F洱6月F2EL茶多酚对放射性颌下腺细胞凋亡与增殖的影响上J一刖吾放射治疗是鼻咽癌等头颈肿瘤的主要治疗手段之一。在放射治疗过程中，主要的涎腺组织包被在放射治疗野内，随着近年来放射治疗技术的改进，包括调强放射治疗INTENSITYMODULATIONRADIATIONTHERAPY，IMRT、三维适形放射治疗THREEDIMENSIONALCONFORMALRADIATIONTHERAPY，3DCRT等，或多或少地保护了部分涎腺的功能1捌。但放射性涎腺损伤仍然不可避免，其导致的放射性口干燥症是头颈肿瘤患者接受放射治疗后常见的并发症，发病率几乎达100T3与】。由此引起的咀嚼、吞咽、味觉、讲话、睡眠障碍、猖獗性龋齿等严重影响了患者的身体健康和生活质量【61。至今，放射性涎腺损伤的发生机制仍未完全明确【刀，且缺乏有效的、简便易行的防治手段，是急需解决的课题。茶，是我国的“传统国饮”，具有抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗辐射等多种药理作用，其主要成分茶多酚TEAPOLYPHENOLS，TP是从天然绿茶中提取的多羟基酚类化合物的总称。近年来，有关TP的抗辐射作用已经成为研究的热点，但其对放射性涎腺损伤的防护作用在相关研究中报道较少。本实验研究大鼠头颈部受照射后其颌下腺细胞凋亡与增殖的改变，探讨茶多酚对大鼠放射性颌下腺细胞凋亡与增殖的影响及对颌下腺细胞超微结构损伤的影响。茶多酚对放射性颌下腺细胞凋亡与增殖的影响材料和方法一实验材料1实验动物WISTAR大鼠70只，体重18020G，雌性，清洁级，广西医科大学实验动物中心提供。动物质量合格证号SCXK桂20090002。2主要实验仪器病理图像分析仪德WLEIEADMRQ550型紫外分光光度计日本岛津公司超低温冰箱日本TOSHIBA钴60放射治疗仪GWXJ80型微量分析天平瑞士梅特勒一托利公司AB204E、微量移液器芬兰BIOHIT光学显微镜0910日本OLYMPUS公司透射电镜H500ET本日立公司电热恒温鼓风干燥箱上海跃进医疗器械厂1012BS压力锅日本TOMYSS325冰箱一L8一4美的孵育盒冲洗瓶本校实验中心本校实验中心茶多酚对放射性颁下腺细胞凋亡与增殖的影响免疫组化画圈笔福少LMAIXIN。BIO公司多聚赖氨酸玻片福，HMAIXINBIO公司自制大鼠固定架手术器械手术刀，剪刀，中弯钳，蚊氏钳，眼科剪，载玻片，盖玻片，注射器等。3主要实验试剂90茶多酚90TP浙江太阳绿宝茶多酚公司提供附有产品合格证书和纯度鉴定证书细胞凋亡TUNEL检测试剂盒CATN。168三817美国ROCHE公司PCNA多克隆抗体ZM0213购自北京中杉金桥生物公司BCL2多克隆抗体SC783SANTACRUZ产品BAX多克隆抗体SC493SANTACRUZ产品即用型免疫组织化学ELIVISI。NTMSP试齐IJ盒HMAIXINBIO公试剂盒组成、B籼。内源性过氧化物酶阻断剂ENDOGENOUSPEROXIDASEBLOCKING试剂A、SOLUTION试剂B动物非免疫血清NORMALNONIMMUNONESERUM试剂C生物素标记的第二抗体BIOTINCONJUGATEDSECONDANTIBODY试剂D链霉素抗生物素蛋白一过氧化酶STREPTAVIDINPEROXIDASE磷酸盐缓冲液PH7274粉剂福州MAIXINBIO公司柠檬酸盐抗原修复液PH60粉剂福州MAIXINBIO公司茶多酚对放射性颌下腺细胞凋亡与增殖的影响液体DAB酶显色试剂盒苏木素HARRIS中性树胶蛋白酶K羊血清原液小牛血清白蛋白戊巴比妥钠粉剂福州MAIXINBIO公司福州MAIXINBIO公司本校实验中心购自南宁恒因生物公司购自南宁恒因生物公司购自南宁恒因生物公司沃凯国药集团化学试剂有限公司二实验方法1动物分组WISTAR大鼠70只，普通饲料喂养，清洁饮水，生长情况良好。按随机分组的原则将其分为正常对照组N组10只、照射组R组30只、茶多酚照射组TPR组30只。适应性喂养一周后开始实验。动物饲养合格证号SYXK桂20090004。2给药方式与时间TPR组予以5，029KGTP灌胃，R组予以生理盐水1M1灌胃，N组予以生理盐水1M1灌胃。给药时间为照射前14天至标本提取当天。给药时间均为每日9AM11AM。3照射方式与剂量予以60C吖射线照射。给药第15天，除正常对照组外，其余二组大鼠用1戊巴比妥钠4060MGKG腹腔注射麻醉后，将其仰卧固定于治疗板上，暴露头颈部于照射野中，下至锁骨。设野大小为115MMX40MM，距皮源80CM，一次性予以15GY照射。茶多酚对放射性颁卜腺细胞凋亡与增殖的影响4标本提取照射结束后第3天、第6天、第30天，R组和TPR组每组各取LO只大鼠，分别记为R3D，R6D，R30D，TPR3D，TPR6D，TPR30D。麻醉后取其颌下腺迅速固定于PH74、4多聚甲醛中，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片4UM，备用。每组各取一例标本行透射电镜观察。5免疫组织化学染色51收取标本后即用40O多聚甲醛固定。52将收集的标本送病理科作石蜡包埋，采取连续切片，片厚4UM，置于多聚赖氨酸防脱片上。53石蜡切片置于电热恒温鼓风干燥箱中，65下3小时。54每张切片HE常规染色。55免疫组化采用ELIVISION聊SP法，步骤如下石蜡切片从烤箱中取出，立即经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化，用PBS冲洗3次，每次3分钟。将装入一定量柠檬酸盐抗原修复缓冲液PH6的塑料槽放入高压锅的水中煮沸，将组织切片置于耐高温的塑料切片架上，放入已经煮沸的缓冲液塑料槽中，缓冲液要盖过所有玻片，盖上盖子，高压至喷气。从喷气开始记时，10分钟后，除去热源，冷却至室温，取出玻片先用蒸馏水冲洗2次，然后用PBS冲洗2次，每次3分钟。甩去PBS液，每张切片滴加50TL内源性过氧化物酶阻断剂试剂A，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育15分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟。甩去PBS液，每张切片滴加501AL动物非免疫血清试剂B，室温下孵育1O分钟。甩去血清，不冲洗，每张切片滴加50TL第一抗体PCNA工作液浓度为LN茶多酚对放射性颌下腺细胞凋亡与增殖的影响1500，BCL2工作液浓度为1300，BAX工作液浓度为1300，4。C过夜后在室温下复温30分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟。甩去PBS，每张切片滴加50TL生物素标记的第二抗体试剂C，室温下孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟。甩去PBS，每张切片滴加509L链霉素抗生物素蛋白过氧化酶试剂D。室温下孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟。甩去PBS，每张切片滴加100ML新鲜配置的DAB显色液，显微镜下观察35分钟，阳性显色为棕色。自来水冲洗，苏木素复染，01盐酸分化，自来水冲洗，PBS反蓝。切片干燥后，用中性树胶封片。6原位末端标记法TUNEL收取标本后即用4多聚甲醛固定。将收集的标本送病理科作石蜡包埋，采取连续切片，片厚4URN，置于多聚赖氨酸防脱片上。石蜡切片置于电热恒温鼓风干燥箱中，65下3小时。石蜡切片从烤箱中取出，立即经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化，用PBS冲洗3次，每次3分钟。甩去PBS，将切片浸入3过氧化氢甲醇溶液中封闭30分钟。甩去过氧化氢，用PBS冲洗5次，每次5分钟。甩去PBS，每张切片滴加50I_TL的蛋白酶K2099M1，置于湿盒里，37温箱中孵育20分钟，用PBS冲洗3次，每次5分钟。甩去PBS，每张切片滴加50I_TL20羊血清和3小牛血清白蛋白，37温箱中孵育30分钟。甩去血清，用滤纸吸干标本周围的水分，每张切片滴加50山LABLE，置于湿盒里，37温箱中孵育60分钟，用PBS冲洗3次，每次5分钟。茶多酚对放射性颌F腺细胞凋亡与增殖的影响甩去PBS，每张切片滴加509LPOD，置于湿盒里，37温箱中孵育30分钟，用PBS冲洗3次，每次5分钟。甩去PBS，每张切片滴加509L20羊血清和3小牛血清白蛋白，37。C温箱中孵育30分钟，用PBS冲洗3次，每次5分钟。甩去PBS，每张切片滴加100ML新鲜配置的DAB显色液，显微镜下观察35分钟，阳性显色为棕色。自来水冲洗，苏木素复染，O1盐酸分化，自来水冲洗，自来水反蓝。切片干燥后，用中性树胶封片。7透射电镜标本的制作与观察标本提取在O4。C下迅速取出标本1X1LMM3，迅速固定于25戊二醛中，固定时间12H，O1MOLL缓冲液漂洗3次，锇酸固定，缓冲液漂洗，梯度乙醇脱水，丙酮脱水，包埋剂浸透包埋，超薄切片，染色。透射电镜下观察腺体超微结构改变并加以比较。8结果判定TUNEL、PCNA阳性表达位于细胞核；BCL2、BAX阳性表达位于胞膜和胞浆，均为棕黄色着色，在10X40视野下，每张切片随机挑选5个不重复视野计数阳性细胞数量包括腺泡细胞和导管细胞，计算每张切片的平均阳性率。9统计学处理计量资料数据用XS表示，多个样本均数之间的差异比较运用单因素方差分析ONEWAYANNOVA，组间之间的两两比较运用STUDENTNEWMANKEULSSNK检验，运用SPSSL30统计分析软件进行统计学分析，检验水准AO05。茶多酚对放射性颌F腺细胞凋亡与增殖的影响让甲当日7卜1原位末端标记法TUNEL凋亡细胞分布于导管细胞、腺泡细胞中，可见完整的细胞膜、胞浆皱缩，部分细胞核浓缩深染图2A一2。E。N组阳性率为099；R3D、R6D、R30D阳性率分别为2521、1746、1769；与N组比较差异均有统计学意义，PO05；TPR3D、TPR6D、TPR30D阳性率分别为403、344、37，TPR3D、TPR6D与相同时间段的R组相比差异有统计学意义，PO05表2。22BCL2在各组颌下腺的腺泡，导管及GCT细胞中均有阳性细胞存在，阳性反应物质主要位于胞浆和胞膜中。N组阳性率为717；R3D、R6D、R30D阳性率分别为1083、1717、20O；与N组比较差异均有统计学意义，PO05表3。23BAX在各组颌下腺的腺泡，导管及GCT细胞中均有阳性细胞存在，阳性反应物质主要位于胞浆和胞膜中。N组阳性率为767；R3D、R6D、R30D13茶多酚对放射性颌F腺细胞凋亡与增殖的影响阳性率分别为60O、65O、667；与N组比较差异无统计学意义，PO05；TPR3D、TPR6D、TPR30DLJET性率分别为517、80O、667，与相同时间段R组相比差异无统计学意义，PO05表4。3透射电镜观察正常组颌下腺细胞核膜清晰，染色质分布均匀，分泌颗粒分布均匀，呈圆形或卵圆形，线粒体发达，粗面内质网丰富，分布规则，网腔均匀。R3D线粒体肿胀，嵴肿胀变空、减少或消失，可见线粒体内外膜破裂；可以观察到较多细胞核异染色质增多，异染色质边集、致密度增大，核深染，发生凋亡改变。R6D染色质边集，核内空泡化，线粒体肿胀，可见线粒体膜破裂。R30D颌下腺细胞核固缩，染色质浓缩，线粒体肿胀，嵴消失，线粒体膜断裂，粗面内质网呈囊状扩张。TPR组细胞超微结构改变较轻，线粒体肿胀、变性较少，细胞凋亡改变不典型图3A图3F。HWBT目E月C日MM0目表1正常组照射组与茶多酚照射组各时段的凋亡率比较X鼻STABLELCOMPAREDAPOPTOTICIRIDCXOF3STAGESPOSTLNA山ADONBETWCENNGROUP,RGTOUPANDTPRGROUPFMNS1099士OL2521士47”1746E2153壮L609176924”564士20与R组相比P001；与N组相比IP001302520151050茶多酚对放射性颌F腺细胞凋亡与增殖的影响2007级硕士学位论文表2正常组照射组与茶多酚照射组各时段PCNA的表达XSTABLE2POSITIVERATEOFPCNAIN3STAGESPOSTIRRADIATIONBETWEENNGROUP，RGROUPANDTPRGROUPMEAN士S1与R组相比P00516I；MWF|R5自图2L一，、，JFO一丫卫R”一一F，J。JJ，2A照射后3天蛆11JNELX4002_AR3TUNNX400_瓣O套乒，OTO，、2C腰射后30天组TIJNEL枷2_CR1M一11MX4JD，、。R、，T，一I。一7T，。1LV2E正常姐11JNX枷R；。1，三冬。R，3釜歹；每2B茶多酚十照射后3天组11N旺LX枷2一B舢D舯ILPNJNEL400，一“。、。矿I“，、二蠢”6。”，Y。TR一一鬻曼鲤堂婪旦塑坠塑L堂型坐墼2F羲射后3天姐HMX42FP3DGRPPCNX42H臆甜后6天组PCNAX4加2HR日自WPCNAX400B，强气F，。烹口，善蠢O。一。I一ORR一，T。，2”I怒P啪CNA勰NQ哪M囊3乏0一F，。，_了麓一、二小C啼二O2。G喜勰嚣后3天组一PCNA。X400，F气二，；00蠢二T。47一SR一2I蔫多酚照射后6天蛆PCN40D2ITPR6D即UPPCNAX400，V一T_O，、O，O一V瓤R、0“MHT目F镕目M目TSM自图33A正常可见胞核舟围分黼粒2800瓷“NU“CLEU“S爱”28淼00”“。血E32R30D细胞皱结、袭色质近集X59003CR30DCELLSHRINKAGE，EHROMATINCONDENSATION59003BR6D践柱体肿胀，喑模糊不清桉内空泡样变F590013BR6DMITOCHONDRLASWELL，CFISTAEVAGUC，VACUOLARDEGENERATIONINNUCLEARWERTOBSHVEDF59003DTPR3D其中一核染色质迎桌另两棱正常59003DTPR3DOLLT，CELJSHOWEDTHEEHROMATINCHANG骼RESEMBLINGAPOPTOSISANOTHERTWOCELLSNORMALR59001目目MT目F月TBM镕E日3ER6D线柱催肿胀嵴排列紊乱、战少或消失200003ER6DMITOCHONDRIASWELL，DISORGANIZATIONANDREDUCTIONORVANISHOFTHECRTA200003FTPR6D箭头所示线粒体膜破裂，余正常X200003FTPR6DRAPTUREOFTHEMITOCHONDFI缸ARROWGTHERESTA坞NEARLLYNORMALR20000、茶多酚对放射性颌下腺细胞凋亡与增殖的影响讨论放射治疗是鼻咽癌等头颈肿瘤的主要治疗手段之一，由于头颈部肿瘤靶区与周边危及的器官和组织错综交织，传统的二维放疗和三维适形放疗基本实现不了保存唾液腺功能的目的。在放射治疗过程中，主要的唾液腺组织遭受了大剂量的辐射，因此导致了照射后唾液流率的下降以及唾液腺的组织病理学改变【101。近年来，放疗技术的改进已经相对减轻了鼻咽癌等头颈肿瘤患者放射治疗后各种组织的损伤程度【1捌，但是，唾液腺的损伤仍然难以避免，并且由其造成的放射性口干是不可逆的【111，进而引起的一系列并发症，包括咀嚼、吞咽、味觉、讲话、睡眠障碍，甚至免疫机能下降，口腔菌丛失调等，严重影响了患者的生活质量，造成其日后严重的经济和精神负担【6】。茶，是我国的传统国饮。而茶多酚是从绿茶中提取的多羟基酚类化合物的总称，约占茶叶干重的2030。TP为淡黄色至茶褐色的粉末或晶体，具有抗氧化，抗衰老，抗辐射、对癌细胞的抑制以及抗菌、杀菌等作用0316。近年来，已经有相关研究证实了其抗辐射的作用【17191，但TP的抗辐射机制仍不甚明确，因此其抗辐射的作用成为了新的研究热点。11P对颌下腺细胞凋亡的影响放射治疗引起的涎腺损伤机制至今仍然不能完全明确71。有相关学者的研究认为放射后涎腺细胞的凋亡是其损伤机制之一【9】。细胞凋亡是机体为排除不再需要或受到严重损伤的细胞所进行的有序细胞分解过程，是多细胞有机体维持内环境稳定的必要机制。在各种有机体中，细胞凋亡都具有一系列典型的形态学改变，包括染色质浓缩【251、DNA及细胞核片段化、细胞皱缩、胞浆空泡数量的增加和经粒细胞消化后凋亡小体的形成【26271。凋亡细胞在HE染色光镜下有一定的形态特征，但HE染色作为鉴定细茶多酚对放射性颌F腺细胞凋亡与增殖的影响胞凋亡仍有一定的困难。末端脱氧核苷酸转移酶介导的DUTP缺口末端标记TUNEL法是近年发展起来的观察凋亡细胞的一种简便，灵敏、快捷的新方法。末端脱氧核苷酸转移酶可以将地高辛标记的DUTPDIGDUTP标记至凋亡细胞DNA断点的3。OH末端，DIGDUTP结合在DNA断点部位，可以通过生物标记的抗地高辛抗体ANTIDIGBIOTIN反应后，再结合链酶亲和素过氧化物酶SABC，然后加入显色底物DAB予以显示。凋亡的细胞核呈黄色，从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞。本实验应用TUNEL法，在颌下腺中原位标记出凋亡细胞，可靠、直观地证明了接受头颈部15GY照射的大鼠颌下腺中存在细胞凋亡。照射后颌下腺细胞的凋亡率在3D、6D、30D这三个时间点均显著高于正常组，因此，推测细胞凋亡是放射后涎腺损伤的可能机制之一。也有学者认为细胞凋亡在涎腺早期的放射损伤中起主要作用2224】，但在本实验中，照射后30D仍然可以检测到颌下腺内较高的细胞凋亡率，考虑可能为细胞凋亡在涎腺晚期的损伤中仍然占据一定的作用，但尚需进一步的研究探讨。此外，TP治疗组的颌下腺细胞凋亡率在3D、6D、30D这三个时间段内均显著低于照射组P90天可以观察到唾液腺实质细胞空泡化、细胞水肿、核固缩、腺泡及颗粒卷曲导管的松解，最值得关注的是唾液腺组织内有散在性的单核细胞的浸润。MUHVICUREKN刚给予小鼠头颈部75GY和15GY的照射后90天光镜下观察颌下腺，发现腺泡的萎缩，腺泡数量的减少以及严重的空泡化，损伤程度与照射剂量呈正比，腺泡细胞比颗粒导管细胞的放射敏感性强，接受15GY照射的腺体组织还表现出细胞以及细胞间质的水肿，最明显的改变是出现散在性单核细胞的浸润。4唾液腺组织的凋亡与增殖唾液腺组织照射后细胞的损伤与死亡机制一直是研究的重点，至今有关的研究未能完全清楚地解释这个机制。其中，照射后唾液腺组织细胞的增殖与凋亡的改变是相关研究中的一个热点。早期，学者提出了唾液腺组织的早期损伤可能与细胞猾亡有关，认为唾液腺组织损伤早期是一种间期细胞死亡。凋亡的形态学改变是细胞质的浓缩、细胞膜的皱缩、细胞核的固缩浓染，它与细胞坏死不一样，凋亡细胞可以被体内的吞噬细胞快速清除而不引起组织内的炎症反应。最初，学者通过恒河猴照射后其腮腺组织的形态学观察，发现浆液性细胞胞核染色深、呈多种畸形改变，包括核固缩、核碎裂及边缘化等凋亡的形态改变。由于细胞的形态改变与细胞的死亡程度及炎症细胞的浸润程度不相关，因此提示唾液腺浆液性腺细胞是由于凋亡而死亡。在后继的研究中，有学者用TUNEL法检测小鼠一次性大剂量照射后颌下腺的凋亡表达，发现照射后三天凋亡细胞的表达达到高峰且有剂量依赖性N钔。BORAKS等N23还认为大鼠照射后其腮腺超微结构的改变和细胞的凋亡密切相关。LEE等N订也认为照射后大鼠颌下腺细胞发生凋亡，并且他们的研究认为HSP25和HSP70I可以有效地降低放射性颌下腺凋亡。然而，在早期的某些研究中，也有认为照射后唾液腺细胞的凋亡是低水平的，分析其原因，认为这是由茶多酚对放射性颌下腺细胞凋亡与增殖的影响于所采用的凋亡检测技术不同，早期采用较多的是组织切片HE染色形态学观察，尽管凋亡细胞在光镜下有一定的形态学特征，但是HE染色检测凋亡仍然是相对困难的，因此检出率较低。而近期的研究中所采用的检测凋亡的是原位末端标记法TUNEL和免疫组织化学方法、分子生物学方法检测凋亡通路中一些相关信号转导因子表达的改变N7191。在正常组织中，细胞增殖与凋亡是相平衡的，如果增值与凋亡失衡就会导致器官组织功能的紊乱，那么放疗后引起的唾液腺功能的减退是否也与细胞的增殖相关联呢唾液腺细胞有丝分裂活动较少，但能受适当刺激而产生分裂，闰管细胞分化成腺泡细胞。临床上高剂量照射腮腺组织4060GY，20，30次，仍可观察到腮腺功能的部分恢复，提示放射后存在着细胞增殖现象。BRALIC等N41通过免疫组化的方法检测PCNA在小鼠颌下腺的表达，发现15GY照射后一天，与对照组相比较，PCNA明显表达降低，在照射结束后6天，PCNA在照射组的表达达到高峰，而且，细胞的增殖反应也有剂量相关性。他们在后续研究中还观察到照射后唾液腺组织内高增殖和高凋亡同时存在，因此认为唾液腺细胞增殖与凋亡的不平衡亦可能是导致腺体受照后功能减退的原因之一N副。五展望随着社会经济的发展、人类生活水平的提高、医学的进步、医疗环境的改善，人们对各种疾病治疗后引起的影响生活质量的并发症越来越关注。放射性口干是头颈肿瘤放射治疗后至今尚难以避免的并发症，而且其发生机制至今仍未能完全明确，近年来，放疗技术的改进、组织工程学的发展、基因治疗的进步使这个学科的研究得到了推动，然而，明确放射性口于的机制以及可行的预防治疗手段仍然是亟待解决的课题。茶多酚对放射性颌卜腺细胞凋亡与增殖的影响2007级硕士学位论文参考文献DIFIXPNUYTSS，VANDERPOORTENVETA1THEINFLUENCEOFXEROSTOMIAAFTERRADIOTHERAPYONQUALITYOFLIFERESULTSOFAQUESTIONNAIREINHEADANDNECKCANCERJ】SUPPORTCARECANCER2008；162171179REDMANRSONAPPROACHESTOTHEFUNCTIONALRESTORATIONOFSALIVARYGLANDSDAMAGEDBYRADIATIONTHERAPYFORHEADANDNECKCANCER,WITHAREVIEWOFRELATEDASPECTSOFSALIVARYGLANDMORPHOLOGYANDDEVELOPMENTJ】BIOTECHHISTOCHEM2008；833103130WANGZH，YANC，ZHANGZYETA1RADIATIONINDUCEDVOLUMECHANGESINPAROTIDANDSUBMANDIBULARGLANDSINPATIENTSWITHHEADANDNECKCANCERRECEIVINGPOSTOPERATIVERADIOTHERAPYALONGITUDINALSTUDY【J】LARYNGOSCOPE2009；1191019661974GRESZVWATERANDELECTROLYTESECRETIONBYSALIVARYGLANDS【J】ORVHETIL2006；1473918911900JENTZENWJSCHNEIDERE，FREUDENBERGL，ETA1RELATIONSHIPBETWEENCUMULATIVERADIATIONDOSEANDSALIVARYGLANDUPTAKEASSOCIATEDWITHRADIOIODINETHERAPYOFTHYROIDCANCERJ】NUCLMEDCOMMUN2006；278669676BAHARUDINA，KHAIRUDDINA，NIZAMA，ETA1EVALUATIONOFIRRADIATEDSALIVARYGLANDFUNCTIONINPATIENTSWITHHEADANDNECKTUMOURSTREATEDWITHRADIOTHERAPY【J】JLARYNGOLOTOL2009；1231108113刘景杰田野头颈部癌调强适形放射治疗保护唾液腺功能的研究现状J中华耳鼻咽喉头颈外科杂志2007；427551553ROESINKJM，TERHAARDCH，RAAIJMAKERSCESALIVAANDINTENSITY37】0】N口PM陋KP隅茶多酚对放射性颌下腺细胞凋亡与增殖的影响2007级硕士学位论文MODULATEDRADIOTHERAPYJ】NEDVIIDSCHRTANDHEELKD2008；L152107一LLOEISBRUCHARADIOTHERAPYIMRTREDUCESXEROSTOMIAANDPOTENTIALLYIMPROVESQOLJNATREVCLINONCOL2009；610567568LIJ，SHANZ，OUGETA1STRUCTURALANDFUNCTIONALCHARACTERISTICSOFIRRADIATIONDAMAGETOPAROTIDGLANDSINTHEMINIATUREPIG【J】INTJRADIATONCOLBIOLPHYS2005；62515101516LEEHJ，LEEYJ，KWONHC，ETA1RADIOPROTECTIVEEFFECTOFHEATSHOCKPROTEIN25ONSUBMANDIBULARGLANDSOFRATSJ】AMJPATHOL2006；169516011611BORAKSGTAMPELINIFS，PERE