体外评价体系介绍

1、体外评价体系简介,体外评价,体外评价是指在活生物体之外的环境中利用细胞、模拟活生物体模型等平台进行的评价,在生物评价领域中，体外评价具有以下方面的特点 1、符合“3Rs”原则（Reduction，Refinement、Replacement） 2、检测结果的稳定性好、再现性高 3、可为临床评价提供有效的技术支持,体外评价体系的构成,安全性评价项目,1、刺激性评价 作为动物刺激性实验的代替法，使用3T3细胞分析评价被检物质的毒性指标,兔角膜细胞SIRC,2、眼粘膜刺激性评价 向兔角膜细胞SIRC 添加被检物质，确认刺激性效果，再与标准品对比进行刺激性强度的评价,3、细胞毒性评价 向细胞添加被检物

2、质，确认其对细胞的损伤情况，判断其毒性作用,4、光毒性评价（UV照射,对经过被检物质处理过的BALB/c 3T3小鼠成纤维细胞进行UVA照射后，以细胞摄取中性红为指标测算出细胞存活率，确定50%细胞毒性的被检物质浓度（TC50）。 通过UVA（+）、UVA（-）照射时的TC50应用下列公式计算出PIF值（Photo Irritant Factor）、MPE值可对被检物质的光毒性潜能进行评价。可以对单一成分和成品进行评价,1、抗氧化应激作用评价 氧化应激（Oxidative Stress，OS）是指破坏了强氧化剂和抗氧化剂的平衡导致的潜在伤害，氧化剂、抗氧化剂平衡的破坏是细胞损伤的主要原因。 皮

3、肤作为机体最外层的保护层，不可避免的受到紫外线与刺激物的作用，使皮肤细胞内的活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS ）过多增加，诱发氧化 应激作用，成为引起人体细胞老化的潜在因素,功效性评价项目,人体皮肤细胞中氧化应激作用的形成原因 紫外线照射（UVA、UVB） 过多活性氧的累计（ OH 、O2- 、H2O2、1O2 ） 过氧化脂质（氧自由基与多聚不饱和脂肪酸反应的产物,抗氧化应激作用的评价,评价方法： 对细胞进行氧化应激刺激，添加被检物质，通过对细胞生存率的分析来评估被检物质对氧化应激作用的预防与治疗作用。 评价项目： 评价消除由下列因素诱发的氧化应激作用的效果 U

4、VA、UVB照射 抗活性氧（ OH 、O2- 、H2O2、1O2 ） 过氧化脂质 评价平台： 正常人体表皮角质形成细胞 正常人体皮肤成纤维细胞 被检物质添加时间点： 氧化应激刺激前 氧化应激刺激中 氧化应激刺激后,角质形成细胞,成纤维细胞,2、抗衰老作用评价,皮肤的衰老通常分为内在性老化和外源性老化。 内在性老化见于暴露和非暴露部位，明显的特征为皱纹和皮肤松弛，表现为表皮、真皮变薄，表皮真皮连接处变平、弹性纤维和胶原纤维减少等情况。外源性老化主要发生在皮肤内在性老化的基础上，常由紫外线等引起，见于面部、颈脖和前臂等光暴露部位，表现为粗深的皱纹、异常的色素沉着、毛细血管扩张等。 抗衰老是国内外美

5、容皮肤病学研究的热门主题，对于抗衰老作用的评价，本实验室采用国际通用综合评价模式（体外评价+人体评价）。在体外对被检物质的抗衰老效果进行评价，取得的评估结果可为人体评价提供参考依据,评价平台： 正常人体表皮角质形成细胞 正常人体皮肤成纤维细胞 化学反应检测,促进胶原蛋白合成作用评价,对被检物质是否能提高人体皮肤成纤维细胞的1型胶原蛋白合成作用进行评价。伴随年龄的增加及外界环境的影响，皮肤内的1型胶原蛋白含量会减少，从而形成皱纹和皮肤松弛。本评价项目，通过向人体皮肤成纤维细胞添加被检物质后，测定细胞内1型胶原蛋白合成量（ELISA法），根据结果评定被检物质是否具有促进胶原蛋白合成的作用,胶原酶活

6、性阻碍作用 胶原酶是一种能水解胶原蛋白的三维螺旋结构的分解酶。体内胶原酶会随年龄的增加以及外界环境的作用下，促进其活性的增加，从而加速其对胶原蛋白的分解，破坏皮肤结构，出现皱纹、皮肤松弛等皮肤衰老迹象。 让胶原酶与添加了被检物质的胶原蛋白反应，测定胶原蛋白的分解程度，通过实验结果分析被检物质是否具有阻碍胶原酶活性增加的作用，评估被检物质的衰老作用,弹性蛋白酶阻碍作用 弹性蛋白酶作用是分解维持肌肤张力的弹性蛋白。随着年龄增加、过多活性氧的堆积促进弹性蛋白酶分解弹性蛋白，是形成皮肤衰老的因素之一。因此，阻碍弹性蛋白酶活性，可恢复肌肤张力，起到抗衰老的作用。 让弹性蛋白酶与添加了被检物质的弹性蛋白反

7、应，测定弹性蛋白的分解程度，通过实验结果分析被检物质是否具有阻碍弹性蛋白酶活性增加的作用，评估被检物质的衰老作用,促进玻尿酸合成作用评价 玻尿酸是一种高分子的多醣体，是由葡萄醛酸-N-乙酸氨基葡萄糖为双糖分子单位组成的直链高分子多醣，平均分子量介于10万到1000万Dalton之间，存在于人体皮肤组织中，填充在细胞与胶原纤维的空间中。具有保持皮肤弹性功能，锁住大量水分子，对组织具有保湿润滑作用，使肌肤饱满年轻有弹性。 但随着老化及年龄的增长，玻尿酸流失速度比生长速度快时，肌肤也逐渐变得缺乏水分，失去光泽弹性，出现皱纹等老化现象。 本评价项目，通过向人体皮肤成纤维细胞或人体表皮角质形成细胞添加被

8、检物质后，测定细胞内玻尿酸合成量（ELISA法），根据结果评定被检物质是否具有促进玻尿酸合成的作用,3、美白作用评价,美白是指抑制由紫外线照射所生成的黑色素，防止色斑的产生，恢复肌肤的原本色泽。黑色素是存在于人体皮肤基底层，在紫外线照射下会产生变化，生成一种保护皮肤的物质，然后黑色素又经细胞代谢，逐步到达肌肤表皮层，形成色斑和色素沉淀等问题,美白化妆品可排除皮肤细胞中积累的过多黑色素，具有淡化色斑、色素沉淀的作用。 美白作用评价是通过多种美白评估法，分析美白成分、美白产品对由紫外线引起的色斑的改善效果以及色素沉淀的抑制效果，客观、有效的评价其美白功效,色素沉淀及色斑生成示意图,黑色素生成抑制作

9、用 黑色素细胞受到紫外线照射后，启动人体保护机制生成黑色素，黑色素吸收紫外线的作用避免皮肤细胞受到损伤。但持续的照射促进了黑色素细胞活性，导致生成了过量的黑色素，从而在皮肤上形成了色素沉淀与色斑。因此，化妆品成分、产品的黑色素生成抑制作用是评价其美白功效的重要参数之一。 本评价项目，将被检验物质添加到黑色素瘤细胞培养，测定黑色素瘤细胞生成的黑色素含量，分析其抑制黑色素生成的能力，评估其美白作用的功效。 评价平台：B16BL6 小鼠黑色素瘤细胞,样品处理后黑色素生成效果,样品浓度 小 大,黑色素抑制效果 小 大,酪氨酸酶活性阻碍作用 酪氨酸酶（Tyrosinase）是黑色素合成的关键酶。对酪氨酸

10、酶活性进行阻碍可抑制黑色素的生成。 本评价项目将被检物质与标准物质进行酪氨酸酶活性阻碍效果对比，以及被检物质浓度与阻碍效果关系的分析,黑色素形成途径以及酪氨酸酶活性作用,黑色素分解作用,维生素C的黑色素分解效果,实验操作示意图,持续受到刺激的黑色素细胞会生成过多的黑色素，形成色斑与色素沉淀。具有黑色素分解作用的美白化妆品可淡化由黑色素引起的色斑，缓解色素的沉淀。 本评价项目，通过酪氨酸酶的酶作用将酪氨酸 合成为黑色素，然后添加被检物质测定其黑色素分解效果，根据结果对其黑色素分解能力进行评估,4、DNA损伤修复作用评价,环丁烷嘧啶二聚体增加的抑制作用 环丁烷嘧啶二聚体（Cyclobutane P

11、yrimidine Dimer, CPD）是DNA 受UVB 照射后造成的主要伤害形式 。使用正常的人体细胞测试被检物质能否抑制由UVB照射诱发的CPD的增加，从而评价其DNA损伤修复的作用,皮肤在UVB照射作用下，DNA分子吸收光能量后，造成DNA损伤。如不及时修复受损DNA，会引起DNA结构的变化，阻碍DNA的复制和转录。诱发机体的光老化，严重者导致皮肤癌,CPD结构式,COMET Assay（彗星测定,COMET Assay（彗星测定）也称为单细胞凝胶电泳测定技术，它是一种敏感单链或双链DNA突变和破损的遗传测定方法。 DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来，由于这些DNA的分子量很小，所以在电泳过程中会离开核DNA向阳极移动，形成彗星状的图像，而未损伤的DNA部分保持球形,DNA受损越严重，产生的断片越多并且片段越小，电泳时迁移的DNA量也就越大，迁移距离越长，荧光显微镜下可观察到尾长增加、尾部荧光强度增强。可用于 DNA损伤预防及修复作用的评价,UVB照射后 样品 COMET Assay 结果,三维仿真皮肤组