公子小丑鱼的人工繁殖_胚胎发育及不同盐度对其幼鱼生长的影响

0上海海洋大学硕士学位论文二O一三年四月九日学校代码研究生学号10264M100101041题目公子小丑鱼（AMPHIPRIONOCELLARIS）胚胎发育的形态学观察及盐度对幼鱼生长的影响英文题目MORPHOLOGICALOBSERVATIONOFEMBRYONICDEVELOPMENTANDEFFECTSOFSALINITYONGROWTHOFFALSECLOWNFISHAMPHIPRIONOCELLARIS专业水产养殖研究方向海水观赏鱼繁殖与发育姓名鞠晨曦指导教师蔡生力李云1上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名日期年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密学位论文作者签名指导教师签名日期年月日日期年月日公子小丑鱼（AMPHIPRIONOCELLARIS）胚胎发育的形态学观察及盐度对幼鱼生长的影响摘要公子小丑鱼，学名为眼斑双锯鱼，海葵鱼属AMPHIPRION，雀鲷科POMACENTRIDAE，鲈形目（PERCIFORMES）。公子小丑鱼是最常见的海洋观赏鱼类，雌雄同体，雄性先熟，分布于西太平洋礁岩海域。公子小丑鱼以其鲜艳的色彩、漂亮的花纹及可爱的形象而深受水族爱好者的喜爱。挑选合适的野生的公子小丑鱼个体在实验室条件下进行配对，调控适宜的外界环境因子并进行营养强化使其产卵，产卵以后进行人工孵化。仔鱼在孵出的第2D即开口食用由小球藻CHLORELLASP强化的褶皱臂尾轮虫BRACHIONUSPLICATILIS,全长4244MM,为仔鱼期，46D变态为稚鱼,全长5154MM开始投喂刚孵出的卤虫无节幼体,10D以后开始投喂经小球藻强化的卤虫ARTEMIASP，1622D进入幼鱼期,全长100124MM，3545D开始投喂自制人工配合饵料。在实验室水温261、盐度281的条件下，对公子小丑鱼胚胎发育过程中的形态学变化进行了观察研究。结果表明，公子小丑鱼受精卵属附着性卵，呈长椭圆形,长径20MM01MM，短径095MM01MM；其卵裂方式为端黄卵盘状卵裂；胚胎发育可分为10个主要阶段卵裂前期、卵裂期、囊胚期、原肠期、神经胚期、体节期、翻转期、血管形成期、器官形成期和孵化期。发育过程中胚胎的颜色逐渐加深，呈现由橙黄色到棕黄色的变化；在26水温条件下，整个胚胎发育过程需200H左右。在水温261的条件下,研究了盐度对公子小丑鱼幼鱼生长、摄食、饵料利用率和生长激素及其受体MRNA水平的影响。第42D和70D的试验结果都表明,公子小丑鱼幼鱼在各盐度实验组成活率无显著差异当盐度为25和30时生长最快,盐度20时次之,盐度15和35时较慢与之相应的饵料转换效率也是在盐度25和30时最高,盐度20、35、15依次降低相对体重增长率也是在盐度25和30时最高,盐度20、35、15依次降低。第70D时取样进行分子生物学实验，结果表明，公子小丑鱼脑垂体GHMRNA水平在盐度15时最高，盐度25次之，盐度20、30、35时较低肝脏GHR1MRNA水平在盐度20、25、30时最高，盐度35次之，盐度15时最低肝脏GHR2MRNA水平在盐度25时最高，盐度20时次之，I盐度30、35、15时较低。公子小丑鱼幼鱼GHR1和GHR2MRNA表达量与其生长呈正相关。说明公子小丑鱼幼鱼最适宜的生长盐度为25到30。关键词公子小丑鱼，胚胎发育，形态学，盐度，成活率，生长，生长激素，生长激素受体IIMORPHOLOGICALOBSERVATIONOFEMBRYONICDEVELOPMENTANDEFFECTSOFSALINITYONGROWTHOFFALSECLOWNFISHAMPHIPRIONOCELLARISABSTACTSFALSECLOWNFISHISPLACEDINAMPHIPRIONOCELLARIS,POMACENTRIDAE,PERCIFORMESITISAKINDOFCOMMONMARINEORNAMENTALFISH,HERMAPHRODITEANDCROSSFERTILIZATIONANDWIDESPREADINTHESEAOFSOUTHCHINA,PHILIPPINESANDTHEWESTERNPACIFICFALSECLOWNFISHISAPOPULARFISHFORORNAMENTALFISHENTHUSIASTSFORTHEBRIGHTCOLORE,BEAUTIFULPATTERNANDLOVELYFIGURETHEFISHWASCOLLECTEDFROMTHEWILDASBROODSTOCK,ANDCULTUREDTOMATUREANDSPAWNEDINARTIFICIALCONDITIONTHELARVALFISHCOULDBEFEDROTIFERSTRENGTHENEDBYUNICELLULARALGAECHLORELLASPPINTHENEXTDAYAFTERHATCHINGANDDEVELOPEDINTOJUVENILEAT46DAYSAFTERHATCHING,NEWLYHATCHEDARTEMIANAUPLIIWERESUPPLIED,FROMTHE10THDAYARTEMIANAUPLIISTRENGTHENBYCHLORELLASPPWERESUPPLIED,THENDEVELOPEDINTOPARR1622DAYSAFTERHATCHINGTHEPARRSCOULDBEFEDBYARTIFICIALLYMADECOMPOUNDFEEDAT3545DAYSAFTERHATCHINGTHESTUDYWASCARRIEDOUTTOINVESTIGATETHEINCUBATIONPERIODANDTHECHANGESOFMORPHOLOGICALCHARACTERDURINGTHEEMBRYONICDEVELOPMENTOFAMPHIPRIONOCELLARISATWATERTEMPERATURE261,SALINITY281INLABORATORYCONDITIONITWASFOUNDTHATTHEEGGSBELONGEDTOTHETELOLECITHALANDWERESUBJECTTODISCOIDALCLEAVAGETHEADHESIVEFERTILIZEDEGGS,WHICHWEREELLIPSOIDAL,WERE20MM01MMLONGAND095MM01MMINDIAMETERTHEPROCESSOFEMBRYONICDEVELOPMENTCOULDBEDIVIDEDINTOTENSTAGESPRECLEAVAGESTAGE,CLEAVAGESTAGE,BLASTULASTAGE,GASTRULASTAGE,NEURULASTAGE,SOMITESTAGE,TURNOVERSTAGE,ANGIOGENESISSTAGE,ORGANFORMATIONSTAGEANDHATCHINGSTAGETHECOLOROFTHEEMBRYOCHANGEDGRADUALLYDURINGTHEDEVELOPMENTPROCESSION,FROMORANGEYELLOWTOCLAYBANKTHEWHOLEINCUBATIONPERIODISABOUT200HATWATERTEMPERATURE26THEEFFECTSOFSALINITYONGROWTH,FEEDING,FOODCONVERSIONRATEFCR,GROWTHHORMONEANDRECEPTORMRNALEVEOFYOUNGAMPHIPRIONOCELLARISWERESTUDIEDTHEIIIRESULTSOFTHE42THAND70THDAYSHOWEDTHATTHEREISNOSIGNIFICANTEFFECTONTHESURVIVERATEFORYOUNGAMPHIPRIONOCELLARISATEACHSALINITYLEVELSTHEYOUNGAMPHIPRIONOCELLARISHADAHIGHESTGROWTHATTHE25AND30SALINITYLEVELS,HIGHERGROWTHAT20ANDLOWGROWTHAT15AND35THEFEEDCONVERSIONRATIOISALSOHIGHERATTHE25AND30SALINITYLEVELSANDTHENREDUCEDALONGTHE20,35,15SALINITYLEVELSTHEGROWTHRATEOFRELATIVEBODYWEIGHTISCONFORMEDTOTHISLAWTHEMOLECULARBIOLOGYSTUDYBEGANATTHE70THDAY,THERESULTSHOWEDTHATTHEHIGHESTLEVELOFPITUITARYGHMRNAWASATSALINITY15ANDHIGHERAT35,THELOWESTLEVELWASATSALINITY20,30,35THEHIGHESTLEVELOFHEPARLIVERGHR1MRNAWASATSALINITY20,25,30ANDHIGHERAT35,THELOWESTLEVELWASATSALINITY15THEHIGHESTLEVELOFHEPARGHR2MRNAWASATSALINITY25ANDHIGHERAT20,THELOWESTLEVELWASATSALINITY15,30,35THEEXPRESSIONOFGHR1MRNAANDGHR2MRNAPOSITIVELYCORRELATEDWITHGROWTHTHEMOSTSUITABLESALINITYRANGEIS2535KEYWORDSFALSECLOWNFISHAMPHIPRIONOCELLARISEMBRYONICDEVELOPMENTMORPHOLOGYSALINITYGROWTHGHMRNAGHR1MRNAGHR2MRNAIV目录摘要IABSTACTSIII引言11小丑鱼分布和生活习性12交配产卵33人工繁殖、胚胎发育和环境因子对仔幼鱼的影响34荧光定量方法45繁殖生产中存在的问题5第一章公子小丑鱼养殖模式和人工繁殖61材料与方法611亲鱼养殖模式6111亲鱼养殖系统6112亲鱼的来源7113亲鱼的暂养7114亲鱼的配对7115亲鱼的培养712幼体培育系统713培育用水814生物饵料培养815仔幼鱼对饵料的需求821亲鱼产卵822受精卵人工孵化923仔幼鱼的孵化率和成活率103讨论10第二章公子小丑鱼胚胎发育的形态学观察131材料与方法13V11实验用鱼和养殖管理1312胚胎发育观察132结果与分析1421卵裂前期1522卵裂期（1H）1623囊胚期（5H）1624原肠期（10H）1625神经胚期（20H）2026体节期（22H）2027翻转期（35H）2028血管形成期（56H）2129器官形成期（72H）21210孵化期（199H）213讨论2231胚胎发育过程2232孵化时间2233胚胎颜色的变化23第三章盐度对公子小丑鱼幼鱼生长和生长激素及其受体MRNA水平的影响241材料与方法2411实验材料2412实验方法24121生长、成活率、摄食实验24122生长激素及其受体MRNA水平实验251221总RNA的提取251222反转录及引物设计251223常规PCR261224荧光定量PCR扩增2613数据分析262结果2721不同盐度对公子小丑鱼幼鱼成活率的影响2722不同盐度对公子小丑鱼幼鱼生长及摄食的影响27VI23荧光定量PCR分析3124公子小丑鱼生长激素及其受体MRNA基因与ACTINMRNA基因的荧光定量PCR标准曲线3325各盐度组垂体GHMRNA相对表达量353讨论3631盐度变化对公子小丑鱼幼鱼存活与生长的影响3632盐度变化对公子小丑鱼幼鱼生长激素及其受体MRNA水平的影响36小结38参考文献39攻读硕士期间发表的论文43致谢440引言公子小丑，海葵鱼属AMPHIPRION，雀鲷科POMACENTRIDAE，鲈形目（PERCIFORMES）。分布于中国南海、菲律宾、西太平洋的礁岩海域。性成熟后雌鱼体形比雄鱼大。野生雌性成体体长1012CM，人工水族缸养殖体长多不大于10CM。体色橘红，椭圆形，体侧有三条银白色环带，分别位于眼睛后、背鳍中央、尾柄处，其中背鳍中央的白带在体侧形成三角形，各鳍橘红色有黑色边缘，喜欢躲在海葵中。公子小丑鱼由于其鲜艳的色彩、漂亮的花纹及可爱的形象而深受水族爱好者的喜爱。从1997到2002，公子小丑鱼占据了世界观赏鱼类鱼类总出口量156和欧洲国家进口份额的25以上1。海水观赏鱼也占到美国渔业贸易出口总额的20，价值约89亿美元（JOHUNSTOU）2。迪士尼动画大片海底总动员的热播更是让公子小丑鱼“尼莫”成为家喻户晓的明星，也使其销量增加了两倍。随着经济的飞速发展和人民对精神文化需求的提高，海水水族缸在2000年后开始在国内兴起并飞速发展，目前在国内大中城市，海水观赏鱼店如雨后春笋般出现。由于受人工繁殖技术和生产规模的局限，目前市场上销售的公子小丑鱼仍以捕捞野生自然群体为主，并多用氰化物等有毒化学品进行捕捞，采捕后由于氰化物的毒性和长途运输中的氨中毒，能够作为商品进入市场的不足203，而且氰化物还会伤害无法逃避的珊瑚等海洋生物，破坏珊瑚礁区的生态平衡，所以海水观赏鱼的大规模商业化人工繁育就变得势在必行。目前国内外已有不少学者对公子小丑鱼的生理生态、繁殖发育做了初步研究47，并成功进行了人工育苗和批量化生产，但规模仍较小，满足不了市场所需。1小丑鱼分布和生活习性小丑鱼是对雀鲷科海葵鱼亚科鱼类的俗称，是一种热带海洋鱼类。已知有28种，一种来自棘颊雀鲷属（PREMNAS），其余来自双锯鱼属（AMPHIPRION）。小丑鱼与海葵有着密不可分的共生关系，因此又称海葵鱼。带毒刺的海葵保护小丑鱼，小丑鱼则吃海葵消化后的残渣，形成一种互利共生的关系。1（1）形态特征背棘总数，1212；背的软条总数，1416；臀棘2；臀鳍软条，1415，稚鱼全体是黑色的；前额与上侧面上有白色的斑块；所有鳍的外缘都是黑色。成鱼的地理分布和颜色是可变的。见图1图1公子小丑鱼FIG1AMPHIPRIONOCELLARIS（2）生态习性及食性栖息于珊瑚礁与岩礁，常与大的海葵，海胆或小的珊瑚顶部共生。形成小群到大群鱼群。胃内含物包括藻类，桡足类及其他的浮游性甲壳动物。（3）常见种类公子小丑分布于中国南海、菲律宾、西太平洋的礁岩海域，属雀鲷科，体长1012CM，椭圆形。体色橘红，体侧有三条银白色环带，分别位于眼睛后、背鳍中央、尾柄处，其中背鳍中央的白带在体侧形成三角形，各鳍橘红色有黑色边缘。红小丑AMPHIPRIONFRENATUS，地理分布分布在西太平洋的珊瑚礁海域，分布范围包括泰国湾至帕劳群岛西南部，北至日本南部，南至印度尼西亚的爪哇一带海域。成鱼体呈椭圆形而侧扁，吻短而钝。眼中大，上侧位。口大，上颌骨末端不及眼前缘；齿单列，齿端具缺刻。背鳍单一，软条部延长而呈方形；尾鳍呈扇形，上下叶外侧鳍条不延长呈丝状。成鱼体黑色，头部、胸腹部以及身体各鳍均为红色。眼睛后方具一镶白缘之宽白带，向下延伸至喉峡部。亚成鱼体一致橙黄色，眼睛后方具一白色竖带。随着成长，体色逐渐转红，且身体后方出现黑斑并扩散至整个身体。透红小丑鱼PREMNASBIACULEATUS，分布于印度洋、太平洋的珊瑚礁海域，属雀鲷科，体长1015CM，椭圆形。全身紫黑色，各鳍紫红色，体侧在眼睛后、背鳍中间、尾柄处有三条银白色环带。2小丑鱼也通常被叫为海葵鱼,与特定的海葵组成一种互利共生的关系。一个大的海葵（直径为一米）可以庇护多达30多个各种大小的小丑鱼。所有的小丑鱼都是雄性先熟的雌雄同体鱼，开始是雄性后来变为雌性。与其它雀鲷科鱼类的成对关系不一样的是，大部分小丑鱼种类都是永久的一夫一妻制。雌雄的结合非常紧密直到其中的一个成员消失时才会被打破。在大部分情况下，雌性的死亡更普遍，因为雌性一般是最大和最老的个体，当一个小丑鱼家族的的雌鱼死亡后，雄鱼会转化为雌鱼，与此同时优势的未成熟的雄鱼就会转化为成熟的雄鱼，这个过程通常需要几个月到一年才能彻底完成，而且这个过程是不可逆的8,9。小丑鱼在深海产卵，把单层的卵产到坚硬的基面上。在自然环境中，海葵会警戒着卵使之不受外界侵扰，因为卵在海葵的管辖范围之内。亲鱼通常都照顾受精卵直到幼鱼孵出。用鳍条扇动的行为使围绕在巢穴的水富含氧气，同时用嘴去除受损和坏掉的卵以保证健康的卵不被污染10。2交配产卵公子小丑鱼典型的产卵信号是亲鱼在产卵前约34小时清洁陶罐内部的污点。在此期间，雌性的产卵器，一个白色的小管，从肛门附近的微孔延伸出来。根据对于小丑鱼的产卵观察，透红小丑鱼一般在上午十一点左右产卵，而公子小丑一般在下午产卵，时间不定。雄鱼积极的参与瓦罐的清洁工作而雌鱼在产卵前051H更积极参与瓦罐的清理。在第一批10到20个卵被产出后，雌鱼将在产下下一批卵之前仔细检查这批卵。这些卵被产在陶罐的内壁并呈圆形排列。雌鱼产卵后，雄鱼肛门孔扩大对卵进行受精。雄鱼在卵上游动并用生殖器触碰卵。这种行为在鱼进行下一组鱼产卵前通常重复23次。刚产的卵为橙黄色，长椭圆形2010MM,而且在卵黄的中部成轻微的弧形。卵可以通过外壳看到因为卵膜是透明的。卵黄呈鲜亮的橙色，同时油滴清晰可见。3人工繁殖、胚胎发育和环境因子对仔幼鱼的影响目前对于海水观赏鱼的专业性研究相对较少，主要集中在生活习性11,12、分布13,14、分类、生理、人工繁殖与发育等的研究。能够实现人工繁殖的也仅限于虾虎科、拟雀鲷科和雀鲷科的几个品种，虾虎科有金灯虾虎（ELACATINUSSP）、3蓝灯虾虎（ELACATINUSOCEANOPS）15等，拟雀鲷科有美国草莓（PSEUDOCHROMISFRIDMANI）16、蓝线（PSEUDOCHROMISSPRINGERI）、日出龙（PSEUDOCHROMISFLAVIVERTEX）17等，雀鲷科主要就集中在小丑鱼身上，小丑鱼是对雀鲷科海葵鱼亚科鱼类的俗称，已发现的小丑鱼约有28种，目前报道能够人工繁育的有十几种。虽然在海水水族缸里人工养殖小丑鱼历史已有几十年,而且早在1978年ROSS就研究了黑红小丑AMPHIPRIONMELANOPUS的繁殖习性18，但对小丑鱼进行人工繁殖和发育的相关研究主要在近十年。2000年MARVEDLUND等研究了黑红小丑的光周期对黑红小丑AMELANOPUS仔稚鱼生长的影响19，2001年IGNATIUS等研究了一种黑双带小丑（ASEBAE）的人工繁育技术20，2002年MADHU报道了黑边公子小丑APERCULA的人工繁殖21，2004年BRIDGET报道了黑红小丑AMELANOPUS胚胎发育和耗氧量之间的关系22，2005年HO描述了银边小丑APERIDERAION亲鱼的繁殖行为以及胚胎发育及幼体培养23；SUKJAI描述了鞍背小丑APOLYMNUS的胚胎发育24；滕力平等简述了二线小丑的人工繁殖和胚胎发育25；ARATAKE先后研究了将红双带小丑ACLARKII暂养在日本九州岛的西、南两个海域中产卵卵径及数量的季节性变化和卵径与蕴含能量之间的关系26,27，2006年LJLIEW和何兴源分别报道了公子小丑实验室条件下的胚胎发育和生殖行为与育苗5,6，2007年YASIR报道了公子小丑鱼AOCELLARIS繁殖习性及胚胎和仔鱼的发育4，2008年鲍鹰等先后对红小丑AFRENATUS人工育苗与胚胎发育和透红小丑（PBIACULEATUS）人工繁殖与育苗进行了初步的研究28,29，2009年KVDHANEESH描述了黑边小丑APERCULA的胚胎发育30，2010年王斌对公子小丑鱼的人工繁育技术进行了初步的研究7，2011年YELE等报道了温度对红双带小丑ACLARKII幼鱼成活率、发育、生长的影响31，2012年KVDHANEESH等报道了线小丑AAKALLOPISOS的繁殖、胚胎发育和耐盐性32。综上所述，十年来对于小丑鱼繁殖与发育的研究呈井喷之势，国内对于小丑鱼的研究也开始逐渐增多，随着对小丑鱼发育和繁殖机理的研究不断深入，相信小丑鱼的大规模商业化必将成为现实。4荧光定量方法实时荧光定量PCR（REALTIMEPCR）技术由美国APPLIEDBIOSYSTEMS公司推出，它实现了PCR从定性到定量的飞跃。荧光定量PCR具有特异性强，无污染，自动化程度高等优点，广泛应用于不同的研究领域。4实时荧光定量PCR（REALTIMEPCR）技术是指在普通的PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的累积实时监测整个PCR过程，最后通过构建标准曲线和目的及内参基因达到荧光阈值的CT值对未知模板进行定量分析。荧光化学材料可分为荧光染料和荧光探针两类。荧光染料主要以SYBRGREEN为主要代表，是非特异性荧光化学材料。SYBRGREEN是荧光定量常用的染料，SYBRGREEN可以与扩增过程中形成的双链DNA结合并且发出荧光。在游离的状态下，SYBRGREEN只能发出非常微弱的荧光，但是SYBRGREEN与双链DNA结合之后，荧光的强度就可以增强到其在游离状态的1000倍以上。所以一个PCR反应中检测到的全部荧光信号与扩增得到的双链DNA量的是成正比例关系的，我们也就可以通过检测荧光信号计算出出PCR体系中扩增出来的的双链DNA的量。5繁殖生产中存在的问题首先是人工配对的问题，亲鱼如和配对，如何挑选亲鱼，其次是配对后使用什么饵料才能促使亲鱼成熟并产卵，产卵后胚胎发育所需要的条件，如何人工孵化，孵化后幼鱼生长的最佳条件，比如用什么饵料、盐度、温度、光照、PH、溶氧、氨氮亚硝酸盐、海水中镁离子与钙离子的比例与含量等等还研究很少，并没有产生完整的操作规范。小丑鱼是雄性先熟的雌雄同体鱼，在生长过程中可能会经历由雄性向雌性的性逆转，性逆转的过程中主要由什么基因控制，也研究不多。本文的介绍了公子小丑鱼亲鱼的养殖模式及人工繁殖，观察了胚胎发育的形态学变化，并研究了盐度对公子小丑鱼幼鱼生长、摄食、饵料利用率和生长激素及其受体MRNA水平的影响，以期为公子小丑鱼和其它海水观赏鱼的大规模人工繁殖提供更多的理论依据。5第一章公子小丑鱼养殖模式和人工繁殖1材料与方法11亲鱼养殖模式111亲鱼养殖系统亲鱼培育系统共有上下四个玻璃缸，下面一个为过滤缸（808060CM）。上面三个为养殖缸（805040CM）。最上面一个养殖缸养羽毛藻来调控水质，中间两个养殖缸每个隔为三格，每格放入一个产卵罐供亲鱼产卵。图11亲鱼养殖系统FIG11BROODSTOCKBREEDINGSYSTEM6112亲鱼的来源第一批亲鱼购自浙江海水养殖研究所，以后的几批均购自广州花地湾水族市场，其来源为菲律宾和印尼的珊瑚礁海域。113亲鱼的暂养盐度为2530，养殖水温为281，PH为8081，光照25005000LX，NH3N水平低于05MG/L,NO2N水平低于015MG/L，NO3N水平低于25MG/L。114亲鱼的配对选择体长在8CM以上的作为雌鱼，体长7CM以下的较大个体为雄鱼。雌雄比例可以按11,12,1N等。115亲鱼的培养控制亲鱼养殖水温为261，PH为8081，盐度为2729，光照25005000LX，NH3N水平低于05MG/L,NO2N水平低于015MG/L，NO3N水平低于50MG/L。水温通过水系统中加热棒控制。每天下午用虹吸管吸出缸底剩饵，及时补充因虹吸损失的水，每三天检测并调整一次盐度。在水系统中适量培养羽毛藻等水生植物来调控改善水质。每天投喂由鲜虾肉，鱿鱼，蛏子，冰冻卤虫，冰冻红虫，螺旋藻等混合而成的自制配合饵料。分别于上午1000和下午400投喂2次。12幼体培育系统仔鱼，幼鱼养殖在800L的圆柱形塑料桶中，桶中央固定一个气石，温度用加热棒来控制。7图12鱼苗养殖容器模式图（自张雅静）FIG12SKETCHOFBARRELFORLARVALCULTURE图13鱼苗养殖容器实体图FIG13ENTITYOFBARRELFORLARVALCULTURE13培育用水试验用水为以色列REDSEA海盐和淡水配制而成。14生物饵料培养小丑鱼仔幼鱼生长所需要的生物饵料主要为轮虫和卤虫无节幼体。轮虫需要投喂小球藻才能存活和不断繁殖。卤虫无节幼体用幸运牌卤虫卵孵化得到，投喂时把虫体和卵壳以及没有孵化的虫卵分离。15仔幼鱼对饵料的需求仔、稚鱼培养期间的水温控制在271，PH为8082，盐度控制在2729，氨氮量低于01MG/L。仔鱼孵化后前三天投喂用小球藻强化的轮虫，轮虫的密度保持在1015个/ML左右。第四天开始投喂轮虫并开始投喂卤虫无节幼体，此期保证轮虫的密度保持在5个/ML左右，卤虫无节幼体的密度保持在3个/ML左右。第七天开始全部用卤虫无节幼体投喂，卤虫无节幼体的密度保持在58个/ML左右，第十天以后投喂用小球藻强化培养的卤虫，可根据稚鱼的体长培养大小相适应的卤虫。一个月后可以投喂小颗粒饲料和自制人工配合饲料。每天下午吸出缸底的污物，每天更换水体1/10的左右的水。2实验结果21亲鱼产卵公子小丑鱼亲鱼一般在白天产卵，产卵时雌鱼的输卵管明显伸长，雄鱼的输精管也伸长，雌鱼身体抖动，依次将卵粒排在瓦罐上，雄鱼以相同的动作排精，雌鱼身体抖动一次可产卵几十粒，然后雄鱼排精，以此往复几十次，鱼卵为粘性卵，排列紧密，在瓦罐上形成大约3CM5CM的卵块，产卵一般持续60MIN，平均产卵量为200500。图14公子小丑鱼受精卵FIG14THEFERTILIZEDEGGOFAOCELLARIS22受精卵人工孵化公子小丑鱼的胚胎发育在26度左右需要200H，产卵后160H眼睛开始变亮，反光性极强，这是判断孵化时间的重要标志。孵化当天用气石调节适量的气流吹动受精卵，以模拟亲鱼用鳍扇动受精卵，防止其缺氧死亡。孵化率在90以上。9图15受精卵人工孵化FIG15FERTILIZEDEGGARTIFICIALINCUBATION23仔幼鱼的孵化率和成活率根据从2011年2月至9月对18批公子小丑鱼仔幼鱼的孵化率的统计，其孵化率高达9323556。鱼苗前十五天的成活率如图所示，孵化后当天成活率接近100，第二天部分体质较差的鱼苗开始死亡，成活率大幅下降。孵化后的第四天部分生长快的鱼苗开始摄食卤虫无节幼体，而一部分体质较差，竞争力较弱的鱼苗由于无法摄食足够的轮虫，也开始部分死亡，使成活率有所下降。孵化后第十天，由于鱼苗在这个阶段很贪吃，有部分鱼苗撑死导致成活率降低。鱼苗在孵出的第2D，全长4244MM,为仔鱼期，成活率为6821276；第5D变态为稚鱼,全长5153MM，成活率为3967334第15D开始进入幼鱼期,全长951053MM，成活率为2035178。（图16）10图16鱼苗孵化后15D内成活率变化FIG16THESURVIVERATECHANGEOFTHEFRYWITHIN15DAYSAFTERHATCHING3讨论公子小丑鱼雌性成熟时间较晚，由人工养殖爱好者报道的来总结，小丑鱼从人工孵化到产卵需要两年以上，所以购买人工繁殖三个月大的幼鱼来作为亲鱼配对周期太长。亲鱼的来源主要就集中于野外捕捞。野外捕捞又可分为网捕和药捕，网捕成本较高，而且数量有限，所以市场上见到的大部分海水观赏鱼都来自氰化钠捕捞，但是采捕后由于氰化物的毒性和长途运输中的氨中毒，公子小丑鱼暂养时如果处理不当会有超过80在十天内死亡。由于氰化物的毒性和长途运输中的氨中毒，小丑鱼非常虚弱，这个时候不用喂食，并按水体体积滴入少量的水质稳定剂。由于其身体虚弱导致渗透压调节能力的降低，所以选择盐度为2530，防止因盐度变化过快引起的应激。此时要保证水质尽量接近珊瑚礁海域的水平。由于一个野生小丑鱼家族中只有一只为雌鱼，有几条相对较大的为雄鱼，而大部分都是没有成熟的雄鱼。所以配对时应选择体长在8CM以上的作为雌鱼，由于由雄鱼变为雌鱼的过程是不可逆的，所以最好选择体长7CM以下的较大个体为雄鱼。雌雄比例可以按11,12,1N等，一条雌鱼和多条雄鱼可以增加配对的成功率，配对成功的两条小丑鱼会共同生活在一个瓦罐里，并且会驱赶其他没有配对的雄鱼，这个时候就可以把没有配对的雄鱼捞出。如何配对和促使亲鱼成熟产卵是公子小丑鱼繁殖过程中的难点，曾观察到配对后正在产卵的一对亲鱼中雄鱼死亡的情况，将另一对尚未产卵的雄鱼与此雌鱼配对，十天后新配对的亲鱼重新产卵。以此推测性成熟的雌鱼能刺激或加快未成熟的雄鱼性成熟，或者公子小丑鱼配对后未产卵的原因是雌鱼未性成熟，显然雌鱼是否性成熟对一对小丑鱼能否产卵起着更为关键的作用。充气对鱼卵的孵化非常重要，自然状况下鱼卵的胚胎发育需要亲鱼不断地用鳍扇动鱼卵来补充氧气，人工孵化时考虑到亲鱼养殖在循环水系统中，鱼苗孵化后会被水流带到过滤缸，所以附着有受精卵的产卵罐要拿出单独的充气孵化，气石充气的位置不对，会导致没有被气流吹动的受精卵缺氧白化死亡。所以，人工孵化时要调整气石和产卵罐处于一个合适的位置，使所有的卵都能被气流吹动，而且尽量注意不要碰到孵化缸，以免产卵罐的位置发生偏移。气流的大小也有讲究，气流太大会导致没有到孵化时间的受精卵直接被气流吹掉，而气流太小又会11导致受精卵的缺氧死亡。公子小丑鱼的孵化时间会受到光照和温度等的影响。在适宜的范围内，温度越高，孵化时间越短。公子小丑一般在晚上的黑暗环境下孵化，如果孵化过程中受到外界光源的影响，会导致孵化时间推迟，孵化率降低。在公子小丑鱼人工育苗中,生物饵料的培养是一个非常重要的环节。公子小丑鱼仔鱼孵出之后,卵黄囊已消耗殆尽,孵化后即需要开口摄食轮虫。鱼苗养殖过程中要注意生物饵料的投饵量,尤其是在稚鱼期要严格控制卤虫的投喂量,因为稚鱼在这个阶段很贪吃,如果投喂过量,很容易导致稚鱼撑死。投喂刚孵出的卤虫时，应注意把活体和卵壳以及未孵化的卤虫卵分离。公子小丑鱼在仔、稚鱼期只能用天然饵料来喂养,因为在这个阶段,没有完整的消化系统,体内的消化酶缺乏,摄食到卤虫卵壳会使鱼苗消化不良导致死亡。目前的配合饵料大多无法满足这阶段的需求。在本次试验中有其他因素也对小丑鱼胚胎发育产生影响。鱼卵的胚胎发育在完全充气孵化和亲鱼照看两种情况下比较，亲鱼照看比充气孵化的速度要快，鱼卵的孵化时间会提前1天，而且亲鱼照看受精卵的孵化率的比人工充气孵化率的要高。在亲鱼产卵期，领域性很强。12第二章公子小丑鱼胚胎发育的形态学观察由于受人工繁殖技术和生产规模的局限，目前市场上销售的公子小丑鱼仍以捕捞野生自然群体为主，并多用氰化物等有毒化学品进行捕捞，采捕后由于氰化物的毒性和长途运输中的氨中毒，能够作为商品进入市场的不足202，而且氰化物还会伤害无法逃避的珊瑚等海洋生物，破坏珊瑚礁区的生态平衡，所以海水观赏鱼的大规模商业化人工繁育就变得势在必行。目前国内外已有不少学者对公子小丑鱼的生理生态、繁殖发育做了初步研究47,并成功进行了人工育苗和批量化生产,但规模仍较小，满足不了市场所需。为进一步探讨公子小丑鱼的繁殖与发育生物学规律，改进人工繁殖技术，本文研究了该种类胚胎发育的全过程,描述了胚胎发育过程中的形态结构变化,并与相关研究进行了比较分析，以期为未来海水观赏鱼的人工繁育提供理论依据。1材料与方法11实验用鱼和养殖管理公子小丑鱼亲鱼于2010年4月从浙江海水养殖研究所购入，暂养一个月后，选择体长超过7CM的为雌鱼，不超过6CM的为雄鱼，共配成5对，配对的雌鱼平均体长为81CM，雄鱼为56CM。每对亲鱼分别放入斑马鱼系统中40CM30CM20CM的亚克力缸中，每个缸中都放有产卵罐，用来让亲鱼栖身产卵并作为受精卵的附着基，所有的缸都共用一个水处理系统。控制亲鱼养殖水温为261，PH为8081，盐度为2729，光照25005000LX，NH3N水平低于05MG/L,NO2N水平低于015MG/L，NO3N水平低于50MG/L。水温通过水系统中加热棒控制。每天下午用虹吸管吸出缸底剩饵，及时补充因虹吸损失的水，每三天检测并调整一次盐度。在水系统中适量培养羽毛藻等水生植物来调控改善水质。每天投喂由鲜虾肉，鱿鱼，蛏子，冰冻卤虫，冰冻红虫，螺旋藻等混合而成的自制配合饵料。分别于上午1000和下午400投喂2次。12胚胎发育观察亲鱼一般上午1100左右产卵，受精卵由动物极一端的附着丝粘附在产卵罐上，产卵结束后立即对受精卵进行取样，为防止反复拿出产卵罐会影响到亲鱼，用一个新的产卵罐来代替附着有受精卵的产卵罐，把附着有受精卵产卵罐放入斑马鱼13系统中另一个小缸中，温度光照条件和产卵缸保持一致，并放入一个气石充气吹动受精卵，以模拟亲鱼用鳍扇动受精卵，以防止其缺氧影响发育。产卵当天每05H取样1次，第2D每1H取样1次，第3D每2H进行1次取样，第4D每4H进行1次取样，至第5D开始每6H取样1次，直到鱼卵孵化。每次取样观察510个受精卵。取样时，用巴氏滴管将鱼卵的附着丝铲断并吸入滴管，然后取样置于载玻片上，在奥林巴斯SZX16体视显微镜下对样品进行形态学观察、记录各阶段的形态特征、计数胚胎心跳数,在电脑上用IMAGEPROEXPRESS60高级图像处理软件控制与显微镜连接的MICROPUBLISHER50RTV相机进行拍照，并进行图片分析，测量卵径并绘图。2结果与分析根据不同时期胚胎发育的形态学特征,可将整个胚胎发育过程分为卵裂前期、卵裂期、囊胚期、原肠期、神经胚期、体节期、翻转期、血管形成期、器官形成完善期、孵化期等10个不同时期表21。表21公子小丑鱼胚胎发育各时期特征TAB21CHARACTERISTICSOFEACHEMBRYONICDEVELOPMENTALSTAGEOFAMPHIPRIONOCELLARIS胚胎发育时期DEVELOPMENTALSTAGE发育时相（受精后第N小时）DEVELOPMENTALTIMENHFROMFERTILIZATION持续时间LASTTIME长径LONGITUDEDIAMETERMM受精卵和胚胎颜色COLOROFFERTILIZEDEGGOREMBRYO主要特征MAJORCHARACTERISTICS卵裂前期PRECLEAVAGESTAGE01H1H20橙黄色ORANGEYELLOW受精卵吸水膨胀卵膜举起形成围卵周隙,胎盘形成（图版1,21,2）卵裂期CLEAVAGESTAGE2细胞15H4细胞2H8细胞25H16细胞3H32细胞35H64细胞4H4H23橙黄色ORANGEYELLOW卵裂沟出现图版33图版44图版55图版66图版7714囊胚期BLASTULASTAGE5H5H23橙黄色ORANGEYELLOW细胞极小，无法计数，形成囊胚腔（图版I8,9,108,9,10）原肠期GASTRULASTAGE10H10H23橙黄色ORANGEYELLOW胚盘不断向植物极下包、扩展（图版11,12,13,1411,12,13,14）神经胚期NEURULASTAGE20H2H23橙黄色ORANGEYELLOW圆柱形脊索形成，胚体前端出现头部的雏形，视泡出现，胚孔关闭（图版1515）体节期SOMITESTAGE22H13H23橙黄色ORANGEYELLOW出现体节并逐渐增多（图版16,1716,17）翻转期TURNOVERSTAGE35H21H23棕黄色CLAYBANK胚体头部逐渐从动物极翻转到植物极，心脏出现，视杯出现（图版18,19,20,2118,19,20,21）血管形成期ANGIOGENESISSTAGE56H16H23棕黄色CLAYBANK血管系统成型（图版22,2322,23）器官形成期ORGANFORMATIONSTAGE72H127H23棕黄色CLAYBANK各器官的功能逐渐完善，并有少数器官形成，心脏跳动次数增加，胸鳍很长，腹鳍开始发育，臀鳍、尾鳍和背鳍仍然连成一片（图版24,2524,25）孵化期HATCHINGSTAGE199H1H仔鱼突破卵膜孵出（图版2626）21卵裂前期受精卵呈长椭圆形，长径20MM01MM，短径090MM01MM，长径约为短径的1倍。卵膜无粘性，富有弹性，位于动物极一端纤维状的附着丝附着在瓦罐上。卵黄呈橙黄色，有一个直径约032MM大的油滴和许多小油球无规则地散布15在卵黄中。受精卵吸水膨胀而举起卵膜，使卵膜与卵黄囊之间形成围卵周隙，植物极的围卵周隙比动物极大。卵黄囊在卵黄周间隔形成以后变小，整个卵的长度也有所增加。卵黄上的原生质不断向动物极集中，受精一小时后，胚盘形成,从侧面观可见胚盘如帽状隆起，为一个大细胞，标志着准备期的结束。此期受精卵由于吸水膨胀，长径由约20MM伸长到约23MM，后期长径变化不大。（图版1,21,2）22卵裂期（1H）受精后15H受精卵在胚盘顶部中央产生一裂痕并逐渐加深形成分裂沟，把胚盘一分为二，形成大小相似的2个分裂球，进入2细胞期（图版33）。受精后2H在第一道分裂沟的垂直位置出现第二道分裂沟，进入4细胞期（图版44），25H进入8细胞期，3H进入16细胞期（图版55），16细胞期时细胞还只有一层，均匀分布在卵黄囊上，35H左右进入32细胞期（图版66）。32细胞期后，胚盘上的细胞愈分愈小，呈不规则排列，细胞会继续分裂成64细胞期。在64细胞期后，细胞继续变小并开始重叠，卵裂球细胞逐渐排列为两层，标志着卵裂期的结束。属典型的端黄卵盘状卵裂。（图版77）23囊胚期（5H）经过卵裂，受精卵被分割成很多小细胞，细胞边界无法分辨，胚盘与卵黄之间形成囊胚腔，囊胚中部突起呈帽状。受精后5H胚胎发育至囊胚阶段，随后囊胚隆起逐渐降低，并向卵黄部分下包，进入囊胚晚期。此期可根据囊胚的高低分为高囊胚和低囊胚。（图版8,9,108,9,10）24原肠期（10H）受精后10H起胚盘不断从动物极向植物极下包，当下包达卵黄L/4左右时，胚盾出现，胚盾处的内卷边缘为背唇，进入原肠前期（图版1111）。此后胚层继续向下扩张，当下包达卵黄的1/2时，胚环明显，为原肠中期（图版1212）。之后胚层继续下包至卵黄的3/4左右时，胚层内部的细胞开始向一侧集中、伸展，出现胚体的雏形，胚层外部细胞仍然包裹卵黄，形成胚外膜，进入原肠后期（图版13，1413，14）。此期油滴的数量开始明显变少。16图版公子小丑鱼胚胎发育各时期的形态照片。注图版2中白色箭头代表原生质迁移方向,图版14中白色箭头代表胚层细胞移动方向。1、2准备期；3、4、5、6、7卵裂期；8、9、10囊胚期；11、12、13、14原肠期；15神经胚期；16、17体节期；18、19、20、21翻转期；22、23血管形成期；24、25血管形成完善期；26孵化期。AF臀鳍；B胚盘；BT分裂球；BV血管；BVE脑泡；C卵膜；CF分裂沟；CV空腔；CY原生质；DF背鳍；DL背唇；E眼睛；EB胚体；EP胚孔；ES胚盾；FT附着丝；GR胚环；H头部；HT心脏；M口；MP黑色素细胞；MY肌节；N脊索；O油滴；OC视杯；OT耳1234567891011121314151617181920212223242526OYFTCCFBTTPSESGRSBVBVETOCHTEBEPPFDFMPAFTFMPCYDLOVHDLBHTNCVHCVCVMP、MPMPMPMPOCMYMPTBVEOTHT17石；OV视泡；P腹鳍；PF胸鳍；PS围卵周隙；S体节；T尾；TF尾鳍；Y卵黄；PLATEMORPHOLOGICALPATTERNOFTHEEMBRYONICDEVELOPMENTALSTAGESOFAMPHIPRIONOCELLARISPHOTONOTETHEWHITEARROWSINPLATE2REPRESENTTHEDIRECTIONOFCYTOPLASMMIGRATION,THEWHITEARROWSINPLATE14REPRESENTTHEDIRECTIONOFMESODERMALCELLSMOVEMENT1、2PREPARATIONSTAG；3、4、5、6、7CLEAVAGESTAGE；8、9、10BLASTULASTAGE；11、12、13、14GASTRULASTAGE；15NEURULASTAGE；16、17SOMITESTAGE；18、19、20、21TURNOVERSTAGE；22、23ANGIOGENESISSTAGE；24、25ORGANFORMATIONANDPERFECTIONSTAGE；26HATCHINGSTAGEAFANALFINBBLASTODISCBTBLASTOMEREBVBLOODVESSELBVEBRAINVESICLECCHORIONCFCLEAVAGEFURROWCVCAVITYCYCYTOPLASMDFDORSALFIN；DLDORSALLIPEEYEEBEMBRYONICBODYEPEMBRYONICPOREESEMBRYONICSHIELDFTFIBROUSSTALKGRGERMRINGHHEADHTHEARTMMOUTHMPMELANOPHOREMYMYOMERENNOTOCHORDOOILGLOBULEOCOPTICCUPOTOTOLITHOVOPTICVESICLEPPELVICFINPFPECTORALFINPSPERIVITELLINESPACESSOMITETTAILTFTAILFINYYOLK1234567OFTYBFTCYCPSCFBTT18图版公子小丑鱼胚胎发育各时期的形态照片。注图版2中白色箭头代表原生质迁移方向,图版14中白色箭头代表胚层细胞移动方向。1、2准备期；3、4、5、6、7卵裂期；8、9、10囊胚期；11、12、13、14原肠期；15神经胚期；16、17体节期；18、19、20、21翻转期；22、23血管形成期；24、25血管形成完善期；26孵化期。AF臀鳍；B胚盘；BT分裂球；BV血管；BVE脑泡；C卵膜；CF分裂沟；CV空腔；CY原生质；DF背鳍；DL背唇；E眼睛；EB胚体；EP胚孔；ES胚盾；FT附着丝；GR胚环；H头部；HT心脏；M口；MP黑色素细胞；MY肌节；N脊索；O油滴；OC视杯；OT耳石；OV视泡；P腹鳍；PF胸鳍；PS围卵周隙；S体节；T尾；TF尾鳍；Y卵黄；PLATEMORPHOLOGICALPATTERNOFTHEEMBRYONICDEVELOPMENTALSTAGESOFAMPHIPRIONOCELLARIS891011121314151617181920212223242526ESDLGRDLOVEBNEPHCVMP、SMPHCVTMPCVOCHTMPMPMPBVBVOCBVEHTHTEMYOTMPPFTFDFMPAFT19PHOTONO