编制说明-飞行时间质谱校准规范-v12

国家计量技术规范规程制修订飞行时间质谱仪校准规范（报批稿）编写说明中国计量科学研究院广东省计量科学研究院南京市计量监督检测院2013年5月飞行时间质谱仪校准规范（报批稿）编写说明一、任务来源根据国家质量监督检验检疫总局2009年国家计量技术法规计划（国质检量函2009393号）立项，由中国计量科学研究院、广东省计量科学研究院和南京市计量监督检测院共同承担飞行时间质谱仪校准规范的制定工作。二、规范制定的必要性飞行时间质谱仪是一种高分辨质谱仪，这类仪器的质量分析器是一个离子漂移管。由离子源产生的离子加速后进入无场漂移管，并以恒定速度飞向离子接收器。离子质量越大，到达接收器所用时间越长，离子质量越小，到达接收器所用时间越短，根据这一原理，可以把不同质量的离子按质荷比的大小进行分离。与高端的傅立叶变换离子回旋共振质谱仪、离子阱静电场轨道阱质谱仪相比，飞行时间质谱仪具有可检测的分子量范围大，扫描速度快，仪器结构简单，价格便宜等优势。近年来随着蛋白质组学和代谢组学的发展，各实验室飞行时间质谱仪的数量迅速增加，这些仪器除了被用于基础科研外，还被广泛地用于样品检测。据不完全统计，各个检测和校准实验室每年使用飞行时间质谱仪出具的报告数量达到1000份以上。根据ISO/IEC170252005检测和校准实验室能力的通用要求，检测校准实验中使用的分析设备都应当经过检定或校准，以保证仪器的准确性和测定结果的可溯源性，从而保证各个检测和校准实验室在不同时间、不同地点测定结果的准确、可比。飞行时间质谱仪由于没有检定规程或者校准规范，无法对仪器进行检定校准，已经成为当前实验室认可工作中的瓶颈之一。通过制定飞行时间质谱仪校准规范，实现仪器的校准，可以保证我国飞行时间质谱仪出具检测报告的准确有效，保护人民大众的健康，保证国际贸易的公平。三、飞行时间质谱仪校准规范的制定过程1、2008年4月28日，起草小组向主要飞行时间质谱仪生产厂家安捷伦、沃特斯、布鲁克、AB和岛津公司发函，要求其提供各自生产的各种型号的飞行时间质谱仪的质量数范围、质量准确度、信噪比、分辨力、质量数漂移、校准品等信息，作为规范制定时的参考。随后，各个厂家相继返回相应信息。2、随后，规范制定小组根据仪器生产厂家提供的信息起草了飞行时间质谱仪校准规范初稿，2010年8月在国林宾馆召开了第一次专家意见征求会。会议邀请了长期从事计量和质谱分析的专家，规范起草小组向专家汇报了飞行时间质谱仪校准规范（初稿），专家针对飞行时间质谱仪校准规范（初稿）提出了宝贵的意见和建议。3、2010年12月18日至20日，飞行时间质谱仪校准规范起草小组在全国生物计量技术委员会年会上，汇报了修改后的飞行时间质谱仪校准规范（初稿），与会专家就该稿进行了讨论，进一步提出了宝贵的意见和建议。3、随后，飞行时间质谱仪校准规范起草小组在飞行时间质谱校准规范（初稿）的基础上，进一步修改形成了飞行时间质谱仪校准规范（修改稿）。2011年7月13日至15日，飞行时间质谱仪校准规范起草小组在全国生物计量技术委员会中期会议上，汇报了飞行时间质谱校准规范（修改稿），专家进一步提出了修改意见。4、2011年8月至2011年12月，根据中期会议专家意见，规范起草小组对飞行时间质谱仪校准规范（修改稿）进行了进一步的修改和完善，形成了征求意见稿，并通过互联网进行了更加广泛的意见征求工作。起草小组根据征求到的意见修改形成了飞行时间质谱仪校准规范（送审稿）。5、2011年12月，起草小组将送审稿提交至全国生物计量技术委员会审定通过，并根据审定意见进行了1年多的修改，最终形成报批稿。四、规范制定的主要技术依据及原则（一）依据飞行时间质谱仪校准规范主要参考了GB/T60412002质谱分析方法通则，依据JJF10712010国家计量校准规范编写规则、JJF105912012测量不确定度评定与表示等完成规范的制定，这是本规范是首次发布。在本规范制定过程中，也参考了现行有效的质谱仪校准规范，如JJF13172011液相色谱质谱联用仪校准规范、JJF11642006台式气相色谱质谱联用仪校准规范、JJF11202004热电离同位素质谱计校准规范、JJF11582006稳定同位素气体质谱仪校准规范等。（二）原则1、架构根据JJF10712010国家计量校准规范编写规则的要求，本规范架构上包括封面、扉页、目录、引言、范围、引用文件、术语和计量单位、概述、计量特性、校准条件、校准项目和校准方法、校准结果表达、复校时间间隔、附录几个部分。2、术语与计量单位的选择术语和计量单位的选择遵照JJF10012011通用计量术语及定义选择使用。3、计量特性确定原则根据飞行时间质谱仪的结构及特点、飞行时间质谱仪在实际中的应用和仪器生产厂家提供的信息，确定飞行时间质谱仪的计量特性；计量特性确定过程中也参照了现行有效的质谱仪校准规范如JJF11642006台式气相色谱质谱联用仪校准规范、JJF11202004热电离同位素质谱计校准规范、JJF11582006稳定同位素气体质谱仪校准规范中的计量特性指标。4、标准物质选则的原则考虑到用户对质量轴校准范围及不确定度水平要求的不同，飞行时间质谱仪校准时除信噪比、分辨力指标需要使用GLU1人纤维蛋白肽B含量国家有证标准物质外，其余指标校准均使用分子量国家有证标准物质，具体对象不做要求。根据用户对校准结果不确定度的需求不同，选择具有合适不确定度分子量的国家有证标准物质进行校准。五、规范制定说明飞行时间质谱仪校准规范包括封面、扉页、目录、引言、范围、引用文件、术语和计量单位、概述、计量特性、校准条件、校准项目和校准方法、校准结果表达、复校时间间隔以及附录几个部分，根据JJF10712010国家计量校准规范编写规则撰写。1、引言飞行时间质谱仪校准规范主要参考了GB/T60412002质谱分析方法通则，依据JJF10712010国家计量校准规范编写规则、JJF105912012测量不确定度评定与表示等完成规范的制定，这是本规范的首次发布。2、范围本规范适用于电喷雾飞行时间质谱仪和基质辅助激光诱导解吸飞行时间质谱仪的校准，其它类型的飞行时间质谱仪可参照本规范进行校准。2、引用文件飞行时间质谱仪校准规范的引用文件说明了本规范内容中引用的其它文献，包括JJF10012011通用计量术语及定义、GB/T60412002质谱分析方法通则。并且做出了说明凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本规范；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本规范。3、术语和计量单位本部分对飞行时间质谱仪校准规范中使用的名词术语进行了定义，包括相对相对原子质量、质荷比、分辨（能）力、信噪比、稳定性等。4、概述本部分主要用文字和图示的方式阐述了飞行时间质谱仪的用途、原理和结构。5、计量特性本部分规定了飞行时间质谱仪的计量特性，经过对厂家和用户的调研（附录A），选择了示值误差、信噪比、分辨力、重复性、稳定性5个指标作为飞行时间质谱仪的计量特性指标。根据JJF10712010国家计量校准规范编写规则的要求，计量特性指标中没有给出各项计量特性指标的具体限定值，但是，当用户要求时，可以根据用户提供的计量特性的最大允许误差进行符合性判定，并将结论列入校准证书。6、校准条件本部分主要规定了飞行时间质谱仪校准时需要满足的环境条件，以及使用的标准物质。在环境条件中，首先要求了实验室环境应当满足仪器的安装要求，不得存在强烈的机械振动和电磁干扰，校准温度时实验室温度应当控制在（1530），相对湿度不大于80。为防止环境温度改变引起的飞行时间质谱测定结果的漂移，要求校准过程中环境温度变化小于3。在标准物质部分，规定了进行飞行时间质谱仪校准时所用的标准物质。考虑到用户要求的不同，示值误差校准时应选择能够均匀覆盖所校区间内35个质荷比的一种或多种分子量国家有证标准物质进行校准，具体种类不做要求；重复性和稳定性校准时应选择所校区间中段附近一种分子量国家有证标准物质进行校准，其不确定度水平应当满足用户对校准结果的需求；信噪比和分辨力校准时使用GLU1人纤维蛋白肽B国家有证标准物质，其含量定值结果相对扩展不确定度不应大于10（K2）。飞行时间质谱仪校准时应采用国家有证标准物质，如果标准物质证书中已经规定了标准物质的使用方法，按照标准物质证书中要求使用即可；如果标准物质证书中没有给出具体的使用方法或配制方法，则需要检定员自行配制校准用的标准溶液，所需化学试剂包括水、甲酸、乙腈、三氟乙酸、氰基4羟基肉桂酸、芥子酸，应优先选用质谱级的试剂。具体的配制方法在附录A中进行了描述。7、校准项目和校准方法本部分主要针对飞行时间质谱仪示值误差、信噪比、分辨力、重复性、稳定性的计量特性的具体测定方法作出了要求。并对电喷雾质谱仪和基质辅助激光诱导解吸飞行时间质谱仪两类不同原理的仪器分别具体描述了校准方法。在进行示值误差校准时，如果是电喷雾质谱仪，直接采用流动注射的方式进行校准。为了保证质荷比测定结果的准确性，在校准之前应当调节合适的流动注射流速和调谐条件，确保仪器工作状态正常，信号灵敏度适中，检测器未达到饱和状态。在对一级质谱（MS）模式下质荷比测定结果的示值误差进行校准时，应当注入能够均匀覆盖所校区间内35个质荷比的一种或多种相对分子质量国家有证标准物质进行校准，并在一级质谱（MS）模式下分别记录各个质谱峰的质荷比。每个质谱峰重复三次取其平均值，根据公式（1）计算各个质谱峰质荷比测量值与标准值之间的相对示值误差。测定二级质谱（MS/MS）模式下质荷比的相对示值误差时，选择所校区间内至少1个子离子的质谱峰，所选子离子的质荷比应当覆盖用户提出的校准区间或与用户感兴趣的校准点接近。重复测定三次子离子质谱峰的质荷比并取其平均值，计算测量值与标准值之间的相对示值误差。单级飞行时间质谱不进行二级质谱（MS/MS）模式下质荷比测定示值误差的校准。基质辅助激光诱导解吸飞行时间质谱仪的校准应在线性模式下进行，如需在反射模式下校准，可参照线性模式下的校准进行。校准前首先对仪器进行调谐，确保仪器工作状态正常，信号灵敏度适中，检测器未达到饱和状态。在一级质谱MS模式下进行质荷比测定相对示值误差校准时，应分别将能够均匀覆盖所校区间内35个质荷比的一种或多种相对分子质量国家有证标准物质点在靶上，待自然干燥后推入MALDI源中分别记录各个质谱峰的质荷比。每个质谱峰重复测定三次取其平均值，根据公式（1）计算各个质谱峰质荷比测量值与标准值之间的相对示值误差。测定二级质谱（MS/MS）模式下质荷比的相对示值误差时，选择所校区间内至少1个子离子的质谱峰，所选子离子的质荷比应当覆盖用户提出的校准区间或与用户感兴趣的校准点接近。重复测定三次质荷比取其平均值，计算质谱峰质荷比测量值与标准值之间的相对示值误差。同样的，单级飞行时间质谱仪不进行二级质谱（MS/MS）模式下质荷比测定示值误差的校准。由于受到基质的干扰，基质辅助激光诱导解吸飞行时间质谱仪一般不对500以下质荷比范围进行校准。,C,C,MIIIMMIM（1）式中，MM,I第I个质谱峰质荷比三次测定结果的算术平均值，单位U；MC,I第I个质谱峰质荷比的标准值，单位U。在进行信噪比校准时，由于GLU1人纤维蛋白肽B在使用电喷雾电离源时带两个电荷，在使用MALDI源时仅带有一个电荷，所以应当区别对待。对于电喷雾质谱仪，通过流动注射方式以10L/MIN流速注入04G/MLGLU1人纤维蛋白肽B标准物质溶液，采集双电荷分子离子峰785的质谱图，根据公式（2）计算信噪比，重复测定三次取其平均值。对于基质辅助激光诱导解吸飞行时间质谱，采集靶上GLU1人纤维蛋白肽B的分子离子峰1570的质谱图，根据公式（2）计算信噪比，重复三次取其平均值。SH/HN（2）式中S信噪比；HGLU1人纤维蛋白肽B双电荷或单电荷分子离子峰的信号强度；HN基线噪声信号强度。在进行分辨力校准时，同样采用GLU1人纤维蛋白肽B标准物质进行校准。对于电喷雾质谱仪，通过流动注射方式以10L/MIN流速注入2G/ML的GLU1人纤维蛋白肽B标准物质溶液，采集双电荷分子离子峰785U的质谱图，由数据处理软件读出分辨力，重复三次取其平均值。对于基质辅助激光诱导解吸飞行时间质谱仪，采集靶上GLU1人纤维蛋白肽B的分子离子峰1570U的质谱图，由数据处理软件读出分辨力，重复三次取其平均值。在进行重复性校准时，在一级质谱（MS）模式下选择校准区间中段处的某一质谱峰，连续测量六次该质谱峰的质荷比，根据公式（3）计算相对标准偏差，作为重复性的评价。621110061IIXXRX3式中R相对标准偏差，以百分数表示；XI第I次质谱峰质荷比的测定值，单位U；6次质荷比测定结果的平均值，单位U；在进行质谱稳定性校准时，应在一级质谱（MS）模式下选择校准区间中段处的某一质谱峰，连续测量三次该质谱峰的质荷比，取其平均值。2个小时以后重复上述测定过程，根据公式（4）计算质荷比的相对漂移作为稳定性的评价。100MMDM（4）式中2小时后质荷比三次测定结果的平均值，单位U；初始时质荷比三次测定结果的平均值，单位U。8、校准结果的表达和复校时间间隔经校准后的飞行时间质谱仪应填发校准证书，校准证书应符合JJF10712010中512的要求，并给出各校准项目名称和测量结果以及扩展不确定度。当用户要求时，可以根据用户提供的计量特性最大允许误差进行符合性判定，并将结论列入校准证书。参照其它类型质谱仪校准规范的复校时间间隔，复校时间间隔原则上由用户决定，建议不超过1年。9、附录本部分主要对标准物质溶液配制方法、飞行时间质谱仪校准记录内容、校准证书内页内容及不确定度评定等进行了具体的描述和规定。飞行时间质谱仪校准规范制定起草小组2013年5月附录A飞行时间质谱仪校准规范中计量特性及参考值的确定中国计量科学研究院、广东省计量科学研究院和南京市计量监督检测院承担了飞行时间质谱仪校准规范制定任务以后，首先通过问卷调查的方式，针对主要的飞行时间质谱仪生产厂家如布鲁克公司、AB公司、安捷伦公司和岛津公司，发放了调查问卷（附录B）。对各个公司各种类型的飞行时间质谱仪进行了摸底调查，主要了解了飞行时间质谱仪的主要计量特性如质量数范围、质量准确度、信噪比、分辨力、质量数漂移等技术指标，以及使用的校准品的信息进行了初步的调查。随后，各个公司相继返回调查表格，见表1表6。表1布鲁克公司QTOF类仪器调查问卷表型号质量数范围质量准确度灵敏度分辨力质量数漂移校准品QTOF全扫描MS/MS全扫描MS/MSBRUKERMICROTOFQII3,000M/Z5020,000M/Z内标2PPM；外标5PPM内标2PPM；外标5PPM15FMOL，信噪比大于1001（马肌红蛋白）25FMOL，信噪比大于501（多肽GLUFIBRINOPEPTIDEB碎片离子中最强Y离子）17,500（922M/Z）ATFULLSENSITIVITY一小时内漂移小于2MDAAGILENTTUNINGMIX表2布鲁克公司MALDITOF/TOF类仪器调查问卷表型号质量数范围质量准确度灵敏度分辨力质量数漂移校准品线性模式反射模式线性模式反射模式线性模式反射模式线性模式反射模式BRUKERAUTOFLEXIII500,000DA无指标内标35PPM；外标100PPM内标5PPM；外标20PPM500AMOL，信噪比大于201（多肽GLUFIBRINOPEPTIDEB,M/Z15707）500AMOL，信噪比大于201（多肽GLUFIBRINOPEPTIDEB,M/Z15707）5,000（多肽ACTH1839,M/Z24652）20,000（多肽SOMATOSTATIN28,M/Z31477）外较准能保持24小时BRUKERULTRAFLEXIII500,000DA无指标内标20PPM；外标50PPM内标3PPM；外标15PPM250AMOL，信噪比大于201（多肽GLUFIBRINOPEPTIDEB,M/Z15707）250AMOL，信噪比大于1001（多肽GLUFIBRINOPEPTIDEB,M/Z15707）6,000（多肽ACTH1839,M/Z24652）25,000（多肽SOMATOSTATIN28,M/Z31477）外较准能保持24小时BRUKERMICROFLEX300,000DA无指标内标50PPM；外标150PPM内标15PPM；外标75PPM1FMOL，信噪比大于101（多肽GLUFIBRINOPEPTIDEB,M/Z15707）1FMOL，信噪比大于101（多肽GLUFIBRINOPEPTIDEB,M/Z15707）3,500（多肽ACTH1839,M/Z24652）15,000（多肽SOMATOSTATIN28,M/Z31477）表3岛津公司MALDITOF/TOF类仪器调查问卷表型号质量数范围质量准确度灵敏度分辨力质量数漂移校准品线性模式反射模式线性模式反射模式线性模式反射模式线性模式反射模式AXIMAPERFORMANCE1TO500KDA1TO80KDA5000FWHMACTH1839MH2465DA20,000FWHMACTH738MHWITHEXTERNALCALIBRATIONWITHEXTERNALCALIBRATIONLOADED3660DA表4安捷伦公司QTOF类仪器调查问卷表型号质量数范围质量准确度灵敏度分辨力质量数漂移校准品QTOF全扫描MS/MS全扫描MS/MS6510504000120002PPM5PPM5PG利血平S/N1015PG利血平S/N50113000AT2772M/Z122，922表5AB公司QTOF类仪器调查问卷表型号质量数范围质量准确度灵敏度分辨力质量数漂移校准品QTOF全扫描MS/MS全扫描MS/MSQSTARELITE56000M/Z540,000M/Z2PPM（内标）5PPM左右1PG利血平1PG利血平S/N195115,000牛胰岛素2PPM16小时PPG；RESERPINE；5PPM（外标）S/N451M6H6，M/Z956APOMYOGLOBIN；TAUROCHOLICACID；RENIN表6AB公司MALDITOF/TOF类仪器调查问卷表型号质量数范围质量准确度灵敏度分辨力质量数漂移校准品线性模式反射模式线性模式反射模式线性模式反射模式线性模式反射模式4800500KDA30PPM内标）；100PPM（外标）25PPM内标；10PPM外标AMOLFMOL100AMOLNEUROTENSIN,S/N501,普通不锈钢MALDI样品板；2,000（宽质量范围）25,000宽质量范围无明显漂移DESARG1BRADYKININANGIOTENSINIGLUFIBRINOPEPTIDEBACTHNEUROTENSINWATERS公司返回信息如下（1）WATERSQTOFMICRO质量数范围Q4000DAQTOF20000DA质量准确度全扫描5PPMMSMS5PPM内标灵敏度全扫描200FMOL，离子计数大于166（马心肌红蛋白分子量16952）MS/MS20FMOL,S/N301（GLUFIBB，分子量1569DA）分辨力5000质量数漂移校准品碘化铯CSI（2）WATERSQTOFSYNAPT质量数范围Q4000DA8000,32000QTOF100000DA质量准确度全扫描2PPMMSMS2PPM内标灵敏度质量数漂移校准品碘化铯CSI经过讨论，飞行时间质谱仪校准规范起草小组选定示值误差（即通常所说的质量准确度）、信噪比（业界的灵敏度）、分辨力、重复性和稳定性（即通常所说的质量数漂移）作为仪器的计量特性指标；而质量数范围更多的与仪器设计和应用有关，并且是仪器自身的一个属性，因此未将质量数范围列为仪器的计量特性指标。在校准时质谱数据采集模式上，主要考虑对全扫描模式，即一级质谱（MS）模式和二级质谱MS/MS进行校准；同时考虑到市场上有相当一部分MALDITOF（单TOF）在使用，因此所有的MALDI校准项目都在线性模式下进行。但是，规范中也指出，如果用户有需要，可以参考线性模式下的校准方式，在反射模式下进行校准。针对示值误差的计量特性，对于QTOF类的仪器（TOF与此类似），厂家的指标外标法均优于5106，在后续的仪器测试中，所测试的仪器在经过校准以后立即测定均可以达到这个指标，但是考虑到仍有部分实验室由于环境条件等受到限制，温度波动等非最佳测量条件导致相对示值误差超过仪器的性能指标，因此将指标放宽至20106，此时可以满足一般的蛋白质鉴定（50106）等应用需求。对于MALDITOF类的仪器，根据厂家提供的仪器性能参数，定为200106，此时所有测试过的仪器均能达到该指标。针对信噪比的计量特性，由于各厂家使用的校准品不一致，因此采用统一的04G/ML（250FMOL/L）的GLU1人纤维蛋白肽B进行实际测试，在实际测试的机器中，其信噪比均高于80，取其作为计量特性的指标。针对分辨力的计量特性，根据厂家提供的指标，在宽质量范围内分辨力不低于2000，以此作为该计量特性的指标。针对测量重复性，经过实际测试，在仪器状态调谐稳定的情况下各个厂家仪器的测量重复性均能保持在较好的状态，LCQTOF仪器测量重复性最小为0，一般在104的数量级，而MALDI由于基质结晶情况的不一样，重复性相对较差，一般均可达到104的数量级，即使当相对示值误差达到100106时重复性仍可达到103数量级，因此将指标订在103。针对稳定性，仪器指标均在2106/H左右，这是仪器在最佳条件下的值，但是考虑到各个实验室实际环境往往达不到仪器最佳条件，经过实测，在温度控制3C时，实测2小时质量数漂移均小于20106，但在仪器环境条件不受控的条件下可达到80106，因此指标订为20106。附录B飞行时间质谱仪调查问卷随着生命科学的发展及质谱研发水平的提高，越来越多的液相色谱四极杆飞行时间质谱联用仪（LCQTOF）及基质辅助激光诱导解析飞行时间质谱（MALDITOF及MALDITOF/TOF）应用到质量监督、食品安全、生物安全、检验检疫、药物分析等检测实验室中。根据中国合格评定国家认可委员会的相关规定，检测实验室的建立应当符合“CNAS170252005检测和校准实验室能力的通用要求”，对出具检测数据的仪器进行定期检定或校准。然而，由于我国尚未制订液相色谱四极杆飞行时间质谱联用仪及基质辅助激光诱导解析飞行时间质谱校准规范，成为这些实验室通过实验室认可的障碍之一。国家质量监督检验检疫总局高度重视新型质谱仪校准规范的制订，先后制订了JJF11582006稳定同位素气体质谱仪校准规范、JJF11642006台式气相色谱质谱联用仪校准规范等。中国计量科学研究院隶属国家质检总局，