【优化方案】2013高中生物 第四章第3节聚合酶链式反应技术课件 北师大版选修1

1、第3节聚合酶链式反应技术,学习导航 1.尝试DNA片段的扩增和琼脂糖凝胶电泳检测技术。 2说出PCR体外基因扩增的基本原理。,一、DNA片段的扩增和琼脂糖凝胶电泳检测 1实验原理 (1)变性：温度上升到9498 ，双链DNA解旋为单链 (2)复性：温度下降到4060 ，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 ,(3)延伸：温度上升到72 时，在 _酶作用下，四种脱氧核苷酸通过碱基互补配对合成新DNA链 2方法步骤 (1)DNA片段的PCR扩增 把混合PCR反应体系的各种药品加入到冰 浴的_中，混合均匀后_。每管加入30 L无菌石蜡油。,Taq DNA聚合,EP管,低速离心,将EP管放入_

2、中，输入并运行反应程序。 (2)DNA扩增产物的检测 制作电泳胶板：配制质量分数为1%的琼脂糖凝胶，制作电泳胶板 加样：在扩增的_中加入_体积的_，混匀后，取20 L加入样品孔内,PCR热循环仪,DNA样品,0.2倍,载样缓冲液, 电泳：80 V稳压电泳2040 min 观察：当溴酚蓝指示剂电泳到_ 时切断电源，戴好塑料手套，将胶板浸入 _溶液中染色510 min，在紫外透射仪上观察电泳条带,凝胶底部,溴化乙锭,(1)PCR技术是体外酶促合成特定DNA片段的一种方法() (2)DNA片段扩增所需的引物是DNA，所需的原料是四 种核糖核苷酸() (3)DNA片段扩增需要加入解旋酶，RNA聚合酶(

3、),判一判,二、相关基础知识 1延伸时间和复性温度的选择 在PCR实验中，需要扩增的_ 决定延伸的时间，片段越大，中温延伸的时间就要相应_；引物的_和_则决定着_的选择，如果引物越短，_含量越多，PCR反应的复性温度越低，反之引物长度_，_含量较高的引物则需设计较高的复性温度。,DNA片段的大小,延长,碱基数量,组成,复性温度,A、T,较长,G、C,2PCR技术的衍生技术 PCR技术已经衍生出多种DNA检测手段，如随机扩增多态DNA技术(RAPD)、单核苷酸多态性(SNP)技术和_ (AFLP)技术等。,扩增片段长度多态性,PCR反应过程中复性温度过高对PCR扩增有何影响？ 【提示】复性温度过

4、高导致引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降，甚至引物与DNA模板不能结合，造成PCR扩增反应不能进 行，结果是电泳检测不到扩增产物的条带。,想一想,1PCR原理：DNA热变性的原理,2PCR的反应过程 (1)变性：当温度上升到9498 时，双链DNA解聚为单链，如图：,(2)复性：系统温度下降到4060 时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如图：,(3)延伸：当系统温度上升到72 左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、G、C、T)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如图：,特别提醒(1)PCR一般要控制在2535个循环，每次循环都包括变性、复性、延伸

5、三步。 (2)两引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。,近十年来，PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室里的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图)，在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。,(1)加热使DNA双链打开，这一步是打开_键，称为_。 (2)当温度降低时，引物与模板_端结合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最终合成两个DNA分子，此过程中原料是_，遵循的原则是_。,(3)PCR技术的必要条件，除了模板、原料、酶以外，至少还需要三个条件，即：液体环境、适宜的温度和酸碱

6、度，适宜的温度由_自动调控，酸碱度则靠_来维持。,(4)DNA的复制需要引物，其主要原因是 () A可加快DNA的复制速度 B引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合 C引物的5端有助于DNA聚合酶延伸DNA链 DDNA聚合酶只能从3端延伸DNA链,【思路点拨】,【解析】(1)PCR技术利用热变性原理使DNA双链间的氢键断裂，称为变性。(2)PCR技术扩增DNA与细胞内DNA复制所需原料一 样，为腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸，遵循的原则是碱基互补配对原则。引物与模板的3端结合后，DNA聚合酶才发挥作用。,(3)PCR技术除了需要模板、原

7、料、酶以外，至少还需要液体环境、适宜的温度和酸碱度，适宜的温度靠PCR仪自动调控，而酸碱度靠缓冲液来维 持。(4)引物的作用是结合在模板DNA上，提供DNA延伸的起始位点，而DNA聚合酶的作用是从引物的3端开始催化DNA链的延伸，故选D。,【答案】(1)氢变性(2)3四种脱氧核苷酸碱基互补配对原则(3)PCR仪缓冲液(4)D 【名师点睛】(1)加热变性是由于加热使碱基之间的氢键断开，而不是脱氧核糖与磷酸之间的键断开。 (2)引物的作用是结合在模板DNA上，为DNA延伸提供起始位点。,下列有关PCR的描述，不正确的是() A是一种酶促反应 B反应需要引物 C扩增产量为y(1x)n D扩增对象是氨

8、基酸序列,变式训练,特别提醒PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解旋与结合，不需要添加解旋酶和ATP。,PCR过程与细胞内的DNA复制过程相 比，主要有两点不同，它们是() PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA PCR过程不需要DNA聚合酶 PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的 PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制,AB C D 【解析】PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较，主要有两点不同：(1)PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA，长度通常为2030个核苷酸。(2)PCR过程中，DNA解旋不依赖解

9、旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。,【答案】C 【名师点睛】细胞内DNA复制与PCR技术的原理和过程容易发生混淆，特别应注意区分PCR反应需要可变的温度，而体内DNA复制需要稳定的温度。,符合PCR技术反应条件的一项是() 稳定的缓冲溶液环境DNA模板合成引物 四种脱氧核糖核苷酸DNA聚合酶解旋酶 温控设备,变式训练,A B C D 解析：选D。在PCR反应中，解旋是通过热变性实现的，用不到DNA解旋酶，其他各项都是反应必需的。,对PCR技术中DNA 片断的扩增方法和有关计算混淆不清 在遗传病及刑侦破案中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术能快速扩增DNA片 段，在几个小时内复制出上百

10、万份的DNA拷 贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。据图回答相关问题：,(1)在相应的横线上写出引物，并在复性这一步骤中将引物置于合适的位置。 (2)在相应的横线上写出循环一次后生成的DNA分子。 (3)若将作为原料的四种三磷酸脱氧核苷酸用32P标记，请分析循环一次后生成的DNA分子的特点是_；循环n次后生成的DNA分子中不含放射性的单链占总单链的比例为_。,【解析】(1)DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3端延伸DNA链，引物就提供了3端。子链延伸方向为53，引物与b链部分碱基互补，引物则与a链部分碱基互补，且连接到a链的3端，故引物的结构为5GA

11、OH，复性结果为： HOAG5 5GGTC3。,(2)经过一次循环后，产生的两个DNA分子分别含有引物和引物。(3)由于作为原料的四种三磷酸脱氧核糖核苷酸被32P标记，所以新合成的子链均含有放射性，一次循环后的两个DNA各有一条链含32P，若复制n次，产生子链共2n2，其中只有亲本的两条母链不含32P，则其所占比例为2/(2n2)1/2n。,【答案】(1)5GAOH a链 5GGTC3 HOAG5 (2)5GGTC33CCAG5 3CCAG55GGTC3 (3)每个DNA分子各有一条链含32P标记1/2n,【纠错总结】(1)DNA母链的3端对应着子链的5端，即DNA的两条链是反向平行的。 (2)DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3端上，需要模板，而DNA连接酶连接