单底物酶促反应

1、第一节动力学方程推导酶反应的基本动力学关系，是指酶反应速度 与酶和底物间的动力学关系。因为酶和底物是 构成酶反应系统最基本的因素，它们决定酶反 应的基本性质、酶反应的速度规律，而其他各 种因素也正是通过它们产生影响的；而且，这 前动另学关系是整个酶反应动力学的基础。描写这种基本动力学关系的是米氏方程 (Michaelis-Menten equation)。V = vmaxS / (Km+S)酶促反应速度的测定与酶的活力单位1、测定酶促反应的速度必需测初速度2、酶活力检测酶含量及存在，很难直接用酶的“量”（质量、体积、浓度）来表示，而常用酶催化某一特定反应的能力来表示酶量， 即用酶的活力表示。酶

2、催化一定化学反应的能力称酶活力，酶活力通常以最适条件 下酶所催化的化学反应的速度来确定。3、酶活力的表示方法4、酶活力测定方法：终点法动力学法酶活力测定方法终点法：酶反应进行到一定时间后终止其反应,再用化学或物理方法测定产物或反应物量的变化。动力学法:连续测定反应过程中产物底物或辅酶的变化量，直接测定出酶反应的初速度。酶活力的表示方法活力单位(active unit) 量度酶催化能力大小习惯单位（u）:底物（或产物）变化量/单位时间国际单位（IU） : lymoL变化量/分钟Ratal （Kat） : lmoL变化量/秒比活力(specific activity )量度酶纯度比活力=总活力单位

3、总蛋白mg数=U(或IU) mg蛋白转换系数（Kcat） 量度转换效率底物（ymoL） /秒每个酶分子各种因素对酶反应速度的影响1、酶浓度当S足够过量，其它条件固定且无不利因素时，v=kE2、底物浓度3、pH:适pH的概念）4、温度（最适温度的概念）III5、激活剂6、抑制剂底物浓度对酶反应速度的影响酶反应速度与底物浓度的关系曲线（Michaelis一Menten 曲线）米氏方程的提出及推导 米氏常数的意义 米氏常数的测定单分子酶促反应的米氏方程及E + S 匕 “ ES _J米氏方程:KnaxMKm+S“ k A + 米氏常数：Km =亠推导原则：从酶被底物饱和的现象出发，按照“稳态平衡”假

4、说的设想进行推导。Substrate concentration SX a(A) A100-9A uoeeH酶反应速度与底物浓度的关系曲线kJS + E ES _P + Ese,-ES_1S1ES生成速度：片二心（耳_ES）S , ES分解速度：v2k_ES+kXES米氏方程的推导当酶反应体系处于恒态时：V, = v2即：和呵-劇嗣*血+刊閉 - 也髦严1=丁 令：k_x +K =Kmk、经整理得：ES心+由于酶促反应速度由ES决定，v将(2)代入(1)得：=*2ES则：k,”es+ess=esESJ即v = k2ES，所以0s=产AC?呵S十业羁A 心+ S心 + s当Et二ES时，v =

5、V将(4)代入(3),贝!所以匕=*2国吆 axS第二节米氏方程的讨论一、米氏方程的特性二、米氏方程中卩和S的关系当v=Vmax时,V与S无关,只和E。成正比,这时 表明酶的活性部分已全部被底物占据。当v=0.5Vmax时, 表示活性部位有一半被占据。当一个酶的已知，则 任何底物浓度下酶活性部位被占据的分数：VSY s VmaxKm+S称为该酶促反应的相对速度。米氏方程所作曲线的曲度，不随的 变化而变化。所以任何酶只要服从米氏方程。贝U 到达任何两个vm分数的对应底物浓度之比为一 常数。例如：0.9 Vmax _ S0.9Vax _ Km+S0.9S.9 =9 Km,同理（S/o./ =1/9

6、 Km,所以：S0_9/S0J = 9Kn/l/9Km =81,即达90%Vmax与达 %Vmax所需底物浓度之比总是刃。同样也可得到达70% 匕皿与达匕远所需底物浓度之比总是2人在酶促反应初速度区即在一级速度区,由于Q/vvK冲,A v=VmaxS/Km=kSo从这个方程可知，一级速度常数 = % /心O的物理意义：底物在单位时间转变成产物的量。 例如Z：=0.02min1,就意味着底物在一分钟内会 有?转变成产物；若=2.3miiyi=0.0383sec J , 那就意味着每秒钟有3.83 %的底物变成产物。 要测定任一时间范围内底物的消耗量或产物的 生成量，可用一级速度方程积分。得：lg

7、S=-Zrt/2.3+ lgSt一级速度方程lg S对t作图第三节实验数据的处理分析酶促反应速度的作图法、Lineweaver-Burk法（双倒数作图法）*想吒将实验所得的一些初速度数据v和S取倒数，得各种 1/v和1/S,将1/v对1/作图，得一直线。该直线纵 截距= 1/Vmax，斜率=Km/Vmax,横截距二 1/Kmo 应用双倒数作图法处理实验数据求KnHVmax等动力学 常数比较方便，也是最广泛应用的一种方法，但欲要 获得较准确的结果，实验时必须注意底物浓度范围， 一般所选底物浓度需在1Woolf-Augustinsson-Hofstee 作图法3.Eadie-Scatchard 作

8、图法将米氏方程重排为线性方程以上三种作图法也应注意选择底物浓度，不要使S比 Kg高得多或低得多。上述几种线性作图法各有其优缺点。双倒数作图 法应用最广泛。但此法有两个缺点：第一，在S 图上，由相等增值而给岀的等距离各点，在双倒数图 上变成非等距离的点，且多数点集中在1/卩轴附近，而 远离1/卩轴的地方只有少数几个点，恰好这些点又正是 主观目测以确定直线最权重的那些点。第二，在测定 时产生的小误差，当取倒数时会放大。在低底物浓度 下更为敏感，因在高1/S值所得的一两个不准确的点, 会给图的斜率带来显著误差。第一个缺点可通过选择 适当的S,使1/S为等距离增值而得到克服。对第二 个缺点关键要注意在

9、低底物浓度下使所测初速度误差 尽可能减小。四、米氏方程的积分形式及其对数据的处理米氏方程是一个微分方程，其v=dP/dt或v=dS/dt。根 据从米氏方程重排得到的线性方程作图求和Vmax时， 在实验过程中所取数据必须限于初速度阶段，即只能是 小于5%的SJ转变为P的阶段。但有些情况，例如，产 物浓度过低难以测定；或产物根本不能直接测定，而必 须测定底物浓度的降低来反映产物的量(即P = St-S)o 若只限于5 %的底物发生反应就难以测准其降低的量。在这些情况下，如用积分速度方程处理，就不受这种限 制。例如，在10%90%的SJ转变为P的数据均可使 用。因为积分方程在反应全过程中都是准确的。

10、最简单 的积分方程是在假定无产物抑制(BPKmsKmp),并且 Keq很大的情况下导出：J：；违严d S kJ：J品一总SVir4Xt= KMpCS St) =2- 3KmlgCSi3 S孕ggj芒甲+蛙计埠舉+走重排成各种线性形式，如t米氏积分方程的一种作图法可直 gWiVmax/Km 和 Jax， 从而可算出K”这样的处理方 法，可从比大几倍的SJ (如 St =10Km)开始，将反应进行 到S显著低于(如=0.1 Km) 止。五、Lee和Wilson改良双倒数方程对数据的处理改良的双倒数方程形式与双倒数方程相似，为R芒嘀+出其中K甲4严 是t这一段时间内的平均速度；幻国 + S为反应过程

11、中底物浓度的算术平均值。由于积分方程对任何反应程度的数据处理都是准确的对比:% d CS=号= o5231g 加 邸 一 SR=从以上计算可以看出，用改良的双倒数方程作图法 处理实验数据时，即使反应已进行到30%,所引入的误 差也不过1%左右。很明显，如果所有酶是饱和的，而且反应显著不可 逆，而且没有产物抑制的情况，用改良双倒数法处理实 验数据来测定Kg和Vx，可获得准确结果。如有必要， 可用捕获剂或偶联酶使产物不断移去，迫使反应不可逆, 并使产物抑制成为最小。第四节酶的分析和检测一、酶促反应初速度随EJ的变化酶促反应的初速度随EJ的变化而变化。通常在离体测 定条件下，印一般为10-1210-

12、7 mol/L,而S为10- 6 iCPmol/L。可将米氏E洱+1这样，当S为常数时，则初速度”与EJ成正比。但一个 酶促反应速度，常因S的改变而改变。因此反应时间必 须尽可能短，使S几乎处于恒态（即只有5%以下的底物 形成产物），才能得到真正的初速度，卩与EJ之间的关系 才会是线性的。二、酶活力单位和比活力 ID是指酶在一定作用条件下，单位时间内，使底物 转化的量或产物生成的量。也就是说，酶量的多少是 采用其催化能力来度量；换句话说，是采用酶催化反 应的速度来度量，因为在适当的条件下，叱E。为了使酶单位的文献报道能统一，并具有可比性， 国际酶学会议曾制订了一个标准单位：在特定条件下, 1分

13、钟内能转化1微摩尔底物所需的酶量为一个酶单位。 所谓特定条件，温度定为25C, pH、底物浓度等其它 条件均定为最适条件。该酶单位称为国际单位IU)。酶制剂中的酶量一般用U/mg或U/ml等表示。 酶的比活力(specific activity)是指每毫克蛋白中所 含的酶单位数，用U/mg蛋白表示。三、酶的转换数m IV转换数可用两种方法表示。其一是以分子活tt(molecular activity)来定义，即在最适条件下、每摩尔酶每分钟所转 变的底物摩尔数(即每微摩尔酶的酶单位数)。其二是许 多酶为寡聚体。含几个亚基，因此可用另一种方式来表 示转换数，即在最适条件下，每摩尔活性亚基或催化中 心每分钟所转变的底物摩尔数。这两个值有时简单以 minH表示，即：知=旳=行跡科=血酶的$值约在50107miiri。碳酸酉干酶是己知转换数最 高的陥之一(36X106miiyi)。1/冷二1.7sec,即该酶一个 催化周期为17微秒。第五节酶促反应的稳态前动力学一、快反应技术酶促反应动力学研究有两条途径:一是稳态动力学。它是监测整个反应，得到关于反应的笼统信息。二是稳态 前动力学，它能更直接地研究整个反应中的基本步骤或 部分反应，提供可