基因表达调控ppt.ppt

1、第七章 克隆基因的表达,宿主细胞：原核细胞或真核细胞,克隆基因的表达,外源基因,mRNA,RNA Pol,载体,外源基因,大肠杆菌,基 因 克 隆,植物基因工程,据受体细胞的不同可分为： 1、原核表达载体系统： 将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。 2、真核表达系统： 使外源基因在真核细胞中表达的体系,7.1 外源基因在原核细胞中的表达,用原核生物作宿主表达外源基因,一、原核生物基因表达的特点,一、原核生物基因表达的特点,一、原核生物基因表达的特点,二、原核生物基因表达的调控序列,1. 启动子(Promoter,指能被RNA聚合酶识别、结合并

2、启动基因转录的一段DNA序列。 一般长40-60bp，富含A-T碱基对 共有保守序列： -10区（pribnow box）：TATAAT -35区,5-TTGACA-3,-10box（Pribnow Box,RNA聚合酶 亚基的识别位点,-35box,核糖体结合位点（ RBS（ribosome binding site),Shine-Dalgarno（SD） sequence,mRNA上与核糖体16sRNA结合的DNA序列,S-D序列距离AUG的距离也影响翻译,2. SD序列,位于SD序列下游,ii）起始密码,内终止子（intrinsic terminator,E.coli中促使转录终止的DN

3、A位置有一段反向回文顺序，其后紧接一串A，称为内终止子，形成终止信号,位于基因3端,给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列,3.终止子,5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-3 3-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板,转录,5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA,RNA折叠,mRNA折叠,U C,C,U G,GC,AU,CG,CG,GC,CG,CG,GC,A A,CCCAC UUUU3,DNA,RNA 聚合酶,脱落,大肠杆菌

4、偏爱UAAU。一般安置上全部的三个终止密码防止核糖体跳跃（skipping,能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列,4.翻译终止密码子,5.翻译增强子（Translation enhancer,1）必须是一种强启动子,能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上,2）应呈现低水平的基础转录,便于表达毒性蛋白等,3）应是可诱导型的,用温度或化学试剂诱导,A. 最佳启动子必须具备的条件,三、基因工程常用的原核启动子,B. 基因工程常用的原核生物启动子举例,来自大肠杆菌的乳糖操纵子,可用乳糖或其类似物IPTG诱导,IPTG =异丙基硫代-D半乳糖,1）乳糖启动子lac,

5、2）色氨酸启动子 trp,trpR,P1,O,trpE,trpD,P2,trpC,trpB,trpA,trpR,阻遏蛋白基因,P1,P2,启动子,O,操纵基因,衰减子,来自大肠杆菌的色氨酸操纵子,3）PL和PR启动子,是从噬菌体中得到的一类启动子，比lac启动子的活性高8-10倍，比trp启动子活性高,N:抗终止蛋白； Cro: 抗阻遏蛋白(裂解必需的,cI, cII, cIII: 阻遏蛋白； P:启动子；O:操纵子,R:右；L:左,当cI合成后，与OL和OR结合阻止RNA聚合酶，则左右基因都受到抑制。但促进PM使cI进一步转录。进入溶原期,cI857,表达载体常用的噬菌体启动子是PL,调节基

6、因cI 则是选择一个温度敏感性的突变基因cI857,42oC时阻遏蛋白失活，外源基因大量转录,cI857,PL,外源基因,28oC时阻遏PL，外源基因不转录,四、几种类型的原核表达载体,适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。 主要元件：强启动子 SD顺序 筛选标志 其它调控基因,类型： 非融合型表达载体：-天然完整蛋白 融合型表达载体： -融合蛋白 分泌型表达载体： -产物可跨膜分 泌至胞外间隙,1、非融合型表达载体,载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起,PL启动子-温度诱导 插入位点-HpaI,非融合型表达载体-pPL-Lamda,优点：产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。 缺点：容易被宿主菌的蛋白酶所破坏,2、融合型表达载体,Ptac：IPTG诱导 GST融合蛋白直接纯化 产物切割方便： pGEX-1T凝血酶 pGEX-2T-凝血酶 pGEX-3T-X因子 位相载体,融合型载体-pGEX系列,优点： 表达效率高 产物稳定 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定 易纯化：利用融合原核多肽的特性,1）主要元件： 启动子和SD序列 信号肽序列：SD下