第二十三章 重组和转座

1、第二十三章 重组和转座基本原理重组和转座的结果相同都引起了DNA的重排。转座是重组中的一种特殊类型，它是由转座因子产生的特殊的行为。同源重组是重组中的普遍形式，Holliday模型，Meselson-Radding模型较好地解释了同源重组的机制及基因转换和极化的现象。Szostak的双链断裂起始重组模型较适合于直核生物减数分裂中的重组。在原核同源重组中存在8个碱基组成的Chi位点，RecA.B.C.D.参与重组。RecBCD复合体具有核酸酶，解旋酶和ATDase活性。在原核同源重组中RuvA和RuvB可促进异源双链的形成。RuvC是一种内切酶可释放重组中间体。噬菌体的整合是通过att P位点（

2、23bp）中和宿主att B位点（240bp）之间15bp同源区（核心区）交错切割，配对和连接而无须经修复复制的过程。沙门细菌的相转变，Mu噬菌体G片断的倒位及P1噬菌体C片断的倒位都需要短的反向重复序列，分别由Hin，Gin和Cin催化IRR和IRL之间的同源重组，产生倒位，Hin，Gin和Cin是同源的。并和Tn3的TnpR蛋白同源。重组机制与Tn3共合体解离相似。转座因子的类型如下：（表23-1）转座因子的共同特点是两端有反向重复序列；转座后靶位点重复正向重复；都编码与转座有关的蛋白；可以在基因组中移动 转座子的转座机制分为三种类型：复制型；非复制型；保守型。其共同特点是要涉及靶位点的交

3、错切割和修复性复制，主要是由Shanprio模型等加以解释。反转座录转座子是由RNA介导的模板转换来实现的。 重组是已经存在的遗传物质产生新的组合的过程。分子间或染色体间重组通过真核染色体减数分裂时独立分配和自由组合，而分子内或染色体内重组是酶促反的过程，通过DNA的剪切和连接产生新的新的重排。重组的概念也有广义和狭义之分，广义的重组包括由于独立分配和染色体交换等在后代中出现重组合的过程。而狭义的重组仅仅是指DNA的交换或重排而产生的重组。 重组和突变是产生遗传变异的主要两大因素，但二者的分子机制截然不同：重组是已经存在的遗传信息发生重排，而突变是改变基因组中的碱基。但二者在分子机制上又是相互

4、影响的。有的重组如转座会导致DNA的倒位、确失和基因的失活，被描述成突变。相反，在修复DNA损伤（可导致突变或致死）时也常需要重组的过程。根据以下三点：同源序列的长短；重组蛋白；分子机制。分子内重组可分为六种类型：（1）同源重组 (homologous recombination )或普遍性重组（generalized recombination ）：此涉及到大片段同源DNA序列之间的交换。在真核生物减数分裂过程中发生的这种重组是一种交互重组的类型；在细菌的转化，接合和广泛性转导中所产生的重组是一种单向重组，即仅受体发生重组，供体并未发生改变。催化这一过程的蛋白(如大肠杆菌中的RecA)不是序

5、列专一性的，而是同源依赖的。（2）位点特异性重组（site-specific recombination）：这种重组的特点是重组发生在特异位点，此位点含有短的同源序列,供位点特异性重组酶识别；重组过程涉及到蛋白的催化的交错切割。最为典型的是噬菌体在att位点整合到E.coli的基因组中。沙门氏菌鞭毛的相变位中H2基因和rh1基因上游一段995bp序列的倒位以及Mu噬菌体中G片断的倒位同样也涉及短的重复序列，Hin蛋白和Gin蛋白的催化以及交错切割，所以也属此类。（3）转座重组（transposition recombination）：转座的机制依赖DNA的交错剪切和复制，但不依赖于同源序列。转

6、座涉及转座酶，解离酶识别重组分子中的短特异序列，共分为复制型、非复制及保守型三种类型。转座的过程中会形成共合体。两个转座因子之间的重组会引起缺失和倒位。（4）模板选择（copy chioce）性重组，此是适用于RNA病毒，在这种重组中，聚合酶以一个模板转换到另一个模板来合成RNA，结果新合成的分子将含有两个不同亲本的遗传信息。内含子归巢也属于此种类型。 （5）特殊重组(special recombination)。在哺乳动物的体细胞中，免疫球蛋白成熟的V.J.C（或V.D.JC）区要进行DNA重组，这种重组涉及短的同源序列，以及特殊的剪切、修补、连接和插入碱基。重组由重组激活基编码的RAG 1

7、,2蛋白催化。 （6）同源特异重组(homologous-special recombination)：酵母交配型的转变和以上有的类型都有相似之处，但又有明显的不同。如交配型转变同样涉同源大片断DNA的同源配对，但重组位点仅特异地在Z/Y交界区，而且伴随着复制过程；切割时仅受体位点双链被切，这些特点很像复制型转座，但与转座重组的根本区别在于： 位点特异； 在结构上无反向重复，也不形成靶位点的正向重复； 不涉及转座酶和解离酶，因此应将其另列为一个类型，称为同源特异重组。 第一节 重组机制 重组是如此重要，那么重组理论毫无疑问也是十分重要的。1931年著名的Stern .C.的果蝇实验和Creig

8、hton H.B.，McClintock B.的玉米实验用细胞学方法直接正式了交换，似乎也表明重组就是染色体的断裂和重接，但问题并不是那么简单，科学家们先后建立很多重组模型，从1909年Janssens提出的交叉理论起已风风雨雨近九十多年，至今这个问题还没有完全解决。证据也还不十分充足。现在我们来看看前人怎样地向前探索。一交叉理论最早的重组理论是在1909年（此时Morgan的连锁定律尚未问世）比利时的细胞学家Janssens在研究蝾螈和直翅目昆虫的减数分裂时，观察到二价体的交叉，并提出了交叉型学说（chiasmatatype hypothesis）。认为每次交叉都表明父、母本一条染色单体接触

9、、断裂和重接，形成一个新的组合，其他两条染色单体仍保持完整状态。因此每个交叉是重组行为可见的表现形式。交叉理论虽然能得到遗传学家的支持，但却遭到细胞学家的反对，因为找不出理论中有关断裂和重接的任何证据。从显微照片上来看确实很难想象存在断裂和融合的现象。直到1928年Belling提出交换发生在减数裂较早时期，此时同源染色体紧密相连，因此在双线期观察到的交叉并不表明交换的过程，而是交换的直接结果，这一解释结束了近十年的争论。但有一个问题仍使人们感到困惑，那就是交叉点的是在变化的，在接近中期I时明显减少了，而交换一旦发生数目应是固定的，因此仍然怀疑交叉型学说。1931英国的植物细胞学家Darlng

10、ton发现交叉数目减少是交叉端化的结果，此时才排除了异议（图23-1）。图23-1 在减数分裂中出现的交叉。在联会的一对染色单体上存在着交叉点(转引自Griffiths, A.J.F.et al.1999) 1978年Tease.C和Jones，G.H.采用姊妹染色体单体差别染色（sisterchromatid differential staining ，SCD）来直接检测交叉和重组的关系。SCD法可将姊妹染色体单体一条染上颜色呈现深紫色，显示为“暗”的。另一染不上吉姆萨，显示为“明”的。他们用SCD法来处理减数分裂的染色体，结果发现明-暗转换发生在交叉处（图23-2）。这就澄清了前面留下来

11、的问题。实验表明交叉正是发生交换的位点。但这仍然是适合真核生物的重组。 二、断裂和重接模型1937年Darlington在仔细地观察研究了减数分裂，提出了重组的断裂和重接的模型，他认为在减数分裂中一对同源染色体相互分离就像将绳子的两股分开一样，会产生扭曲，为了消除张力，只有当两姊妹染色单体在对应点发生断裂才能使张力达到平衡，然后非姊妹染色体单体的“断头”相互重接，产生了重组。根据这个模型重组应发生在四线期，且是一个相互的过程，所以重组的产物也应当是对称的。但1930年德国的遗传学家Winkler已发现了基因转变（gene conversion）的现象，即链孢霉重组的产物并不都是接4:4分离，也

12、会出现5:3和6:2的分离比，断裂重接模型对此无法解释。约在1955年人们已认识到基因是DNA分子的一部分，当遗传学家发现基因的转变说明基因内重组时更加怀疑断裂重接模型的正确性。特别是考虑到此模型要求两条非姊妹染色单体必须要在相同位点的核苷酸之间发生断裂，否则会产生非法交换，这对张力引起的染色单体断裂来说能达到如此之精确也是难以置信的。于是人们便热衷于寻求一种新的模型，要求它能很好地解释基因的转换，于是模板选择学说（copy choice ）受到了推崇。当时虽然还不清楚在噬菌体中DNA半保留复制的过程是怎样进行的，但在20世纪50年代大部分了遗传学家都倾向于模板选择说。图23-3 断裂重接模型

13、和选择复制模型的比较三、模板选择学说模板选择学说的兴衰是遗传学史中有趣的一章。这一学说一开始是由Belling J.首先提出的，1933年他又撤回了这一假设。1948年Hershey发现在噬菌体的杂交中产生的重组子有时是非对称的，为了解释这个现象，他接受了Sturtevant .A.H的建议，提出了在噬菌体中重组可能不是遗传结构的断裂和重接，而是复制时改变了模板所致。即两条染色单体作为复制的模板，新的染色体各以一个单体模板进行复制，在复制过程中相应交换模板，从而造成重组（图23-3）。模板选择模型能够很好地解释基因转变的现象，因此当时被人们所接受。这是由于那时半保留复制等有关机制尚不清楚，若根

14、据现在已知的理论就不难发现，此模板选择学说是不能成立的：模板选择假设提出一条姊妹染色体单体以另一条单体为模板进行复制这本身就违反了半保留复制的原则，此属于全保留复制；在真菌中可以观察到染色体单体的三线和四线交换，而模板选择模型仅限于二线交换，此也难以成立；染色体的配对、交换应在细胞周期的分裂期（M）,而复制是在S期，因此重组不可能是和复制同时发生。 第二节 Holliday 模型早在1930年Winkler把真菌中不规则分离现象解释为减数分裂过程中同源染色体联会时，一个基因使相对位置上的基因发生相应的变化所致，因而称基因转变（conversion）。Lindegren,C.C（1949）报道了

15、有规律的异离常分离现象：在酵母（S.cerevisiae）不同交配型Aa的杂交中，有些子囊所含的孢子为（3A+1a），而不是预期的（2A+2a）。他把这一现象也称为基因转变。直到50年代中期基因转变这一现象才得到进一步的认识。当时Mitchell M.B.等将不同的B6突变型链孢霉进行杂交，结果在子囊中拟等位基因pdx以正常的4:4分离，而与其紧密连锁的拟等位基因pdxp却出现了6:2的异常分离。表明异常分离不是由于整个染色体的异常行为，而是由于特定位点的“基因转变”所致，即属于基因内重组。Olive, E1-Ani和Kitani等在粪壳菌（Sodaria fimicola）中也发现了异常分离

16、。在野生型g+（子囊孢子为黑色）和g-（子囊孢子为灰色）杂交中，观察了20万个子囊，其中大部分为4:4的正常分离，少数为异常分离：0.06%为5：3分离；0.05%为6:2分离,0.008%为异常的4:4分离（图23-4）。如果染色体中每一条双链都是纯合的互补的活，减数分裂产生的四个子囊孢子再经一次有分裂产生的8个子囊孢子，不论是否发生重组基因型都应当两两排列，所出现的“+ + +- + - - -”以及“+ + + + + - - -”一定是有异源双链的存在。这种异常分离是有丝分裂的产物，故称为减数后分离（postmeiotic segregation）。这些资料另一显著特点是异常分离的子囊

17、中约有30%的子囊在g 位点的两侧标记之间发生了交换。其中52例中有48例既有A位点的重组，又有g位点的基因转变，表明基因的转变和重组有着密切的关系。基因的转变是基因内部不同位点之间的重组，不同位点可以单独发生转变，也可同时发生转变，同时发的基因转变称为共转变（coconversion）。基因的转变常涉及1kb的范围，更长的距离为基因间的重组。当两个突变位点距离越近，共转变的频率越高，距离较远时常发生单个突变位点的转变。同一基因内部的各个突变位点的转变频率常从基因的一端向另一端递减，具有这种现象的一段DNA称为极化子（polaron），一个极化子相当于一个基因（Rizet等1961）。解释基因

18、转变的模型都必须解释异源双链的形成以及基因转变往往伴随着两侧基因重组这一现象。1964年美国学者Holliday R.提出了著名的Holiday模型（图23-5），很好地解释了高等真核生物的重组和真菌中发现的基因转变的现象。近代Potter H.和Dressler D.在噬菌体中的拍摄到“十”字型结构的DNA电镜照片(图23-6)，为Holliday模型提供了一个有力的证据。Holiday模型解释了以下的几种现象： （1） 染色单体转变和半染色单体转变。在图23-6中，表明在真菌的杂交中有时会产生一些异常分离，如出现6:2或2:6的比例，看来直似乎在减数分裂中有一条整个的染色体发生转变，这一过

19、程就称为染色单位转变（chromatid conversion）；另外也有5:3或3:5的异常分离，看起来似乎是半色体发生了转变，故称为半染色体转变（half-chromatid conversion）。以上的异常比例可以解释为在交换的过程中产生了异源链和错配，由于不同的校正而产生了三种不同的异常比例（表23-2）。表23-2 交换过程中异源链的错配和不同的校正减数分裂开始阶段的DNA链产生异源双链时的DNA链不校正一条异源双链的m 校正为+二条异源双链的m 都校正为+mm3m3m2mmmmm6+m+5+mm+3+一对同源染色体4条染色单体异常445362（2）极化（polarity）。 我们

20、可以将基因中不同位点的转变频率进行比较就不难发现基因一端的位点其转变频率高于另一端，即转变的频率沿着基因呈现出一种极性。这是由于交换产生的错配只发生在异源双链DNA这部分，而这一部分只发生在Hollidy 结构的断裂和分枝点之间。在分枝点解离时，外侧区域仍然形成同源双链（图23-9）。第三节 重组和酶DNA分子之间的交换仅涉及DNA分子重组机制和限制区域的这一部分，而不是整个染色体。但分子事件的一般程序是相同的： 由断裂分子产生的单链与非姊妹染色单体的双链相互作用；配对区的延伸；外切酶解离配对的双链。现在已经知道以上每一步都需要酶的催化（表23-3）。表23-3:大肠杆菌中涉及产生重组DNA的

21、重组基因基因功能RecBCD系统具有核酸酶，解旋酶和ATPase活性。在Chi位点产生单链3游离未端RecB,RecC,RecDRecBCD是ATP依赖的外切酶和解旋酶(外切酶V)，它与双链断口结合，解开DNA并导入裂口，其倾向性位点称为chi(参见重组热点)。RecBCD酶产生RecA可以作用的底物RceA(1)具有蛋白酶活性; (2) 在单链DNA和ATP存在的条件下RecA能启动DNA单链和与之互补的双链分子进行碱基配对。RceG具有解旋酶活性，可解离Hollidy连接RuvAB系统具有解离Hollidy连接的活性RuvA 可识别Holliday连接的结构RuvB 是一种ATPase，它

22、可发动迁移反应RuvC具有内切酶活性，可特异识别Hollidy分枝，它在体外可切这个连接体，解离重组中间体在细菌中用于重组的酶已通过rec- 突变而被鉴别出来。rec- 突变体的表型特征是不能进行重组。现已鉴别出1020个基因座。5GCTGGTGG 33CGACCACC 5 已发现了一种产生合适末端的机制，它是重组热点存在的结果。这些位点是在噬菌体突变体中发现的，称为chi（十字型），它由于单个碱基对的改变产生了刺激重组的位点。这一位点是由8个碱基组成的非对称序列： 这个Chi序列在自然的E.coli DNA中大约每隔510kb就存在一个拷贝。但野生型DNA无此序列，而其他遗传因子中也无此序列

23、，表明它不是重组所必须的。Chi序列促进了其邻近区域相距10kb的范围发生重组。Chi位点能被双链断裂所激活，断裂在其右侧几kb的地方。这种方向的依赖性表明重组的装置就必须和DNA的断裂端相连接，然后才能沿着一个方向在双链上移动。Chi位点是recBCD编码的一种酶的靶序列。RecBCD复合体有几种活性：是一种强的核酸酶，可降解DNA，初始将它鉴定为核酸外切酶V；具有解旋酶活性，在SSB存在时它可以解开双链；具有ATPaae活性。在重组中的作用是提供带有游离端的单链区。当RecBCD结合在DNA Chi位点的右侧时，它沿着DNA移动，使DNA解旋，并降解带有3端的单链。当到达Chi位点时它停顿

24、下来，并切开上面的一条单链DNA，切点在Chi 3端离Chi 位点46bp处。Chi位点的识别导致RecD亚基的解离或失活，结果使复合物RecBC失去了核酸酶的活性，但继续发挥其解旋酶的作用(图23-7)。RecBCD介导的解旋和剪切可产生3游离末端，用来起始异源双链连接的的形成。当RceBCD在Chi位点剪切时RceA酶能使带有3末端的单链释放出来，并利用它和同源双链序列起反应，从而产生连接的分子。 图23-8 RecA 蛋白使单链DNA取代双链DNA中的同源部分（引自B.lewin,2000）RceA有两个完全不同类型的活性：在SOS反应中它具有蛋白酶活性；能启动DNA单链和与之互补的双链

25、分子进行碱基配对。RecA的后一种活性需要单链DNA和ATP；RecA的活性与体内重组之间的相关性尚不十分清楚，但和几种类型的重组机制的反应有关。RecA操作DNA的活性之一能使单链DNA取代双链分子中同源的链，此反应称为单链取代（single-strand uptake）或单链同化（single-strand assimilation）这种取代反应能发生在各种形状的DNA分子之间(图23-8)，但一般要具备三个条件：其中一个DNA分子必须要有一个单链区域；其中一个DNA分子必须要有一个游离的3末端；此单链区域和3末端必须和另一个DNA分子有互补区。在E.coli中ruvA、ruvB和ruvC

26、基因编码的蛋白也和重组有关。ruvA和ruvB的产物可促进异源双链结构的形成。RuvA可识别Holliday连接的结构；RuvB是一种ATPase，它可发动迁移反应。图23-9表示复合体的功能。RuvA结合在交换点上的所有4条链上。RuvB是六聚体，它围绕在交换点上游的每一条DNA双链的周围。此RuvAB复合体能导致分枝点以每秒1020bp的速度迁移。RecG解旋酶也具有相似的活性。RuvAB解旋酶在反应时能将RecA从DNA中置换出来。RuvAB和RecG都具有解离Hollidy连接的活性，使重组得以完成。若二者发生突变，那么E.coli则完全失去了重组的活性。ruvC编码一种内切酶可特异识

27、别Hollidy分枝结构，它在体外可切这个连接体，解离重组中间体。一个共同的四核苷酸序列为RuvC提供了解离Hollidy连接的热点，此序列是对称的，这样可以直接决定在哪一对链上产生缺刻，从而决定了补丁重组的形成（并非全部重组）或剪接重组（在两个测翼标记向重组）。 RecA的同源蛋白在原核生物中普遍存在，在真核中生物中也发现了相关的蛋白。在酵母中（S.cerevisiae）DMC1和rad51两个基因所编码的蛋白和RecA相关。这些基因的突变会导致产生相似表型；突变体聚积双链断裂，且不能形成SC。这些现象增强了一种观点：DNA双链之间的交换和SC的形成有关，而且提出了染色体联会可能和细菌的同化

28、反应相关，但在真核生物中RecA的同源蛋白并不形成“细丝”，因此在真核生物中的反应机制可能和原核不同。 第四节 位点特异重组和同源特异重组一在aat位点的整合位点特异性重组最典型的列子是噬菌体对E.coli的整合。在裂解周期， DNA是以环状分子独立存在于细菌的细胞质中；在溶原化状态时的DNA是整合在细菌的染色体中。称为原噬菌体。通过位点特异性重组这两种状态是可以相互转变的。进入溶原状态时游离的DNA必须整合（intergrated）到宿主的DNA中；从溶原周期进入裂解周期时原噬菌体DNA须从宿主的染色体中切离出来。噬菌体的整合和切离是在特异位点即附着位点(attatchment sites,

29、 att ) 通过重组完成的。在细菌染色体上的特异位点称att l，若这个座位发生突变就会失去功能而抑制l的整合。细菌的attl位点称为att B，其序列的成份是BOB，在噬菌体上的att位点，称为att P，含有POP。图23-10表示在这些位点上发生的重组。“O”序列是att B和att P共有的，被称为核心（core）序列，长15bp，重组就发生在此序列上。两侧序列B，B和P，P是作为臂（arms）；臂序列各不相同。由于DNA是环状的。重组时它插入到细菌染色体中呈线状。原噬菌体两端的att位点是由重组产生的BOP和POB构成的。在att位点的整合和切离并不涉及反应序列的同源部分。整合需识

30、别att P和att B；而切离时需要att L和att R。虽然这种重组事件是可逆的，但不同的条件决定了反应的方向。这在噬菌体生活周期中是一个重要的特点。噬菌体一旦整合进入溶原周期不会立即被切离，反之也然。整合和切离反应作用位点是不同的，因此这两个反应所依赖的蛋白也不完全相同。整合（att B att P）反应需要噬菌体int基因的产物和宿主的整合因子（integration host factor,IHF）。切离（att L att R）反应需要噬菌体Xis基因的产物以及Int和IHF蛋白的参与。两个反应都需要Int和IHF，而Xis在控制方向上起到重要的作用。它是切离所需要的，对整合起抑

31、制作用。IHF是由E.coli编码的20KDa蛋白，含两个不同的亚基，分别由基因himA 和himD编码。IHF不参与细菌的同源重组。him基因的突变就会阻断的位点特异性重组。也能被int突变所抑制，表明IHF和Int可相互作用。位点特异重组是能通过Int和IHF在体外来完成。它涉及精确的断裂和重接而不需要任何DNA合成。att P的功能需要一个240bp序列，而att B仅需23bp的片段（-11 +11）就具有功能。在核心区中有7bp是交错剪切的序列。att B和Att P的大小就表明它们在重组中所起的作用是不同的。AttP提供了附加的信息，以区别于att B。通过用“自杀性底物”将重组反

32、应停止在中间体状态，在此结构中核心序列被切开（图23-11）。缺刻的存在干挠了重组的进行。这样可使重组开始进行但又不能完成，从而便于鉴别。这些中间分子的结构表明整合通常是通过单链交换而不是“一致性剪切”。Int蛋白解离Hollidy连接，它能负责剪切和连接。很多位点特异重组复合体都是调节反应所需的，所以当病毒进入溶原状态时整合先进行；当原噬菌体进入裂解周期时，先进行切离。通过Int和Xis量的控制将进行相应的反应。二倒位重组沙门氏细菌（Salmonella）的相转变和Mu噬菌体G片段的移位都属于位点特异性重组。沙门氏菌的hin基因长995bp，它和Mu噬菌体的G片段的相应基因gin同源性很强，

33、功能也能在互补实验中互相替代。P1噬菌体中决定C片段倒位的cin基因也和him，gin同源。转座子Tn3的tnpR基因产物和Hin也有一定的同源性。Mu噬菌体G片段两端34bp的反向重复序列和Him片段的IRL和IRR也是高度同源的。倒位的机制是IRL和IRR互相配对，形成一个环，Hin蛋白的介导它们重组，切离和重组方式和Tn3共合体解离相似（见本章）。三。交配型转变的重组酵母交配型的转变这种重组有以下的特点：需要特殊蛋白HO； 需长同源序列；位点是特异的，仅在Y区重组； 重组时产生Chi结构；HO识别特殊位点并交配切割；复制过程中涉及修复性复制。以上特点表明：这种重组既不同于同源重组，也不同

34、于位点特异性重组，因此应单列为另一类型，称为同源特异重组。 第五节 原核生物的转座因子1951年美国遗传学家McClintock根据玉米染色体的长期观察研究，提出了转座（transposition）的新概念。麦克琳托克（McClintock B.）（190292）一原核生物中的转座因子的发现和检出虽然McClintock早在1951年就在玉米中发现了转座因子，但由于人们受到基因在染色体上有序排列的传统观念的桎梏而难以接受“跳跃基因”这一新的概念，所以直到1967年Shapiro才在E.coli中发现了转座因子（transposable element）。Shapiro在半乳糖操纵子中发现了一种

35、极性突变。gal操纵子有三个基因：gal K、T、E，它们编码三种酶（图23-12）催化Gal的分解代谢。其中间产物Gal-1-p是有毒的，因此galT-在含半乳糖的培养基上因使Gal-1-p积累而难以成活。那么在此培养基上能生长的各种突变型，应是galT-的回复突变及突变体galK -galT-，但意外发的发现galE-galT-也能生存，按理说这种突变型可使Gal-1-p积累是不可能存活的，但却居然生长良好，其原因何在，经进一步研究发现galE-是极性突变，由于它的突变使远离操纵位点的galK活性大大下降，因而细胞中不会积累Gal-1-p之故。以上的这种极性突变又和一般的极性突变不同，它有

36、以下的特点：能回复突变，表明不可能属于缺失或移码突变；用诱变剂对其处理并不能提高回复突变率，因此推测可能不是点突变。既排除了点突变，缺失和移码突变，那么还有什么样的变异能引起极性突变呢？此时人们已知道了F因子和噬菌体的整合功能，因此他们推测galE-的突变可能也是部分DNA的插入（突变）和切离（回复突变）所致。接着他们设计了一系列实验来证实这一想法。夏皮罗（J.A.Shapiro）（1943）（1）密度梯度离心实验：Jordon E.等和Starlinger P.小组以及Shapiro J.分别进行了以下实验，他们将含有gal+和galm(上述极性突变) 噬菌体分别分离出，同时加入到离心管中进行CsCl密度梯度离心，结果出现了两条带（图23-16），dgalm的密度dgal+,表明dgalm有可能具有小片断DNA的插入。图23-16将含有gal+和galm(上述极性突变) 噬菌体分别分离出，同时加入到离心管中进行CsCl密度梯度离心，结果出现了两条带(引自Griffithset al1999)图23-17 ldgl+/ ldglm杂合双链DNA的电镜照