烟草马铃薯y病毒外壳蛋白基因全长orf的克隆与原核表达

1、 河南农业大学学报Vol_42 No3 第42卷第3期2008年6月Journalof Henan2008JunAgricultural University文章编号：10002340(2008)030337一04烟草马铃薯Y病毒外壳蛋白基因全长ORF的克隆与原核表达 关祥斌，王 枫，冯振群，蒋士君 (河南农业大学植物保护学院，河南郑州450002) 摘要：采集河南自然发病的烟草通过摩擦接种至实验室烟草后直接提取总RNA，利用反转录一聚合酶链反应 CP)基因；经Nde I和Sal I双酶切处理的PCR产(RTPCR)扩增获得了烟草马铃薯Y病毒外壳蛋白(PVYHN 物，连接克隆至大肠杆茵表达栽体

2、pET28a(+)，构建了重组质粒pPVYCP，所获得的重组质粒经过酶切、测序鉴 定，证实正确插入了PVYHN CP基因的全长ORF序列分析表明，PVYHN CP基因由804个核苷酸组成，编码 267个氨基酸残基；重组的pPVYCP表达载体转化大肠杆茵BL21(DE3)pLysS，经IPTG诱导，SDS-PAGE电泳显 示分子量为32 kDa的CP蛋白得到了诱导表达 关键词：烟草；马铃薯Y病毒；外壳蛋白基因；克隆；原核表达 中图分类号：S 43572；Q 786文献标识码：Aof theFull-Length ORF of PVYCloning，Prokaryotic ExpressionCP

3、 Gene Isolated from Infected Tobacco PlantsGUANXiang-bin，WANG Feng，FENG Zhenqun，JIANG Shijun (College of Plant Protection，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China)Abstract：The tobacco total RNA was extracted from tobacco seedlings whichwere manuallyinoculatedwith PVYHN isolatedfrom natur

4、ally infected tobacco plantsin Henan ProvinceFrom the total RNA 。full-length ORF of PVY-HNCP gene was amplified by RT-PCRThe PCR product was digested bytheNde I and Sal I and then cloned into plasmid pET28a(+)to construct the recombinant pPVYCPTheCP gene consistedof 804results of restriction and seq

5、uencing identification suggested that the PVYHN bp which encode 267 amino acids and the obtained recombinant plasmid was proved to be inserted cor-rectly with the desired fragmentsAfter the recombinant pPVYCP transformed into Ecoli B122 1(DE3)pLysS，the target PVYHN CP protein was inducedby SDS-PAGE

6、analysis IPTG andits molecular size was about 32 kDa byKey words：tobacco；PVY；CP gene；cloning；prokaryotic expression在亚洲开始呈上升发展的趋势PVY在自然条件下以蚜虫非持久性传毒为主，也可通过汁液摩擦、嫁接等方式传播该病毒可以侵染至少34属163 种的植物，以茄科、藜科和豆科植物受害严重PVY 侵染烟草后引起脉坏死、褐脉病、黄斑坏死等症状， 马铃薯Y病毒(Potato Virus Y，PVY)是马铃薯Y 病 毒 科 (Potyviridae) 马 铃 薯 Y 病 毒 属(Potyv

7、ir us)的重要成员，于1931年在马铃薯上首次发 现，从1953年起PVY在欧洲尤其是在马铃薯广 收稿日期：20071024 基金项目：河南省烟草专卖局重点攻关项目(HNYC 2006一01) 作者简介：关祥斌(1982一)男，河南辉县人，硕士研究生，从事分子植物病毒学研究；通讯作者：蒋士君 338河南农业大学学报第42卷是目前中国烟草上普遍发生的重要病毒病之一，产 量损失高达25451 3为防治病毒病，在烟叶生产中必须做好对病毒的检测 获得高效的PVY 抗血清对于建立PVY的检测预警系统、指导病毒 病的防治具有重要意义在植物病毒检测中血清学 方法因其特异性强、灵敏度高、快速、准确的优点而

8、被广泛应用利用抗血清对PVY的检测主要应用 于马铃薯生产， 国内 PVY 抗血清主要依赖于进口M。1尽管国内已经有报道利用克隆的烟草环斑病毒、烟草蚀纹病毒CP基因来制备抗血清并应用于烟草病毒病的检测，o，但利用该策略检测烟草的PVY在国内尚未见报道本研究旨在针对严重烟草的PVY，通过克隆其CP基因、构建原核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达高纯度的PVY 照上海捷瑞生物工程(GK3091)说明书严格操作 RNA提取试剂盒 123eDNA第l链的合成 用特异引物PVY 3R合成eDNA，方法参照Fermentas公司的cDNA 第l链合成试剂盒(K1621)说明书 124 PVY CP基因的PCR扩

9、增反应体系包括反转录产物的10倍稀释液l斗L，引物5F，3R(10弘珊olL“)各l斗L，10Pfu Bufier 5斗L，Pfu DNA聚合酶1 IxL，dNTP(25 mrnolL。each)4斗L，ddH，0 37 p,LPCR反应程序设置：945 rain；后s，6012 45 s，72 oCmin，共30个循环； 94452然后72终延伸8 minPCR产物用10 gL“的琼脂糖凝胶电泳检测，并用TaKaRa的胶回收试剂 盒(DV805A)回收 外壳蛋白抗原，为今后制备特异性抗血清、建立烟 草PVY的血清学检测技术奠定基础 pPVYCP原核表达载体的构建及测序验证 125I和Sal

10、I双酶切处将纯化后的PCR产物经Nde理，再与经同样双酶切的载体pET28a(+)连接，转化大肠杆菌JMl09，菌液PCR初步筛选阳性克隆，抽提其质粒DNA 并双酶切鉴定阳性克隆 将阳性1材料与方法11材料 菌种与质粒大肠杆菌菌株JMl09，BL21 111转化子测序(北京博尚生物技术证其插入方向及序列的正确性 )，以验 (DE3)pLysS由河南农业大学植物保护学院分子植物病理学实验室保存质粒pET28a(+)由河南农 业大学植物保护学院昆虫实验室惠赠 外源基因的诱导表达将筛选到的阳性重 126组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，在含有Kan的LB平板上挑取单菌落，接人3 mL的

11、含有Kan的LB培养液中，37震荡培养过夜4 cc离心 112酶、试剂及试剂盒 限制性内切酶Nde I， SalI，反转录试剂盒购自Fermentas公司；T4 DNA连接酶购自Promega公司；Pfu DNA聚合酶购自 TIANGEN公司；Taq DNA聚合酶、胶回收试剂盒、收集菌体，等体积悬浮后按照1：100的比例稀释到 50 mL含有Kan的LB培养液中，振荡培养至OD。 值为06，加入IPTG至终浓度为1 mmoL，诱 DNAMarker、蛋白Marker购自TaKaRa公司；质粒小样提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司 导培养3 h，取1 mL培养液经10 000 r

12、rain“离心rain，收集菌体，加入100 1pL的SDSPAGE样品113PVY毒源采集PVY毒源采自河南宝丰缓冲液，煮沸10 rain，离心后取上清置4备用县烟田自然发病烟株(品种NC89)，经过摩擦接种 于健康烟草(品种K326)，待烟草显示典型的PVY 症状后取心叶进行下步试验 127SDSPAGE电泳浓缩胶质量浓度为50 gL，分离胶质量浓度为150 gL，在电极缓 冲液(125 mmolLTris-HCl，125 toolL“甘氨12方法 酸，5 gL。1 SDS)中电泳70 V恒压浓缩样品，90121RTPCR引物设计与合成 根据GenBank V恒压电泳3 h考马斯亮蓝染色液

13、染色1 h，然后 中已登录的PVY CP基因的序列(登录号再用考马斯亮蓝脱色液脱色至背景清晰为止 AY841267，AY74273l，AY742729)，设计合成了一 对序列特异性引物PVY 5F和PVY 3R，并由上海 2结果与分析捷瑞生物合成，序列如下：PVY 5F：21 PVY CP基因的RTPCR扩增5 GGAATTCCATATGGCAAATGACACAATTCATGCA 以带毒烟草心叶的总RNA经过反转录合成的GGAGGAAGCAATAAGA一3 7；PVY 3R：5一TCCCTCGAC TCACATGTTCTTGACTCCAAGTAGAGTATGCATACeDNA为模板，利用特异-

14、3I物对PVY 5F3R进行PCR扩增，得到一长度为826 bp的DNA条带(图 3(下划线分别为Nde I和Sal I酶切位点) 122植物总RNA的提取植物总RNA提取按l，箭头所指处)，其大小与预期一致 第3期关祥斌等：烟草马铃薯Y病毒外壳蛋白基因全长ORF的克隆与原核表达 339酸及氨基酸同源性均最大，说明本研究克隆得到的产物正是PVY CP基因，同时说明河南烟草PVYCP基因具有相当的保守性 】对照；2RTPCR产物；MDL2000 1Negative Control；2RTPCR product：MDL2000 图1 RT-PCR扩增PVY病毒CP基因PVY CP gene by

15、RT-PCRFig1 Amplified22MIM2标准分子量Marker；1PCR扩增产物；2和3重组质粒Nde pPVYCP重组表达质粒的构建 I和Sal I双酶切；4pET28a(十)Nde I和Sal I双酶切 胶回收的RT-PCR产物与pET28a(+)表达载 体分别进行Nde I和Sal I双酶切，经T4连接酶连接后，获得了重组表达质粒pPVYCP，转化大肠杆菌JMl09经菌液PCR鉴定，获得了一大小为826 bp的目的条带(图2，箭头所指处)，与预期结果相 符；提取其质粒进行Nde I和Sal I的双酶切鉴定，MIDL2 000：M2XHind m digest DNA mark

16、er；1The products of PCR amplification：23Recombinant plasmid digestion by Nde I and Sal I；4pET28a(+)digestion by Nde I and Sal I 图3重组质粒pPVYCP的酶切鉴定 Retrying therecombinant pPVYCPFig3by restriction digestion得到大小为5308bp(图3，左边箭头所指处)和 24 PVY CP蛋白在Ecoil中的诱导表达 807 bp(图3，右边箭头所指处)的2条带，说明得 到了涵有PVYCP基因的原核表达载体pP

17、VYCP 将 重 组 质 粒 pPVYCP 转 化 大 肠 杆 菌 BL21(DE3)pLysS感受态，挑选单菌落，经过IPTG诱导，表达蛋白的经SDSPAGE电泳检测，特异性地表达出了一大小约32 kDa(图4，箭头所指处)的蛋 白质，表达产物的大小与理论值相符；未经诱导的 含有重组质粒的菌株则不能产生此蛋白说明原核 表达载体pPVYCP构建成功 MD12000；1圈敞PCR严物；2对照MD12000 DNA marker；1The product of colony PCR；2Negative control 图2菌液PCR结果Results of Colony PCRFig223序列测定

18、结果 1Ecoli(含有pPVYCP)未诱导时的全蛋白；2Ecoli(含有pPVY CP)经诱导时的全蛋白；M低分子量蛋白标准 1Protein of the uninduced Ecoli with pPVYCP；2Protein of the in- duced Ecoil with pPVYCP；MProtein MW marker(Low) 测序结果表明， 克隆到的PVY CP基因全长ORF为804 bp，编码267个氨基酸，且PVY CP基因正确插入至pET28a(+)表达载体 获得的PVYCP基因序列经Blast检索比对， 其同源物全部为PVY CP基因，与GenBank中所公图4

19、 PVY-HN CP基因的表达产物SDS-PAGE电泳 Fig4 SDSPAGE analysis of expressed PVYHN CP product 开的PVY CP基因的核苷酸同源性高达926一998，推导的氨基酸序列同源性高达945一 984其中，与2个河南许昌烟草PVY分离物(GenBank登录号：AY841267，AY841258)的核苷 3讨论1)目前，植物病毒的诊断方法有指示植物法、 河南农业大学学报 第42卷核酸检测法、血清学检测法、电镜检测法等，但以血清学方法最为简单、灵敏度高、特异性强、成本低、快速且结果易观察，适于大量样品的检测，目前已 JProc R Soc(L

20、ond)Biol B，193l，109：25l一266 谈文，吴元华烟草病理学M北京：中国农业32003：153154 4姚康生，蔡少华，贾士荣，等PVY单克隆抗体在马广泛应用于植物病毒的检测0传统的抗血清制 备是以提取的植物病毒粒子为抗原制备抗血清， 但由于植物体内的病毒含量不高，再加上提取过程 中的损失，提到的抗原产量和纯度往往不高，难以 制备特异性强、灵敏度高的抗血清，同时成本高，不能满足生产上的大量应用近年来，利用生物技术 构建植物病毒外壳蛋白的原核表达载体并在大肠杆菌高效表达，为高纯度抗原的大量制备以及高效 价抗血清的制备奠定了基础“”1，是今后的技术 发展方向 2)本试验克隆的PV

21、Y CP基因与GenBank中 登录的AY841267 ， AY841258 2 个许吕烟草PVY 分离物CP基因的同源性最高，说明所克隆到的 铃薯Y病毒株系调查中的应用J中国农业科学，1985(5)：92 5吴兴泉，陈士华，陈 涛，等河南省马铃薯Y病毒的分子检测与鉴定J河南农业科学，2007(10)： 6466 6宋吉轩，范士杰，董颖苹，等应用改进的DASELISA法快速检测马铃薯病毒J贵州农业科学， 2006，34(5)：6970 7王振东， 张敏 马铃薯Y 病毒普通株系外壳蛋白基因的克隆与原核表达载体的构建J农业生物技术学报，1998，6(4)：371374 8朱常香，宋云枝，王玫玫，等

22、烟草环斑病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清的制备J学，CP基因具有较高的保守性和代表性，能够代 PVY2005，20(4)：434437 表豫中烟草主产区侵染烟草的PVY下一步将克隆得到的PVY CP基因通过原核表达制备抗原，进而制备PVY抗血清，将比较适于豫中烟草PVY的特异检测，为烟草生产上测报、防治PVY病毒病提供技术支撑 9王秀敏，吴云锋，成巨龙，等烟草蚀纹病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达J西北农林科技大学学报，2006，34(6)：124127 金羽，文景芝植物病毒检测方法研究进展J 10黑龙江农业科学，2005(3)：3740 11BOONHAMN。TOMLINSON J，MUMF

23、ORD RMi 3)pPVYCP表达的目标蛋白N端引入的一段Histag和凝血酶(thrombin)蛋白酶切割位点，将有助于今后通过金属鳌和亲和层析系统进行纯化目 croarrays for rapid identification of plant virusesJAnnu Rev Phytopathol，2007，45：307328 12朱常香，王玉军，郭兴启，等烟草蚀纹病毒外壳蛋标蛋白而在其C端通过PVY CP基因的终止而白基因的克隆、原核表达及抗血清的制备J植物保护学报2005，32(4)：362366 终止蛋白的翻译，使表达的抗原蛋白不融合下游 的标签，将有助于获得效价更高的抗体“作

24、者下一步拟通过亲和层析法对目标蛋白进行高度纯化， 为制备特异性更强的多克隆抗体，以及建立更加有 效的PVY检测技术奠定基础 13付振艳，张振臣甘薯病毒G(SPVG)外壳蛋白基因的克隆、表达及其抗血清的制备J中国农学通 报，2007，23(1)：3841 14秦云霞，金，刘志昕，等黄花花叶病毒CP基参考文献：因原核表达及抗血清的制备J中国生物工程杂 志，2004，24(8)：7676 1 【15黄玉娜甘薯潜隐病毒(SPLV)外壳蛋白基因的克 隆、在大肠杆菌中的表达及检测技术研究D郑 2SMITH K MOn the composite nature of certain potato州：河南农业

25、大学，2007 diseases of the mosaic group as revealedthe use of by(责任编辑：丁丽) indicators and selective methods of transmission plant 烟草马铃薯Y病毒外壳蛋白基因全长ORF的克隆与原核表达 作者：关祥斌， 王枫， 冯振群， 蒋士君， GUAN Xiang-bin， WANG Feng， FENG Zhen-qun，JIANG Shi-jun河南农业大学植物保护学院,河南,郑州,450002作者单位：刊名： 河南农业大学学报JOURNAL OF HENAN AGRICULTURA

26、L UNIVERSITY英文刊名： 年，卷(期)：2008,42(3)参考文献(15条) 1.R.赫尔.马修斯 植物病毒学 20072.SMITH K M On the composite nature of certain potato diseases of the mosaic group as revealed bythe use of plant indicators and selective methods of transmission 19313.谈文;吴元华 烟草病理学 20034.姚康生;蔡少华;贾士荣 PVY单克隆抗体在马铃薯Y病毒株系调查中的应用 1985(05)5.

27、吴兴泉;陈士华;陈涛 河南省马铃薯Y病毒的分子检测与鉴定期刊论文-河南农业科学 2007(10)6.宋吉轩;范士杰;董颖苹 应用改进的DAS-ELISA法快速检测马铃薯病毒期刊论文-贵州农业科学 2006(05)7.王振东;张敏 马铃薯Y病毒普通株系外壳蛋白基因的克隆与原核表达载体的构建 1998(04)8.朱常香;宋云枝;王玫玫 烟草环斑病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清的制备期刊论文-学2005(04) 9.王秀敏;吴云锋;成巨龙 烟草蚀纹病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达期刊论文-西北农林科技大学学报2006(06) 10.金羽;文景芝 植物病毒检测方法研究进展期刊论文-黑龙江农业科学 2005(03)11.BOONHAM N;TOMLINSON J;MuMFORD R Mi-croarrays for rapid identification of plant viruses 200712.朱常香;王玉军;郭兴启 烟草蚀纹病毒外壳蛋白基因的克隆、原核表达及抗血清的制备期刊论文-植物保护学报 2005(04) 13.付振艳;张振臣 甘薯病毒G(SPVG)外壳