遗传学：12 第十二章（遗传工程）-1

1、第十二章 基因工程,广义生物工程：细胞工程、基因工程、酶工程、发酵工程,第一节 基因工程概述,生物工程（biological engineering） 是指利用工程技术的方法改造和修饰生物体，使其产生新的性状或产品，从而改良生物体的一种遗传学手段。,狭义生物工程：基因工程,基因工程,定义：利用人工的方法把生物的遗传物质在体外进行切割、拼接和重组，获得重组DNA分子，然后导入宿主细胞或个体，使受体的遗传特性得到修饰或改变的过程。,基因工程的特点,1、跨越天然物种屏障，实现动物、植物、微生物间的遗传物质交换。 2、只定向改变一个或少数几个性状，而不改变品种的其他特性。 3、可以人为控制基因的表达。

2、,植物表达载体的构建,转化植物细胞,筛选抗生素抗性细胞,再生抗性植株,整合PCR, Southern杂交, 原位杂交,转录RT-PCR, 定量PCR, Northern杂交,翻译Western杂交,生物检测,遗传分析,基本技术流程：,目的基因克隆,第二节 基因的分离,基因克隆通常包括三个步骤： 1）目标DNA片段（基因）的分离； 2）目标基因克隆到载体上； 3）载体导入宿主细胞并在其中大量复制。,一、工具酶,（一）限制性核酸内切酶（限制性酶）（restriction enzyme） 在识别双链DNA分子中某些特定核苷酸序列的基础，切割DNA双链的内切酶。,细菌（宿主）本身的DNA通过甲基化酶的

3、作用，使DNA得到修饰，免遭自身限制性内切酶的破坏。,细菌细胞具有防御异源遗传物质（病毒）的进入的能力，异源DNA分子进入后，会被限制酶识别并降解，这个过程称为限制。,限制修饰系统：,型限制性内切酶： 酶切部位有特异性，能识别DNA分子上特定的DNA序列。,型限制性内切酶： 酶切部位没有特异性，随机切割双链DNA分子。EcoB和EcoK,型限制性内切核酸酶（型酶） 具有特异的识别位点，这种识别位点是非对称的。,三种限制性内切酶,型酶有几个基本特性, 在DNA分子上有特异识别和切割的序列部位，使被切割的DNA分子形成单链的断裂； DNA分子上两个单链断裂的部位通常不是直接相对的； 断裂结果所形成

4、的DNA片段常具有碱基互补的单链尾巴（粘性末端），使其能够重新连接； 内切酶的切割和修饰功能由两个不同的酶催化所完成，即该类内切酶活性和甲基化作用活性是分开的，只需要Mg2+来激活，不需要ATP辅助因子。,表12-1 不同限制酶的识别、切割和修饰位点,echo-r-one,回纹对称序列,（二）DNA连接酶,能催化DNA中相邻的 3 OH和5 磷酸基 末端之间形成磷酸二酯 键并把两段DNA连接起 来。,在分子克隆中使用的DNA连接酶有两种。 即大肠杆菌DNA连接酶和T4 DNA连接酶。 两种DNA连接酶都不能催化单链DNA之间的连接反应，被连接的DNA链必须是双链DNA分子的一部分。 T4 DN

5、A连接酶还可以催化二个具有平齐末端的双链DNA片段之间的连接反应，而大肠杆菌连接酶一般不具有这种活性。,（三）反转录酶,反转录酶（reverse transcriptase）是一类以RNA为模板来指导DNA合成的DNA聚合酶，所以又称为依赖于RNA的DNA聚合酶。,反转录酶在遗传工程中的主要用途是以mRNA为模板合成cDNA 。,cDNA文库代表的是某一特定细胞，或组织，或某一发育阶段的表达的基因，而基因组文库代表的是基因组中所有的基因。,（四）聚合酶链式反应,聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR） PCR反应在一种混合液中进行（PCR mixture）包

6、括四种主要成分：两个引物（一般为20 bp）；模板DNA；热稳定的DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸。 聚合酶是Taq酶（AmpliTaq polymerase，在95甚至更高的温度下活性稳定）。,PCR反应已经自动化，在PCR仪（thermocycler）上进行。 基本过程： 通过高温，双链DNA变成单链DNA变性； 通过降低温度，使引物和摸板配对退火; 利用耐热DNA聚合酶,合成产物DNA延伸。 变性温度：93-94 ， 30-60秒 退火温度：36-60 , 30-60秒 延伸温度：72 , 1.5-2分 循环30-40次; 最后72 补齐10分钟。,表12-2 PCR循环数与PCR产物的拷贝

7、数之间的关系,图12-6 在紫外灯下观察到的琼脂糖凝胶电泳后的DNA条带,二、载体(vector),（一）重组DNA技术 重组DNA（recombinant DNA）主要指利用不同生物来源的DNA分子拼接的杂种DNA分子，是自然界中不存在的DNA分子。,重组DNA的步骤,（1）从细胞或组织获得DNA并纯化； （2）用限制酶切割DNA； （3）将获得的限制片段连接到载体上。 （4）重组DNA导入宿主细胞，在宿主细胞内重组DNA分子复制，产生大量相同拷贝的重组DNA分子，称为克隆； （5）克隆的DNA分子可以从宿主细胞中回收，纯化； （6）克隆的DNA可以转录和翻译，其产品可以被分离出来用于研究或

8、商业开发。,图12-5 重组DNA技术流程,（二）载体(vector),作为载体DNA分子，必须储备的4个条件：,（1）具有复制原点，在宿主细胞中不仅能独立地自我复制，而且能带动携带的外源基因一起复制。,（2）具有多克隆位点，即具有多种限制性酶切位点，且每一种酶的切点只有一个。,（3）至少具有一个选择标记基因。如抗菌素的抗性基因或某种酶的基因。,（4） 分子量小，多拷贝，易于操作。,1、质粒载体,质粒：细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子。,外源DNA片段小于10kb,图12-8 质粒PUC18的结构及多克隆位点,互补： 互补是指大肠杆菌-半乳糖

9、苷酶的两个无活性片段组合成为功能完整的酶的过程。受体片段：酶的C端片段，一般存在于宿主细胞。 供体片段：酶的N端片段，一般存在于质粒载体。 供体片段+受体片段 有活性,质粒载体含有 LacZ基因的N端编码序列，在编码区含有多克隆位点，不影响酶的活性，选择含有-半乳糖苷酶C端片段的宿主细胞。 在含有X-gal（5-溴-4-氢-3-吲哚- D-半乳糖苷）的培养基中形成兰色菌落，但如果外源DNA插入到多克隆位点，将绝对地产生不具有互补功能的N端片段产生，菌斑为白色。,图12-6重组质粒的蓝白斑筛选,2、病毒载体,噬菌体载体可以接受1523kb的外源DNA片段,图12-10利用噬菌体为载体克隆外源DN

10、A的策略,3、克隆大片段DNA的载体,黏粒载体、细菌人工染色体和酵母人工染色体载体 。,图12-11黏粒载体pJB8图谱,黏粒载体（cosmid）柯斯质粒,噬菌体DNA包装成功噬菌体时所必需的。,质粒的复制原点,可以接受1545kb的外源DNA,细菌人工染色体（BAC）,可以克隆300kb左右片段,酵母人工染色体（YAC）,YAC载体可以插入大片段的DNA（1-2Mb）,三、基因的分离,（一）从基因文库中分离基因 基因文库：是由单一来源的特定组织或器官的DNA或cDNA片段汇总形成的克隆群体。,1、基因库的构建 基因组文库：全部基因组DNA酶切后与载体连接构建而成的一个重组DNA群体 。,cD

11、NA文库：是以mRNA为模板，在反转录酶的作用下，合成互补DNA（cDNA），将获得的双链cDNA与适当载体连接并转化到宿主细胞内进行扩增，而构建成的基因库。,cDNA文库与基因组文库的不同,基因组文库代表了基因组中的所有基因，而cDNA文库仅代表某一特定细胞类型，某一组织，或某一胚胎发育时期的表达序列。,2从基因库中分离特定的克隆序列(基因),（1） DNA探针 探针是待筛选的目的基因或克隆的一段互补的核酸序列。利用DNA探针可以从基因库中筛选特定的克隆 通常探针用同位素标记，但也可使用荧光标记或颜色反应标记探针。探针可以有多种来源，如果筛选植物基因，探针可以来源于植物本身，也可以来源于异源

12、植物、动物中的同类基因的保守序列。,(2) 筛选文库,（3）阳性克隆的分析与鉴定,从文库中筛选获得目标克隆后，只有进行测序才能进行生物信息分析和功能预测。，确定测定的核酸序列是不是所需要的基因，采用适当的软件预测它具有什么功能。,（二）T-DNA标签克隆基因,T-DNA 载体构建,转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子,筛选T2，获突变子，应为3:1分离,确定T-DNA与突变型共分离的个体,产生纯合后代,克隆T-DNA两侧的植物DNA（Plasmid rescue; IPCR; Tail PCR),利用侧翼DNA序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因,基因功能的验证,（三）PCR扩

13、增基因,（四）人工合成基因,第三节 外源基因的导入,一、重组DNA导入原核生物 1CaCl2处理转化： 将细菌细胞用冰上预冷的CaCl2处理，然后转移到42的条件下处理90秒。CaCl2处理转化的机制尚不清楚，可能是CaCl2处理破坏了细菌的细胞壁，使游离的DNA分子被摄入受体细胞。转化频率大概是千分之一。,2电激转化（electroporation） 是目前常用的一种转化方式。在电转化仪施加的强电场的作用下，使受体细胞细胞壁具有可逆的电穿孔，以使DNA分子进入细胞。进行电转化操作时，细菌细胞和DNA分子放在带有电极的小室中，通过小室（chamber）施加电脉冲，使细胞壁穿孔，然后DNA分子进

14、入细胞。电转化的频率通常是10-610-9，因质粒的大小而异。,3结合（conjugation）结合是原核生物细胞与细胞接触而进行遗传物质转移的一种自然过程。,二、植物表达载体,作为植物基因转化的载体，必须具有两种功能： （1）能作为媒介将外源基因导入到植物细胞中去，并且整合到宿主细胞的基因组DNA上； （2）能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识别的DNA序列，即启动子和复制子起始位点，以保证转化的外源基因能在植物细胞中进行复制和表达。,Ti质粒,Ti质粒是根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，约有150200kb。

15、,各种不同类型的Ti质粒都具有T-DNA区、毒性区、质粒复制起点、质粒结合转移位点和冠瘿碱分解位点(图12-13)。其中以T-DNA区和毒性区在植物转化中最为重要。,T-DNA两端各有一段25bp的重复序列（分别称为左边界序列和右边界序列）。 T-DNA携带的致瘤基因实际上就是一些与激素合成有关的基因，称为致瘤基因，T-DNA的右端序列对T-DNA转移到植物细胞内具有重要意义。保留T-DNA两端的末端序列，然后用一段外源DNA插入或直接取代野生型T-DNA的部分基因可以使植物细胞的致瘤基因除去，从而导致转化的植物细胞不具有成瘤能力。,T-DNA(转移DNA): 是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质

16、粒上导入植物细胞的一段DNA。,Vir区段总长度大约35kb，由7个互补群组成，分别命名为VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG和VirH。毒性区中各个位点的表达情况可以分为两种：一种是组成型表达，即在无植物诱导分子存在下依然保持一定的表达水平；另一种是植物诱导型表达，即这些基因的表达必须在土壤农杆菌感染植物受伤组织时，植物细胞分泌的信号分子作用下才能启动表达。,Vir区段上的基因与T-DNA从细菌转移到植物细胞的遗传过程有关，区段上的基因能够使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。,三、外源基因导入植物,非生物载体介导的遗传转化:种质转化系统和直接转化系统。 种质转化系统是以

17、植物自身的生殖系统种质细胞为受体进行的转化，如花粉浸泡外源DNA、DNA注射受粉后的子房等； 直接转化是采用物理或化学方法直接将外源基因导入受体细胞，如基因枪法等。,高等植物基因遗传转化的方法可以划分为两类：一类是非生物载体介导的遗传转化，另一类是生物载体介导的遗传转化,三、外源基因导入植物,（一）农杆菌介导法,1、农杆菌介导的遗传转化需要具备的条件,（1）高效的植株再生体系; （2）受体植物细胞对农杆菌要有很高的亲和力。一般认为受体细胞应处于高度的分裂状态，只有处于分裂期的细胞，在DNA的复制过程中，T-DNA才能插入植物基因组； （3）应具有有效的选择系统。必须有一个理想的选择方法将转化细

18、胞从非转化细胞中选择出来，得到转基因细胞系，才能保证获得转基因植株； （4）稳定的转化技术和基因表达。,2、转化方法,4. 抗性愈伤分化成胚状体,3、选择系统 抗生素抗性基因，如NPTII基因（新霉素磷酸转移酶基因），能分解卡那霉素等抗生素。 其它选择标记基因，如抗除草剂基因，报告基因如：GUS基因(-葡糖苷酸酶基因) 、GFP基因等。,4影响转化的因素 农杆菌介导的遗传转化有严格的寄主限制，双子叶植物比单子叶植物容易转化。 同一种植物不同的基因型转化效率也会有所不同。农杆菌菌株、菌液浓度、植物材料的生理状态、预培养处理等都对转化效率有影响。大量的研究表明，在培养农杆菌或共培养时，培养基中加入

19、微量的乙酰丁香酮（acetosyringone）能明显提高转化效率。,农杆菌介导法转移的外源基因优点：与受体基因组整合有一定的方向性，大多数是单位点整合，整合的外源基因基本保持其完整性。,（二）基因枪介导的遗传转化,基因枪法（gene gun），又称生物弹法或微粒枪法、微粒轰击法，是依赖高速的金属微粒将外源基因导入活细胞的一种转化技术。,优点：无宿主限制，可以对任何基因型材料进行转化研究。对于不能通过体细胞再生植株的基因型，可以通过基因枪轰击茎尖实现基因转化，是一种非基因型依赖型的转化技术； 靶受体类型十分广泛，几乎包括所有具有潜在分化能力的组织或细胞； 易于操作。 缺点：转化的外源基因以多拷

20、贝居多易导致基因沉默，实验成本较高等。,基因枪转化原理 基因枪转化前(A)及转化后(B)的主要部分示意图,第四节 转基因生物的检测与鉴定,一、 分子检测 1、PCR检测,图12-16 转基因棉花选择标记基因NPTII编码区段的PCR扩增结果（M为分子量标准，C为非转基因植株，P为质粒对照，1-20为转基因植株）,2、Southern杂交,图12-20转基因棉花的Southern杂交检测（M为分子量标准，1为阳性对照，2为阴性对照，3-8为转基因植株）,3、Northern杂交,4、Western杂交,二、生物学性状鉴定,图12-18 转基因棉花饲喂棉铃虫时被食用情况（左图为转基因抗虫棉，右图为

21、非转基因棉）,第五节 基因工程的应用,一、基因工程的应用 1、基因工程是生物科学基础研究的重要手段 2、利用基因工程改良植物 转基因抗虫作物与抗除草剂作物 ：自从1996年转基因作物在生产上使用以来，转基因作物的面积迅速扩大，2003年转基因抗虫和抗除草剂的作物分别达到1000万和5000万公顷左右。美国的转基因棉花达到总播种面积的80%左右，全球的转基因棉花已达到50%的面积。,改善植物品质和抗逆性,全世界每年都有超过50万的儿童因为缺乏维生素A而导致完全或不完全失明，传统的耕作方式并不能提高农作物的维生素含量，每年发达国家都投入巨额资金来开展有关的研究计划。新的转基因稻米品种富含维生素A。

22、经过多年的研究，科学家已经把分离出的三种功能基因（两种来源于水仙花，一种来源于微生物体）嫁接到稻谷中，经过基因修饰的稻谷体内能合成大量的维生素前体胡萝卜素,而且还拥有一个漂亮的外表：它的果实呈金黄色。这种“黄金”水稻对解决热带地区儿童的维生素缺乏症意义尤为重大。,4、基因工程工业,（1）利用转基因植物生产药物 生物制药改变了传统制药的原料、工艺和生产方式，使产值效应呈指数增长。生物药多为人体功能物质，例如治疗侏儒症的人生长素，常规方法是从脑下垂体提取，治疗一个病人需50具尸体；糖尿病的特效药胰岛素是从牛或猪的胰腺中提取，100原料只生产4-9g，一位患者就需40-50头猪的胰脏。随着基因表达调控研究的深入，利用植物为生物反应器来产生蛋白类药物和疫苗，可以提高产量而且大大降低生产成本。,3、利用基因工程改良动物,克隆动物的成功（1997年克隆羊多利的诞生