神经干细胞移植治疗老年痴呆

1、神经干细胞移植治疗老年痴呆张 颖1，闫洪娟1，郭建华1，罗秋华1，李晓辉2(1邯郸市第一医院老年病二科，河北省邯郸市 ；2河北大学附属医院老年病科，河北省保定市 )引用本文：张颖，闫洪娟，郭建华，罗秋华，李晓辉. 神经干细胞移植治疗老年痴呆J.中国组织工程研究，2016，20(19):2838-2843.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.19.015 ORCID: 0000-0002-2858-3952(张颖)文章快速阅读：神经干细胞的分化张颖，女，1973年生，河北省涉县人，汉族，2003年河北医科大学毕业，副主任医师，主要从事老年期痴呆研究。中图分类号:

2、R394.2文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)19-02838-06稿件接受：2016-03-20http:/WWW.神经干细胞自我更新祖细胞增殖神经元祖细胞神经胶质祖细胞特化的细胞(承诺)神经元星形胶质细胞少突胶质少突胶质细胞 神经干细胞：肿瘤干细胞：具有分化为神经神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新，并足以提供大量脑组织细胞的细胞群，是一类具有分裂潜能和自更新能力的母细胞，它可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞。需要强调的是，在脑脊髓等所有神经组织中，不同的神经干细胞类型产生的子代细胞种类不同，分布也不同。老年痴呆：又名阿尔茨

3、海默症，是最常见的神经退行性疾病，其特点是渐进性认知死亡，最大的危害是造成大量的神经细胞功能障碍，最终导致记忆丧失，在临床上主要症状为记忆衰退，认知能力大幅下降，相关机制并未完全掌握，病理表现主要包括大脑皮质和海马CA1区的损伤，海马区被证实为重要的学习和记忆功能区。摘要背景：神经干细胞移植已应用于临床治疗脑瘫等脑损伤疾病，但对老年痴呆的相关研究并未深入。目的：观察神经干细胞移植对老年痴呆大鼠行为学及免疫调节系统的影响。方法：选取SD大鼠35只，切开脑后皮肤，在脑内海马区注射鹅膏蕈酸，建立老年痴呆模型；另取SD大鼠10只，切开脑后皮肤，在脑内海马区注射生理盐水，作为假手术组。将造模成功的32只

4、老年痴呆大鼠随机分为2组，每组16只，实验组于脑内海马区注射5109 L-1的同种异体神经干细胞悬液；模型组仅穿刺，不注射任何物质，移植后4周，对3组大鼠进行Morris水迷宫实验，连续5 d；水迷宫实验1周后，检测3组大鼠脑组织匀浆白细胞介素1、白细胞介素10水平，观察脑组织病理形态学变化。结果与结论：Morris水迷宫实验：模型组认知和记忆能力均明显低于假手术组(P 0.01)，实验组空间学习能力、记忆能力均显著高于模型组(P 0.05，P 0.01)。脑组织匀浆炎炎性因子：模型组白细胞介素1、白细胞介素10水平明显高于假手术组(P 0.01)，实验组白细胞介素1、白细胞介素10水平明显低

5、于模型组(P 0.01)。脑组织病理：模型组神经元细胞明显少于假手术组，实验组神经细胞数目明显多于模型组。结果表明，神经干细胞移植对老年性痴呆大鼠神经元具有补充和保护作用，可明显改善动物的学习和记忆能力。关键词：干细胞；移植；神经干细胞；老年痴呆；动物研究；干细胞移植主题词：干细胞；神经干细胞；阿尔茨海默病；痴呆；组织工程基金资助：河北省医学科学研究重点课题()Neural stem cell transplantation for Alzheimers diseaseZhang Ying1, Yan Hong-juan1, Guo Jian-hua1, Luo Qiu-hua1, Li Xi

6、ao-hui2 (1Second Department of Geriatrics, First Hospital of Handan, Handan , Hebei Province, China; 2Department of Geriatrics, Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding , Hebei Province, China)AbstractBACKGROUND: Neural stem cell transplantation has been used to treat a series of brain injur

7、y diseases, such as cerebral palsy, but its effect on Alzheimers disease is rarely reported.OBJECTIVE: To observe the effect of neural stem cell transplantation on the behavior and immune regulating system of Alzheimers disease rats. Zhang Ying, Associate chief physician, Second Department of Geriat

8、rics, First Hospital of Handan, Handan , Hebei Province, ChinaMETHODS: Thirty-five Sprague-Dawley rats were enrolled to make a postcerebral incision and given hippocampal injection of amanita phalloides acid to establish rat models of Alzheimers disease. Another 10 rats were only given hippocampal i

9、njection of normal saline after preparation of postcerebral skin incision as sham operation group. Then 32 successful rat models were randomly divided into two groups (n=16 per group): rats in experimental group were administrated hippocamal injection of 5109/L allogeneic neural stem cell suspension

10、; those in model group were given no injection. Five-day Morris water maze test was conducted at 4 weeks after transplantation. At 1 week after Morris water maze test, levels of interleukin-1 and interleukin-10 in the cerebral homogenate were detected, as well as pathological changes of brain tissue

11、s were observed in the three groups. RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model group, the abilities of cognition and memory were significantly higher in the sham operation group (P 0.01), and the abilities of spatial learning and memory were significantly higher in the experimental group (P 0.

12、05, P 0.01). Levels of interleukin-1 and interleukin-10 in the model group were significantly higher than those in the sham operation group (P 0.01) but significantly lower than those in the experimental group (P 0.01). Besides, the number of neurons in the model group was obviously less than that i

13、n the experimental and sham operation group. These results indicate that neural stem cell transplantation supplements and protects neurons against Alzheimers disease in rats, thereby significantly improving the learning and memory ability.Subject headings: Stem Cells; Neural Stem Cells; Alzheimer Di

14、sease; Dementia; Tissue EngineeringFunding: the Medical Scientific Research Key Project of Hebei Province, No. Cite this article: Zhang Y, Yan HJ, Guo JH, Luo QH, Li XH. Neural stem cell transplantation for Alzheimers disease. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(19):2838-2843.0 引言 Introduction老

15、年痴呆症1-7，又名阿尔茨海默症8，是最常见的神经退行性疾病，其特点是渐进性认知死亡，最大的危害是造成大量的神经细胞功能障碍，最终导致记忆丧失，在临床上主要症状为记忆衰退，认知能力大幅下降，相关机制并未完全掌握，病理表现主要包括大脑皮质和海马CA1区的损伤9，海马区被证实为重要的学习和记忆功能区。老年痴呆的主要病变部位有海马区神经元退化减少，但目前还没有完全治愈或预防老年痴呆的临床药物出现。胚胎神经干细胞移植可能是一种有效的治疗老年痴呆的方法10。采用鹅膏蕈酸造模的方法来研究神经干细胞干预治疗老年痴呆的研究尚不多。实验探讨神经干细胞移植对鹅膏蕈酸脑内注射造成的老年痴呆大鼠行为学和免疫调节系统的

16、 影响。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 随机对照动物实验。1.2 时间及地点 于2014年6月至2015年6在邯郸市第一医院实验室完成。1.3 材料 实验动物：SPF级雄性SD大鼠45只，体质量(23510) g；雄性SPF级SD大鼠乳鼠(10 d)10只，均购自河北省实验动物中心。神经干细胞移植治疗老年痴呆实验用主要试剂、耗材、仪器：试剂、耗材、仪器来源SW-CJ-2F型医用净化工作台苏州净化设备厂改良型DMEM/F12培养基、2.5%胰蛋白酶、双抗、胎牛血清、谷氨酰胺美国Gibco公司水合氯醛广州齐云生物科技公司CU600型电热恒温水浴锅上海一恒科

17、学仪器有限公司RT-2100C型酶标分析仪深圳雷杜生命科学股份有限公司微孔滤膜美国millipore公司CKX-41-32型倒置显微镜日本OLYMPUS公司Morris水迷宫分析软件 荷兰NOLDUS公司Morris水迷宫淮北正华生物仪器设备有限公司IL-1、IL-10 ELISA试剂盒武汉华美生物工程有限公司鹅膏蕈酸美国Sigma公司苏木精-伊红染料浩玛生物科技有限公司1.4 方法老年痴呆大鼠模型的建立和实验分组：取SD大鼠45只，适应性饲养约7 d后，参照文献11的研究方法用10%水合氯醛1.0-1.2 mL/只腹腔注射麻醉，将其头部毛发轻轻剪去，将动物头部固定在脑立体定位仪上，在手术前充

18、分做好消毒工作，在头皮中间的位置纵向切口，用手术镊子和剪刀轻轻剥离表面黏膜，再用体积分数5%双氧水在头骨上轻轻擦拭直至头骨间隙清晰。抽取2 L鹅膏蕈酸(2.5 g/L)，定位回原来所定的点上，向硬膜下移动6 mm，找到进针部位。选取其中35只大鼠注射鹅膏蕈酸5 g，在5-10 min内注完，注射时要保持注射速度均一，注射后静置5 min；另10只大鼠注射生理盐水，作为假手术组，缝合大鼠头皮，最后用乙醇消毒，涂抹碘酒后并腹腔注射青霉素4104 U/只，1次/d，连续用药7 d。术后放置舒适的条件下直至清醒。 模型筛选：海马区注射鹅膏蕈酸之后，死亡3只动物，其余均存活下来，待伤口愈合，2周后取血测

19、定血清中白细胞介素1和白细胞介素10，4周后进行Morris水迷宫实验12-14，进行动物模型筛选，具体操作方法参照文献15的方法：空间定航实验：实验总共开展5 d训练，每天记录大鼠实验中所用的时间即潜伏期，潜伏期越短说明动物的学习记忆能力越好。实验中保持动物实验环境安静，排除其他非实验因素的干扰。将大鼠随机放入水池中的4个象限中，每只动物限定时间为2 min，若2 min后动物仍然无法找到平台，则需牵引至平台，记录潜伏期为2 min，当大鼠登上平台后，停留20 s，用来消除动物的紧张情绪和给予时间记忆平台的位置，每天训练4次16。空间探索实验：用来衡量动物对事物的记忆保持，实验中撤去平台，随

20、机投放动物的入水点(非平台象限)，通过自动录像系统记录大鼠在2 min内进出目标象限的次数17。根据Morris水迷宫动物实验结果和血清中炎症因子的水平，将32只造模成功动物平均分配到模型组和实验组。 神经干细胞培养2：神经干细胞来源于SD乳鼠(10 d)，经过梯度离心和胰酶消化贴壁培养等方法将原代神经干细胞分离出来，待细胞长到80%-90%融合之后，进行传代培养，稳定生长到三四代时，用胰酶将细胞消化下来，加入DMEM完全培养基终止消化，1 000 r/min离心5 min。用PBS冲洗一两次，用DMEM完全培养基重悬细胞，计数至5109 L-1，用于移植。神经干细胞移植：实验组采用大鼠海马区

21、内定位注射，移植前用微量进样器吸取5 L 胞浓度为5109 L-1的神经干细胞悬液，按照之前的造模部位进针，注射速度1 L/min，注射完毕后继续留针2 min，在5 min的时间将进样器缓缓抽出。进针后观察动物的伤口是否出血、细胞悬液是否已出等情况，小心将动物缓缓安放好，注射青霉素(4104 U/只)，至动物完全恢复清醒。模型组只穿刺不进样。1.5 主要观察指标 神经干细胞移植后，观察4周，重复造模期的水迷宫实验，连续做5 d，记录实验结果。待动物恢复1周后，腹腔注射水合氯醛大剂量麻醉处死动物，多聚甲醛灌注固定心脏后，取出大脑，分离脑组织，一部分多聚甲醛固定，进行苏木精-伊红染色，镜下观察大

22、鼠脑组织经过神经干细胞移植之后出现的病理形态学的变化；另一部分液氮速冻，移至-80 冰箱长期保存，用于后期脑组织匀浆测定白细胞介素1、白细胞介素10的水平18-19。1.6 统计学分析 实验的数理统计分析均使用SPSS 21.0软件，所有数据均采用s表示。使用的统计学方法主要是方差齐性使用配对t 检验，方差不齐采用秩和检验，P 0.05表示组间差异有显著性意义，P 0.01表示组间差异有非常显著性意义。2 结果 Results 2.1 实验动物数量分析 造模前使用SD大鼠45只，在造老年痴呆大鼠模型的过程中有3只动物死亡，最后进入结果分析的为假手术组10只，实验组和模型组各16只。2.2 造模

23、后动物行为学观察和血清炎症因子水平检测结果 动物行为学观测主要采用Morris水迷宫实验来了解大鼠的学习和认知能力变化；血清中炎症因子白细胞介素1、白细胞介素10主要反映动物在受到鹅膏蕈酸刺激之后动物整体炎症的进展情况，综合行为学观察和血清炎症相关因子的水平来判定模型的成功与否，见表1。表1 神经干细胞移植前各组动物空间定航实验和血清炎症因子水平的比较 (s)Table 1 Spatial navigation test and levels of serum inflammatory factors in rats prior to neural stem cell transplantat

24、ion组别假手术组模型组实验组白细胞介素1(ng/L)207.021.9389.034.5a371.029.8a白细胞介素10 (ng/L)24.82.939.64.8a40.85.5aMorris水迷宫潜伏期(s)第1天第2天第3天第4天第5天58.914.898.412.1a95.215.1a57.312.991.221.1a96.817.0a55.410.899.520.8a98.316.9a59.114.696.419.4a98.019.1a56.514.095.918.1a89.414.9a表注：与假手术组比较，aP 0.01。由表1可以看出，在脑内注射鹅膏蕈酸之后，模型组、实验组动

25、物血清中炎症因子的表达明显升高，其中白细胞介素10和白细胞介素1相对于假手术组均明显升高(P 0.01)；Morris水迷宫实验结果显示，模型组、实验组造模后动物的记忆和认知能力均明显下降，无论从潜伏期还是进出目标象限的次数均较假手术组明显增加(P 0.05，P 0.01)，见表2。2.3 神经干细胞移植后各组动物炎症因子和行为学观察指标的变化 神经干细胞移植后，实验组脑组织匀浆中白细胞介素10和白细胞介素1均明显低于于模型组 (P 0.05)；在训练的第2天，与模型组比较差异有显著性意义(P 0.05)；在第四五天，与模型组比较差异有非常显著性意义(P 0.01)，见表3。 在移植神经干细胞

26、后4周，动物的认知能力有了一定的提升，Morris水迷宫实验中大鼠经过特定象限实验结果显示，实验组神经干细胞移植前后比较差异有显著性意义(P 0.05)，见表2。2.4 各组脑组织苏木精-伊红染色后病理检查结果 苏木精-伊红染色之后，在视野中发现模型组神经元细胞明显少于假手术组，实验组能够明显增加大鼠神经细胞数目，综合多个视野的观察发现，实验组大鼠脑内神经元数目明显多于模型组，见图1。表2 神经干细胞移植前后各组大鼠Morris水迷宫实验中空间探索实验结果 (s，次)Table 2 Results of space exploration test in the Morris water ma

27、ze test before and after neural stem cell transplantation表注：与假手术组比较，aP 0.01，与模型组比较，bP 0.05。组别移植前移植4周后假手术组2.1模型组4.11.2a4.41.3a实验组4.51.9a7.82.2ab表3 神经干细胞移植后动物空间定航试验和脑匀浆中炎症因子的水平 (s)Table 3 Spatial navigation test and levels of serum inflammatory factors in rats after neural stem cell transplan

28、tation表注：与假手术组比较，aP 0.01；与模型组比较，bP 0.05，cP 0.01。组别假手术组模型组实验组白细胞介素1(ng/L)211.015.8371.431.2a304.119.8ad白细胞介素10(ng/L)23.93.839.93.8a32.44.3adMorris水迷宫潜伏期(s)第1天第2天第3天第4天第5天57.813.192.821.9a83.717.9a54.311.292.921.6a80.819.3ab52.012.798.421.2a78.412.5ab51.5a72.815.9ac50.812.491.517.8a70.412.

29、3ac3 讨论 Discussion老年痴呆是一种中枢神经系统的慢性疾病，也叫阿尔兹海默症，主要表现为记忆力日渐衰退，认知能力下降，甚至出现精神疾病等症状2，20-22。老年痴呆的病因及发病机制尚未阐明，主要表现为淀粉样蛋白沉积、tau蛋白过度磷酸化、神经元丢失等，其中淀粉样蛋白沉积是形成老年斑9、形成神经原纤维缠结及神经元减少并伴有轴突数量减少的主要原因23。目前对老年痴呆的形成原因还没有确切的研究进展，综合起来有环境和遗传等方面的因 素24-26。同时对老年痴呆的治疗目前没有很好疗效的新药出现。神经干细胞移植被认为是一种新型的具有潜力的治疗方法，但很少有研究将这一治疗方法和免疫调节相关联。

30、实验基于这一方向，采用鹅膏蕈酸海马区注射造成老年痴呆的大鼠模型8，通过行为学观察和相关生理生化指标的测定，较好地保障了模型的成功率，为后面神干细胞BA图1 模型组与假手术组脑组织苏木精-伊红染色 Figure 1 Number of neurons in the sham operation group and model group (hematoxylin-eosin staining)图注：图中A为假手术组，B为模型组。 模型组神经元细胞明显少于假手术组。的效用发挥奠定基础。实验主要关注神经干细胞移植后对动物行为学观察和血清脑组织中免疫调节的影响，有研究表明，老年痴呆患者脑组织中存在系统

31、性的炎症反应，病变部位主要在海马和皮质区27-28。所以本实验中鹅膏蕈酸的注射部位和神经干细胞移植部位均选定为海马区。炎症反应就是-淀粉样蛋白沉积所引起的局部继发性反应，也是中枢神经系统退行性变的重要原因26，29。实验中发现，在神经干细胞移植后，动物免疫炎症因子水平明显下降，说明神经干细胞移植能够改善老年痴呆的脑组织中炎症反应，白细胞介素1可能是-淀粉样蛋白沉积之后产生的炎症反应标志30-33，数据表明，神经干细胞移植能明显降低老年痴呆大鼠脑组织中白细胞介素1的水平，改善老年痴呆的脑组织免疫反应，说明神经干细胞移植能够发挥较好的治疗作用。实验采用的 Morris水迷宫实验在神经退行性疾病，如

32、阿尔茨海默症和帕金森症等的研究方面是非常有效的，这些疾病的最大特征是认知功能衰退18。Morris水迷宫实验首选适用的范围，是以海马损伤表现的认知功能衰退的记忆缺损。行为学指标上发现，模型动物在神经干细胞移植之后，空间探索实验和空间定位实验均有很好的表现，具体表现在空间探索实验中，平台潜伏期随着训练时间的延长，动物出现明显的记忆学习倾向，在实验第1天，实验组和模型组相比潜伏期明显缩短，但无统计差异，随后的几天实验均有明显的差异，同时潜伏期大幅下降。在空间定位实验中发现，实验组动物经过指定区域的次数明显增加，说明动物记忆功能有一定的恢复，和假手术组相比差距在减小，虽然仍有统计学差异，但可以发现神

33、经干细胞移植能改善老年痴呆大鼠的学习和记忆，同时也表明神经干细胞移植在短期内还不能完全对抗老年痴呆的脑损伤和神经元退化消失，提示在应用中神经干细胞移植这项技术还需进一步研究，提升其治疗老年痴呆的效率。总的来说，实验证实了神经干细胞移植能够显著增强老年痴呆大鼠的学习和认知能力，改善记忆力，同时本实验还关注了神经干细胞移植对免疫系统的作用，但相关研究并未深入，在接下来的研究中应继续不深入研究神经干细胞移植的免疫调节作用。作者贡献：第一作者负责设计和实施，第二、三、四、五作者负责实施及文章的修改。利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。伦理问题：本次研究相关内容和方法均经邯郸市第一医院

34、伦理部门审核并批准。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家审核，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 Heppner FL,Ransohoff RM,Becher B.Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease.Nat

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