分子生物学前沿技术

1、激光捕获显微切割Laser capture microdissection (LCM) technology是在不破坏组织结构，保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下，直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细胞 ，通常用于从组织中精确地分离一个单一的细胞。背景：机体组织包含有上百种不同的细胞，这些细胞各自与周围的细胞、基质、血管、腺体、炎症细胞或免疫细胞相互粘附。在正常或发育中的组织器官内，细胞内信号、相邻细胞的信号以及体液刺激作用于特定的细胞，使这些细胞表达不同的基因并且发生复杂的分子变化。在病理状态下，如果同一类型的细胞发生了相同的分子改变，则这种分子改变对于疾病的发生可能起着关键性

2、的作用。然而，发生相同分子改变的细胞可能只占组织总体积的很小一部分；同时，研究的目标细胞往往被其它组织成分所环绕。为了对疾病发生过程中的组织损害进行分子水平分析，分离出纯净的目标细胞就显得非常必要。1996年，美国国立卫生院（NIH）国家肿瘤研究所的2开发出激光捕获显微切割技术（Laser capture microdissection ，LCM ），次年，美国Arcturus Engineering公司成功研制激光捕获显微切割系统，并实现商品化销售。应用该技术可以在显微镜直视下快速、准确获取所需的单一细胞亚群，甚至单个细胞，从而成功解决了组织中细胞异质性问题。这项技术现已成为美国“肿瘤基因组

3、解剖计划”的一项支撑技术1。原理：LCM的基本原理是通过一低能红外激光脉冲激活热塑膜乙烯乙酸乙烯酯（ethylene vinylacetate，EVA）膜（其最大吸收峰接近红外激光波长），在直视下选择性地将目标细胞或组织碎片粘到该膜上2。LCM 系统包括倒置显微镜、固态红外激光二极管、激光控制装置、控制显微镜载物台（固定载玻片）的操纵杆、电耦合相机及彩色显示器。用于捕获目标细胞的热塑膜直径通常为6mm，覆在透明的塑料帽上，后者恰与后继实验所用的标准 0.5ml离心管相匹配。机械臂悬挂控制覆有热塑膜的塑料帽，放到脱水组织切片上的目标部位。显微镜直视下选择目标细胞，发射激光脉冲，瞬间升温使EVA膜

4、局部熔化。熔化的EVA膜渗透到切片上极微小的组织间隙中，并在几毫秒内迅速凝固。组织与膜的粘合力超过了其与载玻片间的粘合力，从而可以选择性地转移目标细胞。激光脉冲通常持续0.55.0毫秒，并且可在整个塑料帽表面进行多次重复，从而可以迅速分离大量的目标细胞。将塑料帽盖在装有缓冲液的离心管上，将所选择的细胞转移至离心管中，从而可以分离出感兴趣的分子进行实验3。EVA膜约100200m厚，能够吸收激光产生的绝大部分能量，在瞬间将激光束照射区域的温度提高到90C，保持数毫秒后又迅速冷却，保证了生物大分子不受损害。采用低能量红外激光的同时也可避免损伤性光化学反应的发生。优缺点：LCM最显著的优点在于其迅速

5、、准确和多用途的特性。结合组织结构特点以及所需的切割精确度，通过选择激光束的直径大小，可以迅速获取大量的目标细胞。LCM与以显微操作仪为基础的显微切割技术相比4，具有以下优点：(1)分离细胞速度快，无需精巧的操作技能；(2)捕获细胞和剩余组织的形态学特征均保持完好，可以较好地控制捕获细胞的特异性；(3)捕获细胞与塑料帽结合紧密，减少了组织损失的风险。相比而言，除了激光切割弹射微分离系统5以经染色的用于存档的切片也可被成功进行显微切割。尽管LCM应用广泛，但对于常规染色、固定且不加盖玻片的组织切片，其视觉分辨率受到很大限制。而对于那些本身缺乏一定结构特点的复杂组织（如淋巴组织，广泛浸润的腺癌等）

6、，要准确分离出某一类细胞几乎是不可能的。Fend等6通过采用特殊染色，尤其是免疫组化方法，使目标细胞或想要去除的细胞变得更加醒目，从而解决了上述难题。应用LCM，偶尔会出现无法将选择的细胞从切片上移走的情况，出现这种结果有两种原因：(1)细胞与热塑膜之间的粘合力不足，通常是由于组织未完全脱水或激光的能量设置过低造成的；(2)组织切片与载玻片间的粘合力过强，通常发生在显微切割干燥时间过长的冰冻切片。针对不同样本组织（包括免疫组化染色的组织切片），一些研究小组分别详尽报道了采用适合的处理方法，以达到最佳的显微切割条件7。应用：LCM较以往的显微切割技术有了突破性的进展，现已广泛应用于肿瘤研究，包括

7、前列腺癌8、肾癌、肺癌、甲状腺癌9、食管癌、胃癌、肝癌、胆管癌、结肠癌、乳腺癌、胶质瘤、恶性胸膜间皮瘤、淋巴瘤、卵巢癌等。此外，LCM还成功应用于其它一些疾病的研究中，如Crohn病10、肌萎缩性侧索硬化症11、子宫内膜异位症、获得性免疫缺陷综合征、结核病、丙型肝炎等。而应用LCM所分离的组织也多种多样，包括单个细胞、单一细胞群（主要是癌巢）、血管等类型。展望：LCM成功解决了组织异质性问题，且具有迅速、准确等诸多优点，已被广泛应用于肿瘤等疾病基因水平的研究中，并显示出了良好的应用前景1。但今后可能还需要以下几个主要方面的发展和完善：理论上，除上述组织及细胞以外，LCD还可应用于其他所有组织细

8、胞（如脾脏巨噬细胞、肝脏Kuffer细胞等）的分离，但其各自的切片制备、染色等技术方法尚需要进行探索；开发相应的应用程序，仅需输入目标细胞或组织的特异性参数即可实现计算机自动控制LCD12，从而大大缩减所需的人力和时间；提高捕获单个细胞的精确度，以减少非目标组织的沾染；进一步优化快速免疫组化染色的步骤，改进DNA和 RNA抽提技术，实现从少量捕获细胞或组织中获得高质量的核酸。变性高效液相色谱分析（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）原理：在部分变性的条件下，通过杂合与纯合二倍体在柱中保留时间的差异，发现DNA突变。异源

9、双链DNA与同源双链DNA的解链特性不同，在部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，在色谱柱中的保留时间短于同源双链，故先被洗脱下来，在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。用离子对反向高效液相色谱法：在不变性的温度条件下，检测并分离分子量不同的双链DNA分子或分析具有长度多态性的片段，类似RFLP分析，也可进行定量RTPCR及微卫星不稳定性测定（MSI）；在充分变性温度条件下，可以区分单链DNA或RNA分子，适用于寡核苷酸探针合成纯度分析和质量控制；在部分变性的温度条件下，变异型和野生型的PCR产物经过变性复性过程，不仅分别形成同源双链，同时也错配形成异源双链，根据柱子保留时间的不

10、同将同源双链和异源双链分离，从而识别变异型。根据这一原理，可进行基因突变检测、单核苷酸多态性分析SNPs等方面的研究。优点：近年来建立并迅速发展的DHPLC是一种新型基因突变筛查技术，既能够自动化、高通量进行，且除PCR之外，勿需进行PCR引物修饰、购买特殊试剂、检测标记信号或作其它的样品处理。而目前已有的许多DNA突变分析技术诸如单链构象多态性 (single-strand conformation polymorphism，SSCP)、变性梯度凝胶电泳法(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)等均不能满足此要求。DHPLC具有高通量检测

11、、自动化程度高、灵敏度和特异性较高、检测DNA片段和长度变动范围广、相对价廉等优点。与传统的SSCP、DGGE等方法相比，DHPLC有较多的优点。SSCP的结果受血样质量、提取方法等因素的影响，并且需要跑胶、电泳；DGGE则需要标记引物，存在放射性污染，这两种方法都比较费时费力。而DHPLC则高度自动化，可以自动取样，检测每个样品只需要8分钟左右。DHPLC与其他检测DNA突变方法的最大不同在于，它能够纯化DNA片断。当然，只能检测杂合突变是DHPLC的不足之处，但是这可以利用混合的方法（即将纯合突变样品和野生型样品混合）来解决。多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-de

12、pendent probe amplification ,MLPA）于2002年由Schouten等首先报道，是近几年发展起来的一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的新技术。该技术高效、特异，在一次反应中可以检测45个核苷酸序列拷贝数的改变，目前已经应用于多个领域、多种疾病的研究。原理：MLPA的基本原理包括探针和靶序列DNA进行杂交，之后通过连接、PCR扩增，产物通过毛细管电泳分离及数据收集，分析软件对收集的数据进行分析最后得出结论。每个MLPA探针包括两个荧光标记的寡核苷酸片段，一个由化学合成，一个由M13噬菌体衍生法制备；每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。在MLPA反应中

13、，两个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交，之后使用连接酶连接两部分探针。连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶序列与探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链；反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱基的差别，就会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。连接反应完成后，用一对通用引物扩增连接好的探针，每个探针的扩增产物的长度都是唯一的，范围在130480bp。最后，通过毛细管电泳分离扩增产物，Genemarker软件分析，得出结论。只有当连接反应完成，才能进行随后的PCR扩增并收集到相应探针的扩增峰，如果检测的靶序列发生点突变或缺失、扩增突变，那么

14、相应探针的扩增峰便会缺失、降低或增加，因此，根据扩增峰的改变就可判断靶序列是否有拷贝数的异常或点突变存在。应用：检测染色体亚端粒的基因重排 智力低下是遍及全世界的严重危害儿童身心健康的一类疾患，其中一部分是由可知原因引起的，包括感染、中毒、脑疾病等，但是很大一部分患儿的病因不明。近几年的研究发现，包括亚端粒在内的基因重排是引起智力低下的重要原因M,N，因为亚端粒的基因非常丰富，微小的改变就会累及众多的基因，从而导致疾病的发生。目前，应用较多的检测染色体亚端粒的方法包括染色体核型分析，荧光原位杂交（FISH），但是前者不能检出亚端粒微小的基因重排，而后者费时、费力、又非常昂贵，不易推广。MLPA

15、-P036和MLPA-P070试剂盒，针对每一个染色体的末端都设计有一个特异性探针，它经济、高效、快速，可以用于检测亚端粒的基因重排P,Q，揭示部分智障患儿的发病原因。检测染色体的非整倍性改变S,T 目前，检测染色体的非整倍性改变的方法主要为染色体核型分析，但是它在检测羊水细胞、绒毛或是其他胎儿细胞时，需要进行体外细胞培养，若培养失败、细胞过少或染色体形态较差时，常常影响实验结果。应用MLPA检测这类标本时，不需要体外培养，少量标本即可进行检测，针对易发生非整倍性改变的染色体（13，18，21，X，Y）上的几个热点基因设计特异性探针，根据特定基因拷贝数的改变，即可确定染色体数目的异常。检测单核

16、苷酸的多态性（SNP）和点突变 根据MLPA的原理可知，靶序列DNA只要有一个碱基的改变，便可导致杂交不完全，使其扩增产物缺失，因此，MLPA高度特异性的检测可用于多种SNP和点突变。几种常见的儿童遗传性疾病的检测1）智力低下综合征 多种已知的智力低下综合征与染色体特定区域的基因改变相关。这些患儿临床表现复杂，个体差异大，缺乏特征性表现，医生很难作出准确诊断。MLPA-P064试剂盒，针对特定的染色体区域设计了43个探针，可以明确几种疾病的诊断A，包括：1p-缺失综合征，Williams综合征，Smith-Magenis综合征，Miller-Dieker综合征，Digeorge综合征W，Ala

17、gille综合征，Sotos综合征。根据同样的原理，MLPA-P096试剂盒可检测的疾病包括：Wolf-Hirschhorn综合征，Cri du Chat综合征，WAGR综合征，Downs综合征等。2）X连锁型智力低下C X连锁型智力低下可以分为综合征型和非综合征型，前者具备特征性的临床表现，而后者没有特异性症状，智力低下常常为患儿的唯一表现。目前已经发现19个基因与X连锁型智力低下相关，MLPA-P106可以检测其中14个相关基因的改变。3）假肥大型肌营养不良症D,E,F 假肥大型肌营养不良症包括Duchenne型肌营养不良（DMD）和Becker型肌营养不良，临床表现主要为骨盆带肌和下肢近

18、端肌肉无力，腓肠肌假性肥大等，致病基因位于Xp21.2，包括70多个外显子。疾病的发生与DMD基因的缺失、重复或点突变相关。MLPA-P034和MLPA-P035试剂盒设计了80多个探针可以检测每一个外显子的缺失或重复突变，及部分点突变。4）Prader-Willi综合征（PWS）和Angelman综合征（AS）H,I PWS和AS都是由染色体15q11-13缺失或同源二倍体所致。如果是父源性染色体15q11-13缺失或母源性同源二倍体则引起PWS，如果是母源性染色体15q11-13缺失或父源性同源二倍体则引起AS。在人类，父源15q11-13区域存在非甲基化的SNRPN印迹基因，母源性15q

19、11-13区域存在完全甲基化的SNRPN印迹基因。甲基化特异性的MLPA试剂盒ME028采用半定量式的方式可以检测基因拷贝数的改变，探针所识别的DNA序列包括甲基化敏感的核酸内切酶Hha位点，因此可以分析CpG岛的甲基化状态，从而区别PWS和AS。5）其他疾病的检测 MLPA还可以用于成神经细胞瘤J、a-地中海贫血K等疾病的诊断。成神经细胞瘤是儿童中枢神经系统发生的肿瘤，明确特征性基因的改变对确认神经肿瘤发生的过渡阶段、治疗和预后都有重要意义，为临床提供极大的帮助。优缺点：MLPA结合了DNA探针杂交和PCR技术，具有以下优点1、高效：一次反应可以检测45个靶序列拷贝数的改变。2、特异：可以检

20、测点突变。3、快速：一次实验可以在24小时内完成。4、简便：不同的试剂盒操作基本相同，容易掌握。MLPA虽然具有很大优点，但也有其局限性1、需要精确测量DNA的浓度，样本容易被污染。2、不能用于单个细胞的检测。3、MLPA用于检测基因的缺失或重复，不适合检测未知的点突变类型。4、不能检测染色体的平衡易位。单核苷酸多态性SNP全称Single Nucleotide Polymorphisms，是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。从理论上来看每一个SNP位点都可以有4 种不同的变异形式,但实际上发生的只有两种，即转换和颠换,二者之比为

21、2：11。SNP 在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T ,原因是CG中的胞嘧啶常被甲基化,而后自发地脱氨成为胸腺嘧啶。一般而言,SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP ,人类基因组上的SNP 总量大概是3 106 个 。因此,SNP成为第三代遗传标志,人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。作用和成果：SNP研究是人类基因组计划走向应用的重要步骤。这主要是因为SNP将提供一个强有力的工具，用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等。SNP在基因组中分布相当广泛，研究表明在

22、人类基因组中每300碱基对就出现一次。大量存在的SNP位点，使人们有机会发现与各种疾病，包括肿瘤相关的基因组突变；从实验操作来看，通过SNP发现疾病相关基因突变要比通过家系来得容易；有些SNP并不直接导致疾病基因的表达，但由于它与某些疾病基因相邻，而成为重要的标记。SNP在基础研究中也发挥了巨大的作用，通过对Y染色体SNP的分析，使得在人类进化、人类种群的演化和迁徙领域取得了一系列重要成果。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性

23、的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每5001000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。理论上讲，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。因此，通常所说的SNP都是二等位多态性的。这种变异可能是转换(C T，在其互补链上则为G A)，也可能是颠换(C A，G T，C G，A T)。转换的发生率总是明显高于其它

24、几种变异，具有转换型变异的SNP约占2/3，其它几种变异的发生几率相似。Wang等的研究也证明了这一点。转换的几率之所以高，可能是因为CpG二核苷酸上的胞嘧啶残基是人类基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的SNP(coding SNP,cSNP)比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5。但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此cSNP的研究更受关注。从对生物的遗传性状的影响上来看，cSNP又可分为2种：一种是同义cSNP(synonymous cSNP),即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；另一种是非同义cSNP(non-synonymous cSNP),指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能。这种改变常是导致生物