聚合酶链式反应

1、第四章 聚合酶链式反应,1971年，Khorana提出： DNA经过变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。 但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了,4.1 PCR技术简史,4.1 PCR技术简史,4.1 PCR技术简史,72,94,55,PCR循环,PCR仪,PCR反应,4.2 PCR反应原理,模板DNA变性,引物DNA复性,引物DNA延伸,PCR,双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,TAGAACTTG

2、,ACGTACGTA,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,3,5,5,3,3,5,5,3,TAGAACTTG,ACGTACGTA,95oC,1）DNA模板变性,模板,模板（template,95oC,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,3,5,5,TAGAACTTG,ACGTACGTA,3,人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5端相同,2）DNA模板与引物复性,模板,模板,ATCTTGAAC,5,3,ACGTACGTA,5,3,引物,引物,引物（primer,40-65oC,DNA聚合酶按碱基配对原则延伸DNA链,3）DNA链的延伸,TGCATGCAT,

3、ATCTTGAAC,3,5,5,TAGAACTTG,ACGTACGTA,3,模板,模板,ATCTTGAAC,5,ACGTACGTA,5,Taq,Taq,72oC,理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA,变性复性延伸,5）1个循环的结果,4）新一轮循环开始,PCR反应曲线,4.3 PCR的过程,1）第一步 变性（denature,94-95 oC下5分钟，模板DNA双链完全变性成单链,2）第二步 复性（anneal,50-60 oC下1分钟，引物与模板复性,引物的浓度高， 引物的链短,94 oC下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板,4）第四步 变性（denature,72

4、 oC下1-2分钟，Taq DNA聚合酶在引物的3端上加上核苷酸,3）第三步 延伸（extend,5）第五步 重复（repeat,第二步第三步第四步,复性,延伸,变性,95oC 5min,50oC 1min,72oC 2min,94oC 1min,温度循环,需要的模板量极低,4.4 PCR的特点,1）特异性强,PCR使用专门合成的DNA引物。 延伸过程是在高温下进行,2）敏感性高,这就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的DNA。提高了反映的特异性,理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109条,RT-PCR,对模板的纯度要求低,5）可以扩增mRNA,4）简便,先用逆转录酶将mRNA

5、合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增,3）快速,整个PCR过程约4小时即可完成,不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板,4.5 标准的PCR反应体系,10扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul,自从H.A. Erilish分离出耐高温的Taq DNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37 oC )，PCR技术才进入实用阶段,1）Taq DNA聚合酶,4.6 影响 PCR的因素

6、,Taq DNA聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求,热稳定性,最适温度： 72-78 oC 延伸速度： 约1000nt/min酶分子 最长延伸长度：6.7kb,最适温度高,Taq酶的功能缺点,具有53聚合酶活性和53外切酶活性，但没有35外切酶活性,合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序,金属离子敏感（尤其是Mg2+ ）。 当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为0.7-0.8mmol/L时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L,Taq DNA聚合酶的激活剂,50mmol/L KCl也能激活Taq DNA聚合酶的活性,与待

7、扩增的模板DNA区段的两3端序列互补（ 5端相同）的短DNA,2）引物（primer,位置,3,3,即2.751011 bp的基因组中有一次完全与19个核苷酸的序列相同的机会（或机会是约210-11,引物的长度,理论计算,419=2.751011,一般引物设计为长1530bp,引物的碱基序列,5端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作,5ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3,3GCTAGCTACTTAAG5,3端必须与模板正确配对，5端可以不配对,template,primer,尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板

8、的结合力,引物的碱基组成,避免连续相同碱基排列或内部回文序列,5GGCAGTCTGCCAGTCTAC3,CTGCCAGTCTAC3,GACGG5,T,发卡结构,1,2,3）避免形成引物二聚体（dimer,两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补,5GGTCTGCCAGTCTAC3,3CAGGACTTAGTCACT5,primer1,primer2,Upstream primer vs Downstream primer,Sense primer vs Antisense primer,Primer1 vs Primer2,Forward primer vs Reverse primer,引

9、物的Tm值,Tm=（G+C)4 + (A+T)2,当引物中的（G+C）含量低于50%时，复性温度低于55 oC,适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现,实际复性温度选择低于Tm值5 oC,手工计算,一般估计,引物的浓度,一般使用终浓度各0.2mol/L,简并引物,如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。 需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物,设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性,引物设计现在多用专业软件,套嵌引物（nested primers,1,3,2

10、,4,如Primer5.0等,dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失 dNTP溶液呈酸性，使用时应小量分装，-20冰冻保存，多次冻融会使dNTP降解 在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，浓度过低会降低PCR产物的产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性,3） dNTP,4）模板DNA,但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性,模板的量,不能太多，100l反应体系中100ng足够,纯度,PCR对模板DNA的纯度要求不高,Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响 在一般的 PCR反应中，dNTP浓度200u

11、mol/L时，Mg2+浓度为1.52.0 mmol/L为宜 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少,5） Mg2,一定范围内提高退火温度； 缩短退火和延伸时间，可减少错误引发及 多余的DNA聚合酶参与酶促延伸的机会； 降低引物和酶的浓度可以减少错误引发， 尤其是能减少引物二聚体的引发； 改变Mg2+的浓度,4.7 提高PCR扩增的特异性,引物设计的特异性； 减少循环次数； 热启动（Hot Start） 采用二对引物即外引物和内引物进行扩增来 提高扩增的特异性,典型的引物1到30个核苷酸长 ； 选择GC含量为45到55碱基的

12、分布是随机的； 避免引物间和引物内产生碱基以上互补； 避免3末端的错误配对； 设计5端和中间区为G或C的引物； 避免引物对3末端存在互补序列； 避免3末端富含GC，设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。 避免存在可能会产生内部二级结构的序列,4.7 引物设计的基本原则,引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性 引物量：每条引物的浓度0.1 1umol或10 100 pmolRT-PCR 引物设计特别注意：跨越两个外显子 附加序列:目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5端而不影响特异性,引物5端修饰技术 修 饰 法 用 途 附加核酸序列：

13、 酶切位点 克隆（如定向克隆） 噬菌体启动子 合成RNA探针、测序 蛋白质结合序列 产物纯化、检测 核糖体结合序列 高效表达 其它 构建载体、重组子等,4.8聚合酶链式反应技术类型,巢式PCR： 是为了增加扩增的灵敏度,对已知序列设计出第一对引物,扩增25个循环,然后根据序列设计第二对引物(在第一对引物内部),如此扩增,不受平台效应限制,灵敏度高,选定一个温度范围，如5035，每个温度2循环，然后在35度15循环。其原理是，随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性条带优先被扩增。这种方法的退火温度范围较大，

14、在不知道最佳退火温度时比较适合,降落PCR,竞争引物PCR ： 有一个碱基变化的两种引物在较宽松的复性条件下竞争DNA模板，其中只有完全互补的引物才能大量配对。该法可用于测定某一DNA片段上是否带有某一已知碱基置换,不对称PCR,低浓度的引物（限制引物）首先被用完，随后只有高浓度的引物，继续合成单链DNA。最后产物中99%是单链DNA,3,5,5,3,引物少,用于扩增单链DNA，单链DNA更适于测序,技术关键,两个引物的浓度相差100倍,锚定PCR： 锚定PCR是在未知DNA cDNA片段的一个末端人工接上一个已知序列片段,利用一个基因特异引物与这个人工序列区引物（锚定引物）进行扩增，所以它是

15、一种半特异性扩增,反向PCR,扩增两个引物外侧的未知序列,把线性DNA模板转变成环形分子,template,template,3,5,5,3,传统PCR只扩增两个引物质之间的已知序列,技术关键,使引物的外侧序列 “转变” 成内侧序列,兼并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。兼并度越低，产物特异性越强。设计引物时应尽量选择兼并性小的氨基酸，并避免引物3末端兼并，因为3端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR；次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度,兼并引物PCR（Degenerate Primer,RT-PCR（reverse transcription

16、-PCR） 在逆转录酶的作用下、以mRNA为模板合成互补的cDNA，再以cDNA为模板进行PCR反应,Temin,H.发现反转录酶， 1975诺贝尔奖,技术关键,利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增,RNA template,3,5,下游引物,cDNA first strand,3,5,上游引物,cDNA first strand,cDNA second strand,3,5,3,5,反转录酶,Taq酶,PCR,Reverse transcription (RT,下游引物,上游引物,Taq酶,小牛肠磷脂酶,烟草酸性焦磷酸酶,实时荧光定量PCR,常规定量PCR

17、技术： 对PCR扩增反应的终产物进行定量 重复性差 半定量 实时定量PCR技术： 对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行 定量,实时荧光定量PCR原理,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析,1）Ct 值,是荧光定量PCR技术的一个很重要的概念 C代表Cycle，t代表threshold(荧光域值)。 含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数,2）荧光域值（threshold）的设定,PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号 荧光域值是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：thres

18、hold = 10 SDcycle 3-15,Ct值的确定,相同模板在同一台PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性,3）Ct值与起始模板的关系,研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数,荧光定量标准曲线,4）荧光化学,荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种： 荧光探针 荧光染料,TaqMan荧光探针,与目标序列互补的寡核苷酸探针 两端分别标记一个报告荧光基团(荧光素)和一个淬灭荧光基团(淬灭剂)。 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收； PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收