园艺生物技术复习题及答案

1、植物组织培养部分基本原理1、简述植物组织培养的理论依据？植物组织培养的理论依据是细胞全能性学说，即植物体的每一个细胞都携带有一套完整的基因组，并具有发育成为完整植株的潜在能力。 2、植物组织培养有哪些特点？（1）培养条件可以人为控制：组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基质和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。（2）生长周期短，繁殖率高：植物组织培养由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比较小，往往2030d为一个周期。

2、所以，虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗（3）管理方便，利于工厂化生产和自动化控制：植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，既利于高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫害等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地3、培养基的种类？（1） 根据态相不同：固体培养基、液体培养基（2） 根据培养物培养过程：初代培养基、继代培养基（3） 根据

3、作用不同：诱导培养基、分化培养基、生根培养基（4） 根据营养水平：基本培养基、完全培养基、改良培养基。4、植物组织培养主要应用于哪些方面？（1）快速繁殖 运用组织培养的途径，一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株（2）种苗脱毒 针对病毒对农作物造成的严重危害，通过组织培养可以有效地培育出大量的无病毒种苗（3）远缘杂交 利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，从而育成一些罕见的新物种（4）突变育种 采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种（5）基因工程 主要研究DNA的转导，而基因转导后必须通过组织培养途径才能实现植株再生（6）生物制品 有些极其昂贵的

4、生物制品，如抗癌首选药物-紫杉醇等，可以用大规模培养植物细胞来直接生产5、固体培养基与液体培养基相比有何特点？优点:操作简便，通气问题易于解决，便于经常观察研究.缺点:培养物与培养基的接触(即吸收)面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分的充分利用，同时培养物排出的一些代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。6、论述植物生长调节物质在组织培养中的作用？ 并列举常见的种类(1) 生长素类：主要被用于诱导愈伤组织形成，促进细胞脱分化；促进细胞伸长；诱导根的分化，促进生根(2) IAA（吲哚乙酸） ；NAA(萘乙酸)；IBA(吲哚丁酸)； 2,4D(2,4二氯苯氧乙酸)(3）细胞分裂素类：

5、诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。促进细胞分裂与扩大。抑制根的分化。抑制衰老，减少叶绿素分解，有保鲜效果。包括6BA(6苄基腺嘌呤)、Kt ( 激动素)、Zt (玉米素)等。7、与常规苗相比，试管苗具有哪些特点？(1)生长细弱；(2)光合作用差(3)叶片气孔数目少，活性差(4)根的吸收功能弱(5)对逆境的适应和抵抗能力差8、简述原生质体作为遗传操作和生理生化研究的材料有何特点？（1）没有细胞壁，有利于体细胞融合、体细胞杂交、基因转移和单细胞培养。（2）原生质体能比较容易摄取外来的遗传物质。基本概念1、植物组织培养(plant tissue culture)：是指用无菌方法使植物体的离体器官、组织和

6、细胞在人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称，也叫植物克隆。亦称为离体培养或试管培养。2、脱分化（dedifferentiation）：将已分化组织的已停止分裂的细胞从植物体的抑制性影响下解脱出来，恢复细胞的分裂活性。一个成熟的细胞转变为分生状态的过程叫脱分化。3、再分化（redifferentiation）：经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可转变为各种不同的细胞类型，形成完整植株的过程。4、外植体(explant)：由活体（in vivo)植物体上切取下来的，用于组织培养的各种接种材料。包括各种器官、组织、细胞或原生质体等5、愈伤组织(callus)：在人工培养基上由外植体上形

7、成的一团无序生长状态的薄壁细胞。6、器官发生(organ genesis)：由愈伤组织或外植体诱导形成不定根或不定芽，再获得再生植株的方法。7、胚状体发生(embryo genesis)：是指在组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期），形成具有双极性的胚状结构，而发育成再生植株的途径。8、细胞全能性（cell totipotency）：即植物体的每一个细胞都携带有一套完整的基因组，并具有发育成为完整植株的潜在能力。9、母液（mother liquid）：是欲配制液的浓缩液。配成比所需浓度高10-100倍。母液配制时可分别配成

8、大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。好处: 保证各物质成分的准确性 配制时的快速移取便于低温保藏。10、褐变 (brown change)：是指外植体在培养中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，有时使整个培养基变褐，从而抑制其他酶的活性，影响材料的培养。11、玻璃化现象（vitrification phenomenon）：在长期的离体培养繁殖时，有些试管苗的嫩茎、叶片呈现半透明水渍状，这种现象称为玻璃化。12、消毒（disinfection ）：指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用。13、灭菌(sterilization)：是指用物理或化

9、学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。14、接种(inoculation)：在无菌条件下，用灼烧过的镊子将外植体放到培养基上的操作过程。15、愈伤组织培养(callus culture):是指将母体植株上的外植体，接种到无菌的培养基上，进行愈伤组织诱导、生长和发育的一门技术。16、继代培养 (subculture)：愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养。这个过程叫做继代培养17、形态建成（organogenesis）：外植体在适宜的培养条件下经脱分化、再分化形成不定根（adven

10、titious roots）、不定芽（adventitious shoots）或直接发育成形态完整的植物体的过程。18、体细胞胚（somatic embryo）又称胚状体（embryoid）：指在组织培养中，由一个非合子细胞(体细胞)，经过胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期），形成的具有双极性的胚状结构。19、快速繁殖(微繁殖) (micropropagation)： 用组织培养的方法，使植物的部分器官、组织迅速扩大培养，并移植到温室或农田繁殖出大量幼苗的繁殖方法。20、原生质体融合(protoplast fusion)也称体细胞杂交（somatic hy

11、bridization）：就是使分离下来的不同亲本的原生质体，在离体条件下通过诱导发生的质膜融合进而细胞核融合，像性细胞受精作用那样互相融合成一体的现象。21、原生质体（protoplast）：是指除去了细胞壁后的裸露的植物细胞。22、无病毒苗（virus-free plantlets）：是指不含该种植物的主要危害病毒，即经检测主要病毒在植物内的存在表现阴性反应的苗木。 基本方法1、一般组织培养的操作工序：（1）、培养器皿的清洗；（2）、培养基的配制、分装和高压灭菌；（3）、无菌操作材料的表面灭菌和接种；（4）、将培养物放到培养室培养；（5）、试管苗的驯化、移栽和初期管理。2、常用的培养基有哪

12、些？说明其特点 (1）MS培养基：1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。是目前应用最广泛的培养基。特点是无机盐离子浓度较高(2) hite培养基：无机机盐浓度较低，适于生根培养。(3)N6培养基： KNO3和（NH4）2SO4含量高，不含钼。广泛应用于禾谷类植物的花粉和花药培养。(4）B5培养基：主要特点是含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。适宜双子叶植物特别是木本植物的培养(5) M8P培养基：为原生质体培养而设计的。其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素 3、植物组织培养技术主要包括哪些环节？各环节的主要工作内容？ （1）培养基的配制及灭菌（2

13、）外植体的选择及灭菌（3）外植体的接种及培养（4）试管苗的驯化与移栽4、组织培养中常用的灭菌方法？n分为物理的和化学的两类，（1）物理方法如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤和大量无菌水冲洗等措施；（2）化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。5、怎样进行培养基的高压湿热灭菌?方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到49kPa时，打开放气阀，放出空气（注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底），待压力表指针归零后，再关闭放气阀。当压力表上升达到108kPa时，锅内温度达121

14、（在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢），维持20-30min。6、如何对外植体进行表面消毒？(1) 将需要的材料用水洗干净。(2) 表面灭菌：用70%酒精浸30-60s左右。(3) 灭菌剂处理：0.1%升汞10分钟、或在10%漂白粉上清液中浸泡10-15分钟。(4) 用无菌水冲洗3-5次左右7、在植物组织培养中，通过哪些途径可以得到完整的植株？(1) 外植体愈伤组织根、芽试管苗同时长芽和根先长芽，再长根先长根，再长芽(2) 外植体胚状体试管苗(3) 外植体根、芽试管苗。8、简述愈伤组织培养在园艺植物育种中的应用（1）、加快了园艺植物新品种和良种繁育速度；（2）、培育无病毒苗

15、木；（3）、获得倍性不同的植株；（4）、克服远缘杂交困难；（5）、利于种质资源长期保存和远距离运输；（6）、提供育种中间材料；（7）、诱发和离体筛选突变体；（8）、制造人工种子。9、植物脱毒的主要方法有哪些？其主要原理是什么？（1）茎尖培养脱毒：病毒在植物体内的分布并不均匀，越靠近茎端的病毒的感染深度越低，生长点则几乎不含或含病毒很少（2）愈伤组织培养脱毒法：通过植物的器官和组织的培养，脱分化诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株，可以得到无病毒苗（3）珠心胚培养脱毒：病毒一般不通过种子传播，由珠心细胞发育成的胚再生的植株是无毒的，并具有与母本相同的遗传特性。（4）茎尖微体嫁

16、接：将实生苗砧木在人工培养基上种植培育，再从成年无病树枝上切取0.41.0mm茎尖，在砧木上进行试管微体嫁接，以获得无病毒幼苗。（5）花药培养脱毒（6）热处理脱毒：一些病毒对热不稳定，在高于常温的温度下（35-40），即钝化失活（7）化学处理：抑制或杀死病毒综合能力1、无菌操作时应注意哪些事项？(1) 在接种4h前用甲醛熏蒸接种室；(2) 在接种前15-20min，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯；(3) 接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等；(4) 上工作台后，用酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。然后70%酒精喷雾降尘，并擦拭工作台面；(5) 接种工具蘸95%酒精，灼烧；

17、(6) 接种时将试管斜着，使试管口在酒精灯火焰上转动，灼烧数秒钟。接完种后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟。(7) 接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；(8) 接种完毕后要清理干净并用酒精擦工作台。2、论述离体培养可能出现的异常现象及防止措施？（1）污染：污染原因从病源分面主要有细菌和真菌和两大类。预防措施：(1)减少或防止材料带菌(2)外植体灭菌要彻底(3)玻璃器皿和金属器皿的灭菌 (4)布质制品的灭菌(5)无菌室的消毒(6)操作人员一定要严格按照无菌操作的程序进行接种。（2）、褐变：防止的措施有 ：选择适宜的外植体及最佳培养基、连续转移、加抗氧化剂、加活性剂。（3）、玻璃

18、化现象，预防措施：适当控制培养基中无机营养成分；适当提高培养基中蔗糖和琼脂浓度；适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度，增加生长素量；增加自然光照，控制光照时间；控制好培养温度；增加容器通风，最好进行CO2施肥3、如何提高试管苗移栽的成活率？（1）试管苗的生理状况 应选择壮苗，以提高移栽后的成活率 （2）加入植物生长调节物质 如生长素 （3）降低无机盐的浓度 （4）加入少量活性炭，尤其是用酸、碱和有机溶剂洗过的活性炭 （5）环境因子 适当的环境条件能提高移栽的成活率（6）移栽过程中让试管苗从无菌向有菌逐渐过渡4、愈伤组织的形态发生有哪些情况？（1）愈伤组织仅有根或芽器官的分别形成，即无根的芽或无芽的根

19、；（2）先形成芽，再在芽伸长后，在其茎的基部长出根而形成小植株，多数植物属这种情况；（3）先产生根，再从根基部分化出芽而形成小植株。这种情况较难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物；（4）先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株小植株。少见。5、试管苗的生根培养时应注意哪些方面？（1）用无机盐浓度低的 White及12，13或14 MS、B5培养基（2）适当加大生长素-NAA的浓度，不用或少用细胞分裂素。也可在无激素的培养基上生根。 （3）降低蔗糖的浓度到1.0-1.5%，以增强植株的自养能力。（4）加入1%左右的活性碳；以免培养基过硬（5）将光强度增加到3000-100

20、00lux，以提高小植株的光合能力（6）光周期可用24小时光照或16小时，8小时黑暗以利于形态建成。6、如何纯化分离的植物原生质体并鉴定其活力？(1) 原生质体的纯化离心沉淀法：应用原生质体的比重大于溶液的性质而使原生质体沉于底部。漂浮法：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮于液体表面。界面法：选用两种不同渗透浓度的溶液，使原生质体介于两种溶液之间。(2) 原生质体活力的测定形态识别：形态上完整，呈圆形，含有饱满的细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。染色识别1）0.1%酚番红或Evans蓝染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。2）双醋酸盐荧光素(FDA)染色法：在荧光显微镜下有荧光的即

21、为有活性的原生质体。7、原生质体培养的方法有哪些？ （1）液体浅层培养 （2）平板法培养 （3）悬滴法培养 （4）双层培养法 （5）饲喂层培养8、原生质体融合有哪几种主要方法？（1）化学法诱导融合：硝酸盐溶液（2）PEG结合高钙-高pH诱导法：具体做法：在无菌条件下混合双亲原生质体-滴加PEG溶液，摇匀，静置-滴加高钙高pH溶液，摇匀，静置-滴加原生质体培养液洗涤数次-离心获得原生质体细胞团-筛选-再生杂合细胞。（3）电融合技术：将双亲原生质体悬浮溶液混合后插入微电极，接通一定的交变电场，原生质体极化后顺着电场排列成珠状，此时施与适当强度的电脉冲，使原生质体膜被击穿而发生融合。9、目前鉴定脱毒

22、苗的方法有哪些？各有何特点？（1）直接检测法：直接观察脱毒植株生长状态是否异常，茎叶上有无特定病毒引起的可见症状。（2）指示植物法：将一些对病毒反应敏感、症状特征显著的植物作为指示植物（又称鉴别寄主），利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的方法。这种方法条件简单，操作方便，为一种经济而有效的鉴定方法（3）抗血清鉴定法：用已知抗血清鉴定未知病毒的种类。这种方法特异性高，测定速度快。所以抗血清法成为植物病毒鉴定中最有用的方法之一。 （4）分子生物学鉴定法：双链RNA法(dsRNA)：受RNA病毒侵染的植物，有病毒的双链RNA(dsRNA)存在；健康植株则无。互补DNA(cDNA)检测法：

23、用人工合成的能与病毒碱基互补DNA，作为探针，与从待测植物中提取RNA进行DNA-RNA分子杂交。有荧光标记的证明有病毒存在（5）电镜检查法：可以直接观察病毒，检查出有无病毒存在，了解病毒颗粒的大小、形状和结构，又可以鉴定病毒的种类。优点是方法先进、灵敏度高、能在植物粗提取液中定量测定病毒。但需一定的设备和技术。基因工程部分基本概念1、基因：能够表达和产生蛋白质和RNA的DNA序列，是决定遗传性状的功能单位。2、基因组：细胞或生物体的一套完整单倍体的遗传物质的总和。3、基因工程：有目的的通过分子克隆技术，人为的操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程。4、转化：指质粒DNA或以它为载体构建的重

24、组DNA导入细菌的过程。5、感染：以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。6、转导：指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程，有时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和获得细胞DNA的过程。7、转染：指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。8、DNA变性：在物理或化学因素的作用下，导致两条DNA链之间的氢键断裂，而核酸分子中的所有共价键则不受影响。9、 DNA复性：当促使变性的因素解除后，两条DNA链又可以通过碱基互补配对结合形成DNA双螺旋结构。10、分子克隆：在体外对DNA分子

25、按照即定目的和方案进行人工重组，将重组分子导入合适宿主，使其在宿主中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。11、RFLP：即限制性片段长度多态性，个体之间DNA的核苷酸序列存在差异，称为DNA多态性。若因此而改变了限制性内切酶的酶切位点则可导致相应的限制性片段的长度和数量发生变化，称为RFLP。12、PCR技术： 聚合酶链反应，它是一种模拟天然DNA复制过程，在有DNA模板、DNA聚合酶（Taq酶）、RNA引物和四种dNTP的情况下，通过高温变性（9095，12min）,低温退火（2537，12min）,中温延伸（6075，90 sec-5min）,这样反复循环的过程中，在体外扩增特异性D

26、NA片段的分子生物学技术。13、RT-PCR：反转录 PCR ，先将mRNA反转录成cDNA，然后再以cDNA为模板，用PCR方法加以扩增。14、同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。15、克隆载体：为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。16、表达载体：为使插入的外源DNA序列可转录翻译成肽链而特意设计的载体称为表达载体。17、质粒：细菌细胞质中独立于细菌染色体之外能自主地进行复制的遗传单位。18、染色体组性：染色体组型是指生物体细胞所有可测定的染色体特征总称。包括染色体总数、染色体组数、每条染色体大小和形态、着丝

27、点的位置等。19、带型：用染色体分带技术体所产生的明显的染色带（暗带）和未染色的明带相间的带纹，使染色体呈现鲜明的个体性的技术。20、RAPD：随机引物扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）是在PCR技术的基础上，以一系列不同的，随机排列的寡聚核苷酸单链为引物，与变性后的模板链退火，在DNA聚合酶的作用下，合成一段新的互补DNA链。21、卫星DNA：真核生物基因组酶切、离心后，在主带附近会出现（AT）含量很高的简单高度重复序列。22、AFLP：扩增片段长度多态性Amplified fragment length polymorphism（

28、AFLP）是在随机扩增多态性（RAPD）和限制性片段长度多态性（RFLP）技术上发展起来的DNA 多态性检测技术。23、基因芯片技术：是指通过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。24、 Southern印迹杂交：是根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与已标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用以检测这些被转移的DNA片段的技术。25、Northern印

29、迹杂交：指将RNA分子变性及电泳分离后、从电泳凝胶转移到固相支持物上进行核酸杂交的方法又称为Northern RNA印迹杂交等。 26、限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)：是识别DNA的特异序列(48bp), 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。基本技术1、介绍限制性内切酶的切割方式限制性内切酶的切割方式有三种类型分别是（在对称轴5 侧切割产生5 粘端 ）、（在对称轴3 侧切割产生3 粘端（在对称轴处切割产生平段）。2、列举基因工程常用工具类工 具 酶功 能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5磷酸基和3羟

30、基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶 合成双链cDNA分子或片段连接 缺口平移制作高比活探针 DNA序列分析 填补3末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等反转录酶 合成cDNA 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基3、简介目的基因获取方法. 化学合成法：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列

31、 。.基因组DNA文库(genomic DNA library). cDNA文库(cDNA library). 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 4、探针的标记法？答：、缺口平移法：此法是利用适当浓度的DNase 在DNA双链上随机切割单链，造成单链切口。切口处产生一个5末端和3末端，3末端就可以作为引物，在大肠杆菌DNA聚合酶的催化下，以互补的DNA单链为摸板，依次将dNTP连接到切口的3末端的羟基上，合成新的DNA单链；同时DNA聚合酶的53的核酸外切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除，新合成链不断延伸，从而使原DNA分子上的部分核苷酸残基被标

32、记的核苷酸所取代。、随机引物法：随机引物是人工合成的长度为6个寡核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物。对于任何一个用作探针的DNA片段，随机引物混合物中都会有一些六核苷酸片段可以与之结合，起到DNA合成引物的作用。将这些引物与变性的DNA单链结合后，以4种dNTP（其中一种是标记物标记的dNTP）为底物，合成与探针DNA互补的切带有标记物的DNA探针。、PCR标记法：在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标记物标记的dNTP， 这样标记的dNTP就在PCR反应的同时掺入到新合成的DNA链上。、末端标记法：只是将DNA片段的一端进行标记。5、分子克隆中常用的工具酶及良好载体的条件？答：（1）、常用

33、的工具酶、 限制性核酸内切酶：是细菌产生的一类能识别和切割双链DNA分子内特定的碱基顺序的核酸水解酶。、 DNA连接酶：将两段DNA分子拼接起来的酶。、 DNA聚合酶：催化单核苷酸链延伸。、 逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶，这是一种有效的转录RNA成为DNA的酶，产物DNA又称互补DNA。、 末端脱氧核糖核酸转移酶：将脱氧核糖核酸加到DNA的3末端。、 碱性磷酸酶：催化去除DNA、RNA等的5磷酸基团。、 依赖DNA的RNA聚合酶：识别特异性启动子，RNA转录。（2）、良好载体的条件、必须有自身的复制子；、载体分子上必须有限制性核酸内切酶的酶切位点，即多克隆位点，以供外源DNA插入；、载

34、体应具有可供选择的遗传标志，以区别阳性重组子和阴性重组子；、载体分子必须有足够的容量；、可通过特定的方法导入细胞；、对于表达载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导顺序、增强子、加尾信号等DNA调控元件。6、举出基因文库构建中对重组子筛选的3种方法并简述过程。抗生素抗性筛选、抗性的插入失活、兰-白斑筛选 或PCR筛选、差式筛选、DNA探针 多数克隆载体均带有抗生素抗性基因（抗氨苄青霉素、四环素）。当质粒转入大肠杆菌中后，该菌便获得抗性，没有转入的不具有抗性。但不能区分是否已重组。 在含有两个抗性基因的载体中，如果外源DNA片段插入其中一个基因并导致该基因失活，就可用两个分别含不同药物的平板对

35、照筛选阳性重组子。 如pUC质粒含LacZ基因（编码半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。7、介绍基因工程的宿主细胞必须具备的条件。 便于重组DNA分子的导入； 能使重组DNA分子稳定存在于细胞中； 便于重组体的筛选； 遗传性稳定高，易于扩大培养或发酵生长； 安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染； 有利于外源基因蛋白表达产物在细胞内的积累，或促进外源基因的高效分泌表达。 在遗传密码的应用上无明显偏倚性； 具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的

36、基因的高效表达； 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。综合能力1、PCR的基本原理？答：PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理是依据细胞内DNA半保留复制的机理，以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，然后耐热DNA聚合酶以dNTP为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。PCR全过程每一步的转换是通过温度的改变来控制的。需要重复进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高温变性、低温退火、中温延伸个步骤构成PCR反应的一个循环，此循环的反

37、复进行，就可使目的DNA得以迅速扩增。DNA模板变性：模板双链DNA?单链DNA，94。退火：引物单链DNA?杂交链，引物的Tm值。引物的延伸：温度至70 左右， Taq DNA聚合酶以种dNTP为原料，以目的DNA为模板，催化以引物末端为起点的53DNA链延伸反应，形成新生DNA链。新合成的引物延伸链经过变性后又可作为下一轮循环反应的模板PCR，就是如此反复循环，使目的DNA得到高效快速扩增。2、核酸分子杂交的原理？答：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）碱基互补配对结合，重新形成双链；在这一过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及在复性过程中个分子间键

38、的形成和断裂。杂交的双方是待测核酸和已知序列。3、蓝-白筛选的原理？答：某些质粒带有大肠杆菌的半乳糖苷酶基因片段，在半乳糖苷酶基因的基因区外又另外引入了一段含多种单一限制酶位点的DNA序列。这些位点上如果没有克隆外源性DNA片段，在质粒被导入lac-的大肠杆菌后，质粒携带的半乳糖苷酶基因将正常表达，与大肠杆菌的半乳糖苷酶基因互补，产生有活性的半乳糖苷酶，加入人工底物X-gal和诱导剂IPTG后，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源DNA片段，将使lac Z基因灭活，不能生成半乳糖苷酶，结果菌落出现白色。由于这种颜色标志，重组克隆和非重组克隆的区分一目了然。4、SANGER双脱氧链终止法的

39、原理？答：DNA链中核苷酸以3,5-磷酸二酯键连接，合成DNA所用的底物是 2-脱氧核苷三磷酸。2,3ddNTP与普通dNTP不同，它们在脱氧核糖的3位置缺少一个羟基。在DNA聚合酶作用下通过三磷酸基团掺入到延伸的DNA链中，但由于没有3羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，正在延伸的DNA链不能继续延伸。在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP，链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止竞争，产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于引物末端到出现过早链终止位置间的距离。在4组独立酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的

40、A、C、G或T位置。5、PCR引物设计的基本要求？答：、引物长度一般为1530个核苷酸。过短影响PCR的特异性，过长会提高相应退火温度，使延伸温度超过TaqDNA聚合酶最适温度74,影响产物的生成。、引物的碱基尽可能随机，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象。3端不应有连续3个G和C。否则会使引物和模板错误配对。G+C含量一般占45 -55。3端和5端引物具有相似的Tm值,Tm值计算公式：Tm4(G+C)+ 2(A+T)、引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。引物的连续互补序列，一般不超过3bp。、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3端的互补重叠。、引物与非特异扩增区的序列的同源性不超

41、过70，引物3末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。、引物3端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3端最佳碱基选择是G和C，形成的碱基配对比较稳定。、引物与模板结合时，引物的5端最多可以游离十几个碱基而不影响PCR反应的进行。、引物的5端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子、终止密码子等6、什么是DNA重组技术，典型的DNA重组实验的基本步骤？DNA重组技术也称为（基因克隆）或（分子克隆 ）。最终目的是（把一个生物体中的遗传信息DNA转入另一个生物体）。典型的DNA重组实验通

42、常包含以下几个步骤：提取供体生物的目的基因（或称外源基因），酶接连接到另一DNA分子上（克隆载体），形成一个新的重组DNA分子。将这个重组DNA分子转入受体细胞并在受体细胞中复制保存，这个过程称为转化。对那些吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定。对含有重组DNA的细胞进行大量培养，检测外援基因是否表达。7、简单介绍遗传标记的主要类型。遗传标记（Genetic Markers）是基因型特殊的易于识别的表现形式。它一般具有较强的多态性、表现的共显性、不影响重要的农艺性状和经济方便、易于观察记载等优点。在遗传学的建立和发展过程中起着重要作用。从遗传学的建立到现在，遗传标记的发展主要经历了4个阶段，表现出了4种类型。、形态标记（Morphological Markers）形态标记是指生物的外部特征特性。包括质量性状作遗传标记和数量性状作遗传标记，例如人的肤色、作物的株高、种子的粒形和动物的体重等。它是最早被使用和研究的一类遗传标记。在遗传的分离规律、自由组合定律和连锁交换定律以及群体遗传学和数量遗传学的研究和应用等方面发挥着重要作用。形态学标记研究物种是基于个体性状描述，得到的结论往往不够完善，需生物统计学知识进行严密的分析。、细胞标记（Cytological Markers）细胞标记主要