基因克隆步骤完整版

1、1 总 RNA 提取(1)液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将 1ml Trizol 加到离心管中待用(2)将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置5 min；打开离心机预冷(3) 加 200 L 氯仿，振荡 15 sec，室温放置 3 min，分层；(4) 4oC，12,000g，离心 15 min；(5) 取上清，加 500 L异丙醇，混匀，室温放置 10 min；(6) 4oC，12,000g，离心 10 min；(7) 弃上清，加 1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用 100%乙醇清洗(8) 4oC，7,500g，离心 5 min；(9) 弃上清，离心，用枪吸取多余液体， 放在

2、超净台里干燥后， 加 50 LDEPC水， 80oC 保存。此操作中所用到的器皿均需经过DEPC 灭活 RNA 酶处理。提取的总RNA需经 RNA 电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。 OD260 值为核酸的吸收值， OD280 值为蛋白的吸收值， OD260/280 值在 1.8-2.0 间一般说明该核酸蛋白含量在允许的范围内，可正常使用；此外还有 OD230 值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸 OD260/230 值能达到 2.2 左右。 RNA 浓度计算公式：总 RNA 浓度（ g/mL ） =A260稀释倍数 40。供参考2 反转录 /cDNA 第一链的合成纯化 RNA 以去

3、除基因组 DNA ，操作按 TaKaRa公司的 PrimeScript RT reagentwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。其体系为：Total RNA1g5gDNA Eraser Buffer2LgDNA Eraser1LRNase Free dHO补齐至 10L2条件为： 42oC，2min；RNA 纯化后，即可进行反转录。其体系为：5PrimeScript Buffer 2（ for Real Time）4LPrimeScript RT enzyme mix 1LRT Primer Mix1L上一步的反应液10LRNase Free dH

4、2O补齐至 L20操作条件为：(1) 37oC 放置 15 min； (2) 85oC，5 sec； (3) 4oC 保存。3 PCR按 TaKaRa公司的 Premix Taq Version 2.0 操作， PCR 反应体系如下：Premix Taq25 L模板5L引物 1 (10M)1 L引物 2 (10M)1 LddH2O18LPCR 反应条件为： 94C 预变性 5min；94C 变性 30s，53C 退火 30s，72C延伸 30s，循环 36 次； 72C 延伸 10min。PCR 反应完毕，取 5L反应产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳 （若割胶回收则用10L反应产物）。供参考4 基

5、因克隆及测序4.1PCR 产物切胶回收将 PCR 产物用 1%琼脂糖凝胶进行电泳， 在紫外灯下观察并切下预期大小的 DNA 片段。使用 TIANGEN 公司的 Universal DNA Purification Kit 割胶回收试剂盒进行纯化，步骤如下：(1)平衡吸附柱：向吸附柱CB2 中（吸附柱放入收集管中）加入500L平衡液 BL ，13,400 g 离心 1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱 CB2 重新套回收集管中；(2) 按 100 mg agarose胶加入 100L溶液 PC，置于 50oC 中 10 min 左右，中途混匀几次，至胶完全融化；(3) 将样品倒入一个吸附柱 C

6、B2 中（吸附柱放入收集管中） ，室温下 13,400 g 离心 1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2 重新套回收集管中；(4)向吸附柱 CB2 中加入 600L漂洗液 PW（加乙醇），室温下 13,400g 离心 1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱 CB2 重新套回收集管中；(5) 重复上一步骤；(6) 将吸附柱 CB2 放入收集管中，室温下 13,400 g 离心 2 min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干；(7) 将柱子套入一新的灭菌 1.5 mL 离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50L 洗脱缓冲液，室温放置2 分钟， 13,400g 室温离心 2 m

7、in，收集到的洗脱液即为回收的 DNA 纯化液；(8) 取 5L 的纯化液体进行 1%琼脂糖凝胶电泳，以检查纯度，并测量溶液中 DNA 含量。4.2 目的片段与载体连接(1) 胶回收产物与 T 载体连接体系，参考 Takara公司 pMD18-T 载体的试剂盒说明书。在灭菌的 0.5 mL 离心管中配制如下溶液（ 10 L）：回收 DNA4LLigation Solution5LpMD18-T Vector1L供参考(2) 16oC 反应 30 分钟，所得产物保存于 4oC 冰箱备用。4.3 连接产物转化 E.coli DH5(1) 将 5 L 连接产物加入到 100LE.coli DH5 感

8、受态细胞中，轻轻旋转离心管混匀内容物，冰上静置30 min；o3 min；(2) 42 C 水浴热激转化 90 sec，立即放回冰上，放置(3) 每管加入 500 L LB 培养基（室温放置），37oC 160-180 rpm 振荡培养45-60 min，使菌体复苏并表达抗性基因；(4) 在含有 Amp （100 g/mL ）的选择性平板上加入 60-100 L 菌液，用无菌涂布棒轻轻涂布均匀后，用 Parafilm 膜封好；(5) 将培养皿正放， 37oC 约 50 min，待液体全部吸收后，倒置平板继续培养10-16 h。4.4 转化子的筛选及鉴定(1) 用无菌枪头挑取 LB 平板上 3-5 个单菌落，分别接种到 3.5 mL LB 液体培养基中（含 100 g/mL Amp），37oC，165rpm