分子生物学-07-1-第三章生物信息的传递-2真核启动子-转录过程1

1、教学单元教案格式7 第3章 转录（之真核启动子和转录的过程） 课程教案授课题目：第3章 转录 之真核启动子和转录的过程 第四周第一次教学时数：2授课类型： 理论课 实践课教学目的、要求：理解：真核生物启动子结构了解：转录的过程 教学重点：重点阐明：真核生物启动子结构重点指出：转录起始的过程、终止的过程和本质，以及与启动子的性质上的本质区别教学难点：绝对难点：转录过程中酶的形态构象的变化如“笔直”-“弯曲”相对难点：无教学方法和手段：老师讲授为主：讲授 视频演示 PPT演示 讨论。以电脑幻灯片边演示边讲述为主，（白板课件）辅以板书（黑板板书）学生回答问题为辅：（如时间等条件许可的情况下）注：以下

2、内容按实际需要进行取舍 要求有多媒体，因为信息量大，许多结构图需要媒体放映，效果才好教学内容与教学设计：1 补充完成上节课讲的原核生物启动子RNA转录合成时，只能以DNA分子中的某一段作为模板，故存在特定的起始位点和特定的终止位点，特定起始点和特定终止点之间的DNA链构成一个转录单位，通常由转录区和有关的调节顺序构成复习原核生物启动子结构中-10序列的功能是保证转录精确的起始，而-35序列的功能是控制转录起始的频率介绍CAP位点这是一个调控位点，即环腺苷酸受体蛋白位点。但这个位点并不是所有的启动子都有的。以大肠杆菌乳糖启动子为例，CAP位点有两个，一个位于70到50，另一个位于50到40。至于

3、这两个CAP位点是起什么作用的，以后我们在基因表达调控中再详细地讲述。 2真核生物启动子真核有三种不同的启动子和有关的元件分别的对应三种不同的RNA聚合酶，不同的酶分别识别不同的启动子，因为它们具有不同的结构2.1真核生物RNA聚合酶II的启动子启动子最为复杂，它和原核的启动子有很多不同注意：在某些果蝇基因中发现，当不含有TATA 框时，在转录起始点下游含有的保守序列，起到类似于TATA框的作用。人称下游启动子元件核心启动子（core promoter）： -30区 和 -75区 1和-20之间的序列往往为负调控因子结合的序列-30和-70之间的序列往往为正调控因子结合的序列上游启动子元件（u

4、pstream promoter element，UPE）：一般指TATA BOX上游的序列，在-35和-70之间以及更为上游的部分保守序列，（1）、核心启动子定义：指保证RNA聚合酶转录正常起始所必需的、最少的DNA序列，包括转录起始位点及转录起始位点上游TATA区TATA 常在-30bp左右，相当于原核的-10序列: T85A97T93A85A63A83A50作用：选择正确的转录起始位点，保证精确起始（2）、上游启动子元件包括CAAT盒（CCAAT）和GC盒（GGGCGG）等CAAT：-70 - -80bpGGGCGG：-80 - -110bp作用：控制转录起始频率。2.2 真核生物RNA

5、聚合酶I 的启动子RNA聚合酶I负责转录5.8S 18S 28S三种rRNA，这三者共同转录在一个转录物上共用一个启动子2.3 RNA聚合酶III的启动子III转录tRNA、5S RNA、部分snRNA，但是却有不同的启动子。其中snRNA使用与其他启动子结构相同的上游启动子，但是tRNA、5S RNA却使用一种“内部启动子”，也就是说启动子位于基因内部。 可以分为两类：2.4总结真核生物RNA聚合酶启动子结构的复杂性三种不同的RNA聚合酶有不同的启动子，其中启动子最为复杂，它和原核的启动子有很多不同：（1）有多种元件：TATA框，GC框，CATT框，OCT等；（2）结构不恒定。有的有多种框盒

6、如组蛋白H2B；有的只有TATA框和GC框，如SV40早期转录蛋白，（3）它们的位置、序列、距离和方向都不完全相同，（4）有的有远距离的调控元件存在，如增强子；（5）这些元件常常起到控制转录效率和选择起始位点的作用；（6）不直接和RNA pol结合。转录时先和其它转录激活因子相结合，再和聚合酶结合。 2.5真核生物的其他的调控元件增强子enhancer增强子的定义：增强子是真核生物中通过启动子来增强转录的一种远端遗传性顺式作用元件，有效的增强子可以位于5、3、甚至基因内部的内含子中，一般长度为100200bp，其基本核心元件常由812bp组成，常形成回文序列，并以单拷贝或者多拷贝的串联形式存在

7、。增强子的特性：通过启动子增强同一DNA链上靶基因的转录速率；l 通过启动子增强同一DNA链上靶基因的转录速率；l 对同源或者异源基因同样有效,也就是没有物种或者基因的特异性l 位置多样l 没有5 、 3 的固定的方向性l 可以在远距离作用（10004000bp）l 具有细胞特异性或者组织特异性l 增强子的活性与其在DNA双螺旋结构中的空间方向性有关，所谓相位性l 顺式调节性增强子的类型l 组织细胞专一性增强子l 诱导性增强子减弱子（dehancer）在某些基因的上游远端或下游远端具有负调节序列，其作用不受距离和方向的影响，叫做减弱子。如C-mos基因上游0.8或1.8Kb处有一序列，使C-m

8、os不易被反转录病毒的长末端重复序列（LTR）所激活。在C-myc基因的3端也存在着减弱子静息子（sisencer）在酵母交配型转换的盒式模型中，左右两个沉默框（HML和HMR）都不表达，此是由于在这两个框盒上游1.5Kb处都有一个E片段，它可和阻遏沉默框盒表达的蛋白SIR（1-4）（silent mating tyne information regulation）结合，起抑制转录作用，故称静息子，可作用2.5Kb远的启动子。上游激活序列（upstream activating seguences UASs）UASs是酵母中远上游序列类似于增强子。它仅影响转录程度，对位点选择不起作用。和增强

9、子不同的是它有方向性，不能在启动子的下游起作用。它结合的转录因子是GCN4和GAL4，识别位点为ATGACTCAT。3转录的过程（1）模板识别，形成转录起始复合物 原核生物转录起始复合物当亚基与核心酶组成全酶之后，全酶就通过一种尝试错误的方式去寻找启动子，它是依靠亚基寻找并识别35序列，然后全酶与35序列结合，这样就形成一个所谓的封闭的启动子复合物。识别的机制是什么呢？P78酶分子中的氢键供体与受体能够与启动子区DNA分子大沟中暴露出来的某些氢键受体和供体进行互补。所谓氢键互补学说。由于RNA聚合酶是一个分子很大的酶，与35序列结合并不是很牢固，而是在其附近进行滑动，滑动的结果是RNA聚合酶亚

10、基与富含AT的10序列相结合，并且使得RNA聚合酶牢固的结合在该部位，然后10序列以及起始点处的DNA发生局部解链，长度在12bp17bp，这时候就形成所谓的开放式启动子复合物结构。在RNA聚合酶上有两个核苷酸位点，一个是起始核苷酸位点，一个是延长核苷酸位点。在开放式的启动子复合物中，RNA聚合酶的起始位点和延长位点被相应最初的两个核苷酸前体充满，怎么充满的并不知道，然后在这两个核苷酸之间形成一个磷酸二酯键，这样的话呢，就形成了一个三元复合体，即由RNA聚合酶、DNA模板、新形成的RNA短链共同组成一个所谓的三元复合物。真核生物的转录起始较为复杂目前已知RNA聚合酶有多种不同的蛋白因子参与转录

11、复合体的形成。这些蛋白因子被称为转录因子（trans-criptional factor, TF)。包括 TFA，TFB，TFD，TFE，TFF，TF-I等。 （2） 流产起始三元复合物一旦形成，亚基并不是马上就脱离下来（在以往的教材中认为亚基是马上就脱离下来的，实际上并不是这样），而是在接下来的步骤中发生了一个奇怪的现象，那就是，这时候的RNA聚合酶已经结合到转录起始点上，但是并不往下移动，而是在这个三元复合物中合成了一段长度为29个核苷酸的RNA短链。然后这个短链从三元复合体中释放出来，RNA聚合酶再重新开始合成RNA。这才算是转录的成功开始，这个时候sigam因子就被释放出来，于是转录继

12、续，并且随着RNA聚合酶的移动，形成的RNA不断延伸。那么上面这个合成29碱基的过程英文当中称为abortive initiation。这个过程可能起到了一种保证转录能够从正确的位点开始的作用。（3）延伸因子从全酶上脱离，余下的核心酶继续沿DNA链移动，按照碱基互补原则，不断聚合RNA。 s亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长，延长的RNA链不断的被释放出来。这是关键。转录循环理论解释延伸过程（4）转录的终止问题同样是一个棘手的问题，因为细胞中存在有强烈的RNA酶活性，初级转录物刚刚转录出来后，就有可能被R

13、NA酶降解掉了，因此，我们很难在初级转录物上找到一个特定的碱基以表示它转录到此为止。在原核生物中初级转录物的3末端不断的遭到降解，在真核生物中，同样是初级转录物的3末端经过降解，然后才加上polyA尾巴。尽管这样，人们还是通过比较多种原核生物RNA中止位点附近的序列，发现了一些提供转录终止的信号，也就是说，转录的终止作用需要有终止子提供终止信号。这种终止信号称为终止子。终止的本质终止子，DNA序列上提供转录终止信号的一段序列称为终止子，但是真正起终止作用的不是DNA序列本身而是由此转录出来的RNA，在这一点上启动子和终止子是不同的。 终止子（terminator，t） 强终止子内部终止子，不依

14、赖于因子的终止子。（又称为自动终止） 弱终止子 需要因子，又称为依赖性终止子（Rho-dependent terminator） 共同特征：就是在转录终止点之前有一段回文DNA序列，两段回文序列的两个重复部分由几个碱基对的不重复序列所隔开。 不同点： 不依赖于因子的终止子 回文序列中富含G.C碱基对多，回文序列的下游常有一个多聚AT对， 对应在RNA序列上形成一连串的U；RNA形成发夹结构，RNA聚合酶被这个发夹结构阻止，发夹式结构和寡聚U的共同作用使RNA从三元复合物中解离出来。 依赖于因子的终止子 回文序列中GC含量较少，下游序列中不含有多聚AT对。 对应在RNA序列上不能形成一连串的U。

15、或者说它没有那么固定的特征，所以要依赖于因子。真核生物的终止子 真核生物中终止子结构了解较少，而且不同的RNA聚合酶含有不同的终止子，比如I的终止子为18bp的能够被辅助因子识别的序列，III的终止子类似于原核生物，也具有发夹结构和U串。而II的终止子结构目前不清楚。终止的分子机制l 不依赖于因子的终止子的作用 当RNA聚合酶转录完终止子的回文序列后不久，转录出来的RNA初级转录物中相当于回文序列的区域就形成一个茎环结构，这是回文序列的特点，这个茎环结构可能与RNA聚合酶的某种特定的空间结构相嵌合，阻碍了RNA链从RNA聚合酶及模板DNA等形成的多元复合物中释放出来，造成转录的停顿或延宕（回文

16、序列中GC含量越高，延宕时间越长）。（实际上人们发现RNA聚合酶每通过一个GC对都会有一定的延宕）。 这样RNA聚合酶就不能继续向前移动，同时在回文序列之后转录出来的一连串的UUUUUU，与模板上的AAAAAA之间的配对是比较弱的，氢键和碱基堆积力很弱，这样RNA就与DNA杂交的部分很容易拆开，正是由于这两者的作用，RNA聚合酶从RNA上解离下来，实现了转录的终止。请看下图l 依赖于因子的终止子的终止作用 依赖于因子的终止子的回文序列中GC含量较低，而且在回文序列后缺少连续的AAAAAA，这样虽然转录出来的RNA在回文序列的位置形成的茎环结构很弱，这样就不能造成转录的长时间延宕，后面呢，又没有

17、那种A/U的弱配对，RNA也不容易解离下来，所以就造成了RNA酶的通读，那么转录就停不下来。 然而实际上并不是这样，实际上这种转录，从一开始就有一个因子在起作用，这个因子可以结合在正在合成中的RNA的5末端并且依靠某种能量（这种能量是它本身降解NTP获得的）沿着RNA向3末端移动，在RNA上它本身就比RNA聚合酶跑的快，因此它能够趁着RNA转录延宕的机会赶上RNA聚合酶，然后因子与RNA聚合酶相互作用（RNA-DNA解螺旋作用）而造成转录的终止。 至于他们是如何作用的，机制还不是很清楚，体外实验表明因子可以直接作用于DNA-RNA杂种链，并且使得DNA与RNA分离，一旦分离之后，因子、RNA和

18、RNA聚合酶就从模板上解离下来，这样转录就宣告终止。 抗终止主要有两种方式：一 破坏终止位点RNA的茎环结构：由于在大肠杆菌中转录与翻译是偶联的，转录产物mRNA形成后立即通过核糖体知道蛋白质合成，当介质中该aa浓度较高时，与此相对应的氨酰-tRNA含量也高，因此核糖体可顺利通过串联密码子。在这种情况下，mRNA形成正常二级结构，其中包括末端的茎环结构，RNA聚合酶终止转录。当介质中该aa浓度较低时，缺乏相应的氨酰-tRNA，致使核糖体滞留在串联密码子上，mRNA不能形成二级结构，茎环结构被破坏，因此转录仍能进行下去，出现转录抗终止现象二 依赖于蛋白质因子的转录抗终止lengda噬菌体中由N基

19、因编码产生的N蛋白具有抗转录终止作用，但其功能依赖于宿主所产生的NusA,NusB,S10和25000等几种蛋白质，这些蛋白质结合到终止子附近的DNA位点是实现抗转录的必要条件。该DNA位点中含有A区（CGCTCTTA）和一个二重对称序列，N蛋白能识别后者转录所形成的茎环结构并与之结合。NusA以二聚体的形式存在，其一个亚基与RNA聚合酶结合，另一个亚基与N蛋白结合，当其他3种蛋白都结合到Nut位点时，便形成一个蛋白复合物，并通过NusA与RNA聚合酶结合，改变聚合酶的构象，使之对终止信号不敏感，继续催化RNA链的合成。作业布置：填空：在转录起始阶段,通常可以分为四个阶段，分别是 A 核心酶在因子的参与下与模板的DNA接触，生成非专一的，不稳定的复合物在模板上移动，可能的机制是氢键互补学说 B 起始识别：全酶与模板的启动子结合，产生封闭的“酶-启动子二元复合物”（closed binary complex） C 酶紧密