免疫细胞 的分离与检测

1、免疫细胞的分离与检测,第一节 免疫细胞的分类与分离,一、免疫细胞的种类与特征 二、免疫细胞的分离技术 三、细胞的冻存与复苏,免疫细胞的特征,1、免疫细胞的形态学特征 理化性状 生物学特性 2、免疫细胞的膜分子特征 CD分子,免疫细胞的起源与分化,红细胞 血小板 肥大细胞 中性粒细胞 巨噬细胞 树突状细胞 浆细胞 T细胞 NK细胞,免疫细胞的分离技术,1、密度梯度离心法 2、黏附分离法 3、荧光激活分离法 4、磁性分离法 5、其他分离法,密度梯度离心法,离心前,离心后,稀释抗凝血,淋巴细胞分离液,血浆,单个核细胞,粒细胞,红细胞,沉降速度,2r2（QQ0,9,x g,Q =颗粒比重 Q0 =溶质

2、比重 r =颗粒半径 = 形状因子 = 颗粒摩擦系数/同体积球型颗粒摩擦系数 = 粘稠度 g = 相对离心力,人类血液有形成分的平均密度与直径,密度 直径（） 血小板 1.041.06 淋巴细胞 1.061.08 810 粒细胞 1.081.09 13 红细胞 1.091.10 7.5,黏附分离法,尼龙毛法 贴壁法 亲和板法 吸附柱法,荧光激活分离法（FACS,荧光检测器,滤光片,透镜,接物镜,激光束,偏转板,喷嘴,细胞收集管,流体护套,样品,流式细胞仪,磁性分离法,磁铁吸引法 磁式细胞分类术法,MACS (阳性选择法,N,S,MACS (阴性选择法,N,S,其他分离法,花环沉降法 细胞活化克

3、隆法 MHC分子四聚体法,抗原肽-MHC分子四聚体技术,细胞的冻存与复苏,细胞冻存的原理与方法 细胞复苏的原理与方法,细胞冻存罐,第二节 免疫细胞膜分子的检测,一、免疫细胞膜分子检测的原理与类型 二、免疫细胞膜分子的检测方法,免疫细胞膜分子检测的原理与类型,1、以抗体识别抗原 2、以配体识别受体,免疫细胞膜分子的主要检测方法,1、免疫标记检测方法 荧光抗体法 酶免疫检测法 免疫金银染色法 2、补体依赖的细胞毒试验（CDC） 3、花环形成试验,SmIg的荧光抗体检测法,SmIg的酶免疫检测法,补体依赖的细胞毒试验（CDC,染料,补体,E-花环,T细胞,B细胞,花环形成细胞,绵羊红细胞,EA-花环

4、,EAC-花环,第三节 免疫细胞功能测定,一、转化、增殖试验 二、细胞毒试验 三、抗体形成试验 四、细胞吞噬与杀伤试验,1、淋巴细胞转化试验 2、混合淋巴细胞培养,转化、增殖试验,放射性测定,3H-TdR,丝裂原（抗原）刺激,淋巴细胞转化试验原理示意,1、T细胞介导的细胞毒试验 2、NK活性测定 3、ADCC作用测定,细胞毒检测试验,放射性测定,细胞毒试验原理示意,靶细胞,效应细胞,分离上清,1、直接溶血空斑试验 2、间接溶血空斑试验 3、SPA-SRBC溶血空斑试验,抗体形成试验,直接溶血空斑试验,间接溶血空斑试验,SPA-SRBC溶血空斑试验,1、细胞吞噬功能试验 2、细胞杀菌功能试验,细

5、胞吞噬与杀伤功能试验,吞噬百分率,吞有颗粒的吞噬细胞数,计数的吞噬细胞数,吞噬指数,吞噬细胞吞噬的总颗粒数,计数的吞噬细胞数,NBT还原试验,原理,N-N- C + H+ N=N-R,N-NH2 C N=NH,四氮唑基（淡黄色,甲月簪基（紫黑色,NBT还原试验,方法,1、抗凝血 + 硝基蓝四氮唑（NBT），37。C孵育25min。 2、推片染色、镜检,正常值,NBT阳性细胞 7.5-15,第四节 免疫细胞凋亡测定,一、细胞凋亡的概念与原理 二、细胞凋亡的检测方法,细胞凋亡的概念与原理,1、细胞凋亡的概念 2、细胞凋亡的原理 3、细胞凋亡的特点,细胞凋亡（apoptosis,细胞在内源性基因调控

6、下发生的主动死亡过程，也称程序性死亡,细胞凋亡的过程,凋亡信号凋亡受体信号传导凋亡基因启动编码程序性死亡蛋白细胞结构解体细胞凋亡,细胞凋亡机制,细胞凋亡的特点,1、细胞皱缩 2、染色质边集 3、凋亡小体出现,细胞凋亡,细胞凋亡的检测方法,1、形态观察法 2、生化检测法 3、流式细胞仪检测法,形态观察法,普通光镜检测HE染色 甲基绿-派诺宁染色 荧光显微镜检测溴化丙锭染色 透射电镜检测典型形态改变,生化检测法,凝胶电泳法 原位末端标记法 二苯胺分光光度法,凝胶电泳法,原理：断裂DNA在凝胶中呈梯形排列 （DNA ladder） 方法：提取总DNA DNA凝胶电泳 观察DNA ladder现象,原位末端标记法（TUNEL,原理：利用标记的dUTP，在TdT作用 下结合DNA断片的3末端羟基， 显示断链DNA，提示凋亡 方法：制备组织切片 标记物结合 标记物显色 镜检,二苯胺分光光度法,原理：细胞凋亡可产生低分子量DNA，通过超速离心可与细胞核的高分子量DNA分离，分别测定两种DNA，即可得出凋亡百分率。 方法：裂解细胞 13000g超速离心 分别提取DNA 使DNA显色，测定,凋亡百分率,上清液OD值,上清液OD值+沉淀OD值,流式细胞仪法,原理：PI标记凋亡细胞，通过FACS可 显示凋亡细胞的特征性亚二倍