丙二醛含量测定

1、实验六、植物组织丙二醛含量测定 植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内活性氧代谢的平衡被破坏而有利于活性氧的积累。活性氧积累的危害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。活性氧包括含氧自由基。自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。生物体内产生的活性氧主要有超氧自由基(O-2)、羟自由基(OH)、过氧自由基(ROO)、烷氧自由基(RO)、过氧化氢（H2O2）、单线态氧（O21）等。植物对活

2、性氧产生有酶促和非酶促两类防御系统，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶POD和抗坏血酸过氧化物酶(ASAPOD)等是酶促防御系统的重要保护酶，抗坏血酸(ASA)和还原型谷胱甘肽(GSH)等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。丙二醛(MDA)是细胞膜脂过氧化作用的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤。因此，丙二醛产生数量的多少能够代表膜脂过氧化的程度，也可间接反映植物组织的抗氧化能力的强弱。所以在植物衰老生理和抗性生理研究中，丙二醛含量是一个常用指标。 原理 植物组织中的丙二醛(MDA) 在酸性条件下加热可与硫代巴比妥酸(TBA) 产生显色反应，反应产物为粉红色的3，5，5一

3、三甲基恶唑2，4一二酮(Trimetnine)。该物质在539nm波长下有吸收峰。由于硫代巴比妥酸也可与其它物质反应，并在该波长处有吸收，为消除硫代巴比妥酸与其它物质反应的影响，在丙二醛含量测定时，同时测定600nm下的吸光度，利用539nm与600nm下的吸光度的差值计算丙二醛的含量。材料、仪器、药品 1材料：植物抗逆性鉴定实验中的四种菠菜样品，即绿色和黄色叶片的高温处理和室温对照。 2仪器：(1) 分光光度计；(2) 离心机；（3）水浴锅：(4) 天平；(5) 研钵；(6) 剪刀；(7) 5ml刻度离心管；(9) 刻度试管(10ml)；(10) 镊子；(11) 移液管(5ml、2ml、1m

4、l)；（12）冰箱。3药品：(1) 0.05mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液；(2) 石英砂；(3) 5三氯乙酸溶液：称取5g三氯乙酸，先用少量蒸馏水溶解，然后定容到100ml；(4) 0.5硫代巴比妥酸溶液：称取0.5g硫代巴比妥酸，用5三氯乙酸溶解，定容至100ml，即为0.5硫代巴比妥酸的5三氯乙酸溶液。 方法 1丙二醛的提取：取0.5g样品，加入2ml预冷的0.05mol/L pH7.8的磷酸缓冲液，加入少量石英砂，在经过冰浴的研钵内研磨成匀浆，转移到5ml刻度离心试管，将研钵用缓冲液洗净，清洗也移入离心管中，最后用缓冲液定容至5ml。在4500转/min离心10min。上清液即为丙

5、二醛提取液。2丙二醛含量测定：吸取2 ml的提取液于刻度试管中，加入0.5硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液3ml，于沸水浴上加热10min，迅速冷却。于4500转/min离心10min。取上清液于532、600nm波长下，以蒸馏水为空白调透光率100%，测定吸光度。 3结果计算：(A532A600) V1V丙二醛含量（nmol/g）=1.5510-1WV2 式中：A为吸光度；V1为反应液总量(5m1)；V为提取液总量(5ml)；V2为反应液中的提取液数量(2ml)；W为植物样品重量(0.5g)；1.5510-1为丙二醛的微摩尔吸光系数（在1升溶液中含有1mol丙二醛时的吸光度）。4注意事项：(1

6、) 0.10.5的三氯乙酸对MDATBA反应较合适，若高于此浓度，其反应液的非专一性吸收偏高；(2) MDATBA显色反应的加热时间，最好控制沸水浴1015min之间。时间太短或太长均会引起532nm下的光吸收值下降； (3) 如用MDA作为植物衰老指标，首先应检验被测试材料提取液是否能与TBA反应形成532nm处的吸收峰。否则只测定532、600nm两处A值，计算结果与实际情况不符，测得的高A值是一个假象；(4) 在有糖类物质干扰条件下(如深度衰老时)，吸光度的增大，不再是由于脂质过氧化产物MDA含量的升高，而是水溶性碳水化合物的增加，由此改变了提取液成分，不能再用532nm、600nm两处A值计算MDA含量，可测定510、532、560nm处的A值，用A532一(A510A560)/2的值来代表丙二醛与TBA反应液的吸光值。实验结果记录实验前思考题（1）通过丙二醛含量测定能够解决什么理论和实际问题？（2）什么时候植物会发生严重的膜脂过氧化作用？简述其过氧化作用过程。（3）说明膜脂过氧化作用的对植物的效应。（4）TBA为什么要溶解在三氯乙酸中？（5）提取液与TBA的混合液为什么要加热？为什么加热时间又不能过长？（6）为什么要测定反应液在600nm下的吸光度？（7）在计算公式中，为什么吸光系数的单位是微摩尔，而最后的含量单位却是毫微摩尔？（8）写出实验时间