生物制药知识点

1、生物制药知识点 发酵生产三要素 生产菌种、发酵工艺和发酵设备蛋白质药物的缺点药理作用的放大或延伸、免疫毒性、杂质或污染物引起的毒性。生产药物的天然微生物类型细菌：大肠杆菌属、短杆菌属、节杆菌属等；放线菌：链霉菌属、诺卡氏菌属、小单孢菌属、游动放线菌属。真菌：藻状菌纲（根霉、梨头霉属）、子囊菌纲（酵母菌属、裂殖酵母属）、担子菌纲（牛肝菌属、灵芝属）、半知菌纲（曲霉属、青霉属、头孢霉菌属）发酵的基本过程菌种一一种子制备一一发酵一一发酵液预处理一一提取精制。菌种保存生产菌种须以休眠状态保存在砂土管或冷冻干燥管中，并置于04恒温冰箱(库)内。使用时可临时取出，接种后仍需冷藏。使用期生产菌种一般都严格规

2、定其使用期，一般砂土管为12年。常用兼性贴壁依赖性细胞：对支持物的依赖性不严格，既可贴壁生长，也可悬浮生长。 CHO细胞、BHK细胞、L929细胞。治疗性单抗适应症(1).肿瘤治疗。抗体药物通过多种机制发挥抗肿瘤作用。通过抗体依赖细胞毒作用（ADCC）和补体依赖细胞毒作用（CDCC）等途径直接杀伤肿瘤细胞；改变细胞信号转导，诱导肿瘤细胞凋亡；抗体可以向靶向运送细胞毒素结合物直接杀伤肿瘤细胞。(2).免疫疾病治疗。通过结合免疫病理过程中的重要因子，阻断其功能而发挥作用。游离植物细胞的制备定义：使细胞膜和细胞质中大部分蛋白质和脂质被溶解抽提掉，但细胞骨架系统蛋白质却不受破坏而被保存下来，经固定和染

3、色后可在光镜下，见到网状结构的细胞骨架，然后融合某种细胞核。酶在医药领域的应用疾病诊断：一是根据体内原有酶活力的变化来诊断某些疾病，而是利用酶来测定体内某些物质的含量，诊断某些疾病。疾病治疗：酶可以作为药物治疗多种疾病，用于治疗疾病的酶成为药用酶。药物生产：利用酶的催化作用将前体物质转变为药物。分析检测：酶法检测或酶法分析。菌种保藏的原理及措施 原理：使菌种代谢处于不活跃状态，即生长繁殖受抑制的休眠状态措施：物理和化学方法（低温；干燥；缺氧；营养缺乏）低温斜面保藏：低温降低新陈代谢。4短期保藏，16个月；易变异。石蜡封存：隔绝氧气，减少蒸发。4，约1年。砂土管保藏：干燥抑制生长。孢子吸附在砂土

4、上，真空抽气干燥。干燥器于冰箱，数年。冷冻干燥保藏：保护剂降低菌体细胞冰点，减少冰晶对细胞伤害。低温避光，中期保藏，510年。液氮保藏：培养物与冷冻保护剂混合，密封。液氮（-196）罐或-80冰箱。长期保藏改善基因工程菌不稳定性的策略 基因工程菌：以微生物为操作对象，通过基因工程技术获得的过量表达外源基因或抑制表达自身基因的工程生物体。高密度培养的优点缩小发酵体积、增加表达量、成本低，生产率高。影响质粒稳定的因素与质粒稳定有关的基因及质粒结构自身对其稳定性的影响宿主对质粒稳定的影响质粒拷贝数重组质粒的表达对质粒稳定性的影响微生物转化反应的特点蛋白酶为催化剂对立体结构合成上具有高度的专一选择性反

5、应速度快反应条件温和种子活化 将保存的菌种接种在固体培养基上，在适宜条件下培养，恢复其固有生物特性。融合蛋白 将抗体分子片段与其它蛋白融合，可得到具有多种生物学功能的融合蛋白，如免疫毒素(immunotoxin)、免疫细胞因子(immunocytokine)、免疫黏附素(immunoadhe2sin)单域抗体又称纳米抗体或重链抗体，仅由重链构成，其抗原结合区仅是一个通过铰链区与Fc区连接的单结构域，而且这个抗原结合区自抗体上分离后仍具有结合抗原的功能，这就为抗体的分子构建提供了一个新方法。基于单域抗体的一系列优点，在免疫实验、诊断与治疗中，它将发挥超乎想象的巨大功能。人源化抗体人源化抗体就是指

6、抗体的可变区部分（即Vh和Vl区）或抗体所有全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。植物诱导子诱导子 可调节植物次生代谢，适宜条件下可明显提高植物细胞中有用的次生代谢产物的含量。非生物诱导子 非细胞天然成分，可触发形成植保素的信号因子，如水杨酸、茉莉酸、茉莉酸甲酯、稀土元素、重金属盐等。生物诱导子 指微生物类诱导子，如真菌孢子、菌丝体、匀浆、真菌细胞壁成分、真菌培养物滤液等。微生物转化 通过微生物细胞将复杂的底物进行结构修饰,即利用微生物谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物特定部位(基团)进行的催化反应.高密度培养高密度培养是一个相对概念，用以描述

7、的单位是干细胞重量/升(DCW/L)广义来讲，凡是细胞密度比较高，以至接近其理论值的培养均可称为高密度培养。一般认为其上限值为150-200gDCW/L下限值为20-30gDCW/L但是由于不同菌种(或不同菌株)之间可能存在较大差异，所以高密度培养的上限值和其下限值也均有例外。高密度培养的意义：1.提高菌体的发酵密度或单位体积培养液中菌体的浓度，进而提高体积产率；2.缩小生物反应器体积，减少生产设备投资；3.强化下游分离提取，并减少废水量。灌流（注）式操作培养液一起装入发酵罐，接种后培养过程中，不断补充新培养基，取出部分培养基，菌体仍然滞留罐内。特点：除去有毒害的代谢物补充营养物质包涵体: (

8、基因工程定义)在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体。 包涵体表达蛋白质的优越性：在下游生产过程中特别是在医药生产中，以包涵体形式表达的蛋白质具有一些优越性。 （1） 异源表达的蛋白质很容易被宿主细胞内的蛋白质酶降解，如果重组蛋白质以包涵体形式表达，由于包埋了酶攻击的位点，可以最大限度地抵抗蛋白质酶的攻击； （2） 包涵体表达的蛋白质没有活性，细胞破碎和以后的纯化步骤不用考虑蛋白质的失活问题； （3） 包涵体形式表达的蛋白质与宿主细胞的其他蛋白质的分离比可溶蛋白质的分离方法简便，造价低，使用简单的

9、离心或者过滤的手段就能使包涵体与宿主细胞的其他蛋白质成分进行有效的分离； （4） 有些表达的外源蛋白质对细胞有毒性或者致死，大量表达时会导致细胞的死亡，最终的细胞数量和产物相当低；而包涵体形式的蛋白质由于丧失了生物活性从而可以高效大量地表达； （5） 对于以包涵体形式表达的产物可以比较容易进行在线观测定性，含有包涵体蛋白质的细胞有较大的折射率，不必像可溶的蛋白质需要细胞破碎后使用酶学或者电泳学的方法进行鉴定。愈伤组织在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞（细胞排列疏松、无规则）。发酵生产中pH的影响及其控制 pH与微生物的生命活动密切相关酶催化活性pH的变化又是微生物代谢状况的综

10、合反映基质代谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供氧状况通过观察pH变化规律可以了解发酵的正常与否控制pH策略分阶段控制 生长最适pH和产物最适pH。缓冲液控制 碳酸钙和磷酸盐缓冲液。补加酸或碱进行控制补料方式控制 流加糖率来控制pH。基因工程药物的质量检控内容 危害性(1)操作的后果还存在不可预测性和不可控制性(2)药物质量的不稳定性(3)残留抗生素(4)伤害正常的细胞(5)可能出现变异体解决措施构建表达载体时给目的基因组装诱导型启动子。慎用选择标记基因或报告基因。尽可能采用外源DNA定位整合载体。完善对此类产品的严格质量控制。一、原材料的质量控制原材料的质量控制是要确保编码药品的DNA序列的

11、正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。二、培养过程的质量控制在工程菌菌种贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；在重复发酵中，工程菌表达稳定；始终能排除外源微生物污染。三、纯化工艺过程的质量控制产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致；外源性蛋白质、DNA与热原都控制在规定限度下。四、目标产品的质量控制1、产品的鉴别（1）肽图分析：肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质，对生成的肽段进行分离分析。肽图分析结果与氨基酸成分和序列分析结果合并，作为蛋白质的精确鉴别。（2）氨基酸成分分析：对目

12、的产物的纯度仍可以提供重要信息。（3）部分氨基酸序列分析：可作为重组蛋白质和多肽的重要鉴定指标。（4）重组蛋白质的浓度测定和相对分子质量测定：浓度测定方法主要有凯氏定氮法、双缩脲法、染料结合比色法、福林酚法和紫外光谱法等。相对分子质量测定最常用的方法有凝胶过滤法和SDS-PAGE法，凝胶过滤法是测定完整的蛋白质相对分子质量，而SDS-PAGE法测定的是蛋白质亚基的相对分子质量。（5）蛋白质二硫键分析：方法有对氯汞苯甲酸法(p-chloromercuribenzoate,PCMB）和5,5-二硫双基-2-硝基苯甲酸法（5,5-dithiobis-2-nitrobenzoicacid,DTNB)等

13、。2、纯度分析纯度分析是基因工程药物质量控制的关键项目，包括目的蛋白质含量测定和杂质限量分析。（1）目的蛋白质含量测定：通常采用的方法有还原性及非还原性SDSPAGE法、等电点聚焦、各种HLPC、毛细管电泳（CE）等。（2）杂质:蛋白类杂质：主要的是纯化过程中残余的宿主细蛋白。它的测定基本上是采用免疫分析的方法，其灵敏度可达百万分之一。同时需辅以电泳等其他检测手段对其加以补充和验证。其他的蛋白杂质也要严格控制。非蛋白质类杂质：主要有病毒和细菌等微生物、热原、热原质、内毒素、致敏原及DNA。生物活性测定：需要进行动物体内试验和通过细胞培养进行体外效价测定。稳定性考察产品一致性的保证五、产品的保存

14、1、液态保存（1）低温保存（2）在稳定pH条件下保存（3）高浓度保存（4）加保护剂保存2、固态保存动物细胞培养的要求 1 对培养条件要求严格动物细胞对周围环境十分敏感无细胞壁保护，细胞膜直接接触外界。物理化学因素：渗透压、pH、离子浓度、剪切力等耐受力很弱，容易受伤害。a粘度培养基的粘度主要受血清含量的影响，在多数情况下，对细胞生长没有影响。在搅拌条件下，用羧甲基纤维素增加培养基的粘度，可减轻细胞损害。b氧气动物细胞生长必须有氧气，缺氧时不能生存。离体培养的气体：含有5CO2和95空气，其中氧浓度为21。c pH值低于6.8或超过7.6对细胞产生严重影响，甚至使其死亡。机体细胞的pH范围为68

15、，而且血液和体液中变化范围很小。酚红常用作指示剂碳酸盐缓冲系统使用多。在生理pH值条件下的缓冲能力差。d渗透压动物细胞对渗透压有较强的耐受性离体培养细胞的渗透压应控制为等渗透溶液。增减NaCl的浓度调整渗透压e支持物玻璃塑料制品微载体使贴壁细胞可以像悬浮培养那样进行。微载体表面光滑，并带有少量正电荷，适于细胞贴附。2 对培养基组成要求高完全异养，容易利用、相对低分子量的营养物12种必需氨基酸，8种以上维生素，多种无机盐和微量元素多种附加成分：生长类、细胞因子和贴壁因子因子及激素、结合蛋白质能源：单糖，葡萄糖，谷氨酰氨氮源：氨基酸单体化合物抗体生产的发展趋势 (1)发现新的与疾病相关的分子靶点。

16、(2)免疫检测技术的研发。(3)抗体药物的人源化。(4)抗体药物分子的小型化。(5)利用重组DNA技术制备具有抗体特异性结合作用和药理活性的融合蛋白。固定化酶的酶学特性的变化情况 A、底物专一性：对底物的专一性下降。B、最适pH：最适pH可能变大，也可能变小；pH-酶活曲线可能发生变化，其变化与酶蛋白和载体的带电性质有关。C、最适温度：一般升高。原因是固定化后空间结构更为稳定。D、米氏常数(Km) ：Km值均发生变化，有的增加很小，有的增加很大，但不会变小。E、最大反应速度（Vm）：变化很小或不变。发酵工程菌种选育改良的具体目标能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成的目的产物产量高、易于回收；生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；培养条件易于控制；抗噬菌体及杂菌污染的能力强；不易变异退化；对放大设备的适应性强；不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。包