基因工程：第一章 基因工程概论

1、基因工程 Genetic Engineering,最新款的摩托车,谁能告诉我这是？,谁能告诉我这是？,香 蕉 鱼,家蚕能够吐出蚕丝为人类利用,豆科植物的根瘤能够固定空气中的氮,青霉菌能产生对人类有用的抗生素青霉素,现代生物工程技术,参考书,张惠展.基因工程(第2版) 2010,高等教育出版社 闫新甫. 转基因植物. 2003, 北京: 科学出版社 王关林等. 植物基因工程（第二版）. 2002, 北京: 科学出版社 吴乃虎. 基因工程原理 （第二版）. 1998, 北京: 高等教育出版社 Adrian Slater, et al. Plant Biotechnology-The genetic

2、 manipulation of plant. Oxford universsity press. 2003 Lewin. Genes . Pearson prentice hall. 2004 Watson, Et al. Molecular biology of gene（fifth edition）Gold spring harbor Laboratory press. 2004,课 程 主 要 内 容,第一章 基因工程概述 第二章 基因工程工具酶 第三章 基因工程载体 第四章 目的基因克隆 第五章 基因工程的基本技术 第六章 微生物、动物和植物基因工程 第七章 基因工程的发展及应用,基

3、因工程,概论 Introduction,相关理论,DNA结构与复制 基因的相关概念 基因组,DNA分子组成： 碱 基 腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、 胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T) 脱氧核糖 磷 酸,（一） DNA的结构,(A)腺嘌呤,(G)鸟嘌呤,(C)胞嘧啶,(U) 尿嘧啶,(T) 胸腺嘧啶,DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替，彼此通过3/,5/-磷酸二酯键连接，排在外侧，构成基本骨架；4种碱基排列在内侧。,DNA的结构,.两条脱氧核苷酸链成反向平行排列， .一条呈5 3方向 .另一条呈3 5方向。 .以碱基配对形成氢键而形成双螺旋结构 .遵循互补配对原则即： AT GC,双螺旋结构,(T) 胸

4、腺嘧啶,DNA的三种构型：,-超螺旋：共价闭环（CCC） -开环：单链缺口（OC） -线型：双链断裂（L）,LC,ccc,oc,DNA的性能,吸收光谱高峰为260nm 溴化乙啶（EB）嵌入DNA双链配对碱基之间，紫外线照射，可显示DNA位置 在电场中的迁移率与分子量大小、构象有关 DNA变性：在物理或化学因素作用下，氢键断裂成单链的过程 DNA复性：变性因素去除后在适当条件下恢复成双链的过程。,DNA变性(DNA Denature ),指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为单链线性结构的现象。 变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂但不涉及到其一级结构的改变。 凡能破坏双螺旋稳定性的因素，均可引起核酸

5、分子变性。 解链温度: Tm=69.30.41(%G+C) （使一半螺旋结构解体时的温度）,DNA复性 ( DNA Renature ),是DNA变性的一种逆转过程。热变性后的DNA一般 经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为退火(annealing)。 最佳复性条件一般认为是比Tm低25左右的温度 复性时温度下降必须缓慢 ，若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温(如4以下)，复性几乎是不可能的，核酸实验中经常以此方式保持DNA的变性(单链)状态。,复性,RNA,DNA,DNA的复制,半保留复制 （semi-conservative replication）,（二） 基因的概念,遗传学概念： 基因:

6、是DNA分子中携带特定遗传信息的最小功能单位，控制遗传性状,转录,剪切,翻译,分子生物学定义： 编码功能性蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核酸序列， 负载特定的遗传信息并在一定条件下调节、表达遗传信息， 指令蛋白质合成。,基因的功能分类,结构基因（structure gene)： 决定蛋白质/多肽链或酶分子结构的基因 调控基因 (regulatory gene)： 调节控制结构基因表达功能,基因的一般特性,半保留自我复制 决定生物表型或性状 基因突变 新的生物性状,（三）基因组（genome),概念：细胞或生物体的全套遗传物质 常见基因组特点： 病毒基因组 原核生物基因组 真核生物基因组 人类

7、基因组,1. 病毒基因组,基因组小，基因数少 带有重叠基因 大部分为编码蛋白质的结构基因,HBV基因组,2 原核生物基因与表达特点 细菌基因表达,1） 基因组较小 2） 基因是连续的 3） 没有转录后加工过程 和翻译后加工过程。 4） 转录和翻译偶联，可同时进行。,2. 原核生物基因组,细菌染色质 质粒（plasmid）： 细菌染色体以外的遗传物质，是环状闭合的双链DNA。 可自主复制 编码生物学形状 基因工程常用载体,细菌质粒示意,真核生物基因组,基因组庞大3109bp、染色质、染色体. 基因不连续性 断裂基因、内含子、外显子（大部分基因含有内含子） 含有大量重复序列 非编码区域多于编码区域

8、 非编码区较多 ； 多于编码序列(9:1） 转录和翻译不偶联,人类基因组,细胞核基因组（nucleolus genome) 线粒体基因组(mitochondrial genome),细胞核基因组,人类单倍体基因组 3.2x109 bp ，编码1.5X 106 种蛋白 结构基因仅约3万个，占总基因组的2-3%. 多为单基因序列(60-65% ，如编码蛋白或酶的基因)， 其他为基因间的间隔序列、插入序列、重复序列。 基因家族：来源相同、结构相似、功能相关的基因，如 HLA system A-C-B-D-DR-DQ-DP 基因侧翼的短序列：启动子、增强子、原癌基因等调控序列,线粒体基因组：,人类线粒

9、体DNA (mtDNA)是独立于核染色体以外的基因组，为环状双联DNA。 主要编码与细胞呼吸链代谢相关的蛋白和酶 人类线粒体基因组排列紧凑，有重叠，除mtDNA复制与转录相关的区域外，无内含子。 mtDNA 任何突变均可累及基因组内某些功能区域，近年研究发现，线粒体基因突变与临床某些疾病有关。如肌阵颤性癫间,第一节 基因工程的概念,基因工程（genetic engineering） 基因工程是现代分子生物学技术的重要组成部分, 是20世纪70年代初发展起来的一门新兴技术, 它标志着人类已进入控制遗传形状的新时代. 遗传工程是按照人们预先设计的蓝图，将一种生物的遗传物质绕过有性生殖导入另一种生物

10、中去，使其获得新的遗传性状，形成新的生物类型的基因操作（genetic manipulation）。,广义的遗传工程包括细胞工程和基因工程，狭义的遗传工程就是指基因工程. 基因工程是指将一种或多种生物体 (供体) 的基因或基因组提取出来, 或者人工合成的基因, 按照人们的愿望, 进行严密的设计, 经过体外加工重组, 通过一定的方法, 转移到另一种生物体 (受体) 的细胞内, 使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术.,基因工程(genetic engineering)常和以下名称混用:,基因克隆(gene cloning); 分子克隆(molecular cloning); 基因操作(ge

11、ne manipulation); 重组DNA技术(recombination DNA technique),经典定义,重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。 因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。,根据目的及产物的不同，基因工程分为： 基因克隆：在基因水平上，根据人们的需要以人工的方法取得特定基因，在体外重组于载体DNA分子上，并将重组DNA转入受体细胞进行无性繁殖。 基因表达：在基因水平上，根据人们的需要以人工的方法取得特

12、定基因，在体外重组于载体DNA分子上，并将重组DNA转入受体细胞表达目的蛋白并行使正常功能。,第二节 基因工程的诞生与发展,基因工程诞生的基础 （一）理论上的三大发现 （二）技术上的三大发明 基因工程的诞生 基因工程的发展 （一）基因工程的艰难阶段 （二）基因工程的逐渐成熟阶段 （三）基因工程的迅速发展阶段,（一）理论上的三大发现（1）,DNA是遗传物质 1944 Avery 细菌转化实验 证明：DNA是遗传物质 意义：DNA 可以从一个细菌转移到另一个细菌，从而把遗传性状传递过去。 这项工作是现代生物科学的革命性开端和基因工程的先导（引自诺贝尔奖获得者 Lederberg 之语）。,细菌转化

13、实验,细菌转化实验,细菌转化实验,细菌转化实验,细菌转化实验,（一）理论上的三大发现（2）,DNA双螺旋模型 1953 Watson/Crick 提出了DNA双螺旋结构模型；随后证明了DNA 半保留复制的机理，解决了基因的自我复制和传递的问题； 意义：对生命科学的发展作用可与达尔文学说媲美，与孟德尔定律齐名。从而使遗传学的研究全面进入分子遗传学阶段,DNA双螺旋,脱氧核糖和磷酸基通过酯键交替连接成反向平行的两条主链，它们绕一共同轴心向右盘旋形成双螺旋构型。形成大沟和小沟。 ，螺旋直径2nm；螺旋周期包含10bp；螺距3.4nm；相邻碱基对平面的间距0.34nm。,DNA双螺旋,碱基位于螺旋的内

14、则，它们垂直于螺旋轴。磷酸和戊糖位于外侧，彼此间通过磷酸二酯键连接，形成DNA的骨架，糖环平面与中轴平行。,DNA双螺旋,同一平面的碱基在二条主链间形成碱基对。 A-T、G-C。间以氢键配对。A-T间形成两个氢键，G-C间形成三个氢键。,DNA双螺旋,确定了遗传信息传递的方式 1961 年 Monod 和 Jacob 提出了操纵子学说； 1964 年 Nirenberg 等提出了“三联体密码说”； Crick 提出了遗传信息流向和表达的中心法则 这三大发现大大促进了生命科学的迅速发展，为基因工程的诞生奠定了重要的理论基础,（一）理论上的三大发现（3）,中心法则,密码子表,（二）技术上的三大发明

15、,DNA ligase (glue): 1967 Restriction enzyme (scissors): 1970 Genetic engineering vector: 1973,（二）技术上的三大发明（1）,限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割 分子剪刀和DNA缝合工具，奠定了基因工程诞生的最重要的技术基础。 Smith 和 Wilcox（1970） 在流感嗜血杆菌中分离纯化了 限制性内切酶Hind II； Boyer实验室（1972）发现核酸内切酶Eco RI。,（二）技术上的三大发明（2）,DNA连接酶的发现与DNA片段的连接 1967 发现DNA连接酶 1970 Khorana

16、实验室发现T4噬菌体DNA连接酶 1972 建立双链DNA的连接方法,（二）技术上的三大发明（3）,基因运载工具DNA载体的使用 染色体外的遗传因子 细菌的性因子 F 因子 Lederberg 1946 抗药性因子（R ） 大肠杆菌素因子（COE） 质粒 Cohen 1973,二 基因工程的诞生,第一个重组DNA分子和重组的生物体 1972 P.Berg 美国斯坦福大学 把 SV40 的 DNA 和PhageDNA分别切割，又将两者连在一起，成功地构建了第一个体外重组的人工DNA分子。 1973 Cohen 等将体外重组的分子导入大肠杆菌中，进行无性繁殖，完成了体外 DNA 重组和扩增的全过程

17、。首次克隆转化成功。 1973年为基因工程元年。,三、基因工程的发展,基因工程的艰难阶段 关于基因工程的争议 从1972年到1976年，人们对DNA重组所涉及的载体和受体系统进行了有效的安全性改造，包括噬菌体DNA载体的有条件包装以及受体细胞遗传重组和感染寄生缺陷突变株的筛选，建立了一套严格的DNA重组试验室设计与规范操作。,三、基因工程的发展,基因工程的逐渐成熟阶段 1977年，日本科学家首次在大肠杆菌中克隆并表达了人生长激素释放抑制素基因，首次实现真核基因的原核表达。 随后，美国的Ullvich克隆并在大肠杆菌中表达了人胰岛素基因。 1978年，美国Genentech公司开发出利用重组大肠

18、杆菌合成人胰岛素的生产工艺。,三、基因工程的发展,迅速发展阶段 1982 利用显微注射法培育转基因小鼠 1983 利用农杆菌介导法培育转基因烟草 1990 美国政府批准对一名因腺苷脱氨酶基因缺陷而患有重度联合免疫缺陷症的儿童进行基因工程治疗，获得成功。 1991 人类基因组计划启动 1986-1998，共有4387项转基因植物批准进入田间试验。 1997 克隆羊“多莉”诞生。,克隆羊“多莉”,第三节 基因工程研究的主要内容,基因工程研究的主要内容 基础研究: basic research 克隆载体研究: cloning vector 受体系统的研究: host cell system 目的基因

19、的研究: target gene 生物基因组学的研究: genomic research 应用研究: application,第三节 基因工程研究的主要内容,基因工程的基本操作程序 分离获得目的基因 限制性核酸内切酶将切割外源DNA和载体 DNA连接酶将外源DNA和载体连接，组成重组DNA分子。 将重组DNA分子引入受体细胞 带有重组体的细胞培养扩增，获得大量的细胞繁殖群体 筛选和鉴定转化细胞 进一步研究分析，实现功能蛋白的表达,The four steps in a gene cloning,Generation of DNA fragments,Joining to a vector or

20、 carrier molecule,Introduction into a host cell for amplification,Selection of required sequence,细菌基因工程,第四节 基因工程的意义与发展前景,意义 大规模生产生物分子 设计、构建新物种 搜寻、分离和鉴定生物体尤其是人体内的遗传资源 发展前景,1、基因工程与作物育种,（Antifreeze Proteins AFPs),避免细胞结冰 有助植物抗冻,抗冻糖蛋白,无冰晶细菌帮助草莓抗霜冻,降低原生质冰点,抑制冰晶重结晶,修饰冰晶形态,调节原生质胶体性质,抗虫转基因植物,生长快、肉质好的转基因鱼(中国)

21、,乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷),转黄瓜抗青枯病基因的甜椒,2、基因工程与药物研制,我国生产的部分基因工程疫苗和药物,许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。,微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。,胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。,将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！使其价格降低了30%-50%!,转基因抗乙肝西红

22、柿(中国)，虽然不能治愈乙肝，但一年只吃几个抗乙肝西红柿，就完全能代替注射乙肝疫苗。抗乙肝西红柿属于转基因食品，就是将乙肝疫苗植入西红柿内，经过多代繁殖，使转入的基因稳定化。,用转基因的植物生产药物,基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。,通常一种假单孢杆菌只能分解石油中的一种烃类用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。,科学家还培育出能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDT等毒害物质的细菌。,3、环境污染治理,转基因食品,安全吗?!,转基因植物的安全性争论,支持派认为：如果转基因农业生物技术得不到社会支持，这一研究将被扼杀，并且强调，迄今为止并没有发现

23、转基因食品危害人体健康和环境的确切证据。,美国人食用转基因食品已多年，超级市场上有4000多种商品是含有转基因植物成分的，还没有事例证明人吃了以后会得病，甚至会引起死亡。加拿大、澳大利亚也是转基因食品的生产大国，均有几千万人在吃，到现在为止也没有个案例说明它有问题 。,反对派的观点,一英国科学家声称，转基因马铃薯会减弱老鼠免疫系统功能； 美国康乃尔大学也发现，转基因玉米会危害蝴蝶幼虫及其相关生态环境。,环保团体认为这种违反自然的转基因作物及产品，未经长期安全测试，长期食用可能对人类及生态环境造成负面影响。 尤其是注重环境和生态保护的欧盟国家，对转基因作物更加排斥，因而抵制美国GMO产品的进口。

24、,国外转基因植物产业化现状 植物细胞的全能性为植物的细胞、组织培养及植物基因转化提供了前提条件. 在植物组织培养基础上发展起来的一 系列将外源基因导入植物细胞的遗传转化技术已基本成熟. 植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因, 通过各种方法转移到植物的基因组中,使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状, 如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等.,1983年 世界上第一例转基因植物在美国成功培植, 标志着植物转基因技术的正式诞生. 至今已有35科120多种植物转基因获得成功. 目前, 一个完整的植物基因工程的理论和技术体系已基本建立, 开始走向商业化. 1986年 首批转基因植物被批准进入田间试验, 至今国际上已有30个国家批准千例转基因植