细胞遗传室工作手册SOP

1、中南大学湘雅医院医学遗传学国家重点实验室作业指导书文件编号版本/修订号 1.1 实验室用房使用规范发布日期实施日期 第一章 设备与器械1目的 规范实验室用房，确保实验室工作和业务用房的正常需要，以促进科室的发展，确保各项工作顺利进行。2实验室用房规范与要求细胞遗传学实验室一般分为洗涤室、培养室、细胞学处理室、阅片室、暗室、档案室。其要求一般与其他普通实验室的要求基本相同:1. 便于所有器具的清洗。2. 便于准备消毒及各种试剂的保藏。3. 便于使用各种方法检测待检标本，进行细胞遗传学方面的临床诊断。但同时需要具有暗室并具有符合医疗档案存放的档案室。2.1洗涤室玻璃器皿的清洗、包装，培养物质的准备

2、与消毒，供应物品的保藏等工作都需在洗涤室里进行，洗涤室的大小一般为4m6m，洗涤室应设有下列设备：1.一个清洗玻璃器皿的水槽，便于清洗、晾干；2.电热干燥消毒箱，用于玻璃器皿的干热灭菌；3.高压蒸汽灭菌锅，用于不能耐受干热灭菌物品的处理；4.烤箱两个便于烤干玻璃器皿或高压蒸汽灭菌物品；5.石英玻璃双重蒸馏器或超纯水装置，用于蒸馏水或超纯水的制备；6.真空泵一个，以备配制培养基过滤时用；7.物品准备台，以备包裹玻璃器皿等；8.储柜或储架，便于清洗干燥的器皿或其它物品存放；9.酸缸，一般最好是耐酸材料，用于盛装清洗液，清洗液多为含重铬酸钾的硫酸溶液。 2.2培养室培养室包括操作间和缓冲室，操作室功

3、能是进行无菌操作和细胞培养，如各种组织取材与接种材料的准备、培养物的生长状态观察等，因此应配有超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、小型低速离心机、冰箱、玻璃柜等。缓冲室则是供工作人员进入培养室前换消毒衣服、鞋、帽等之用。培养室一般3m3m已够用，要求清洁、干燥、不通风、光线适宜。操作间必须墙壁光滑并装有空调器，操作间与外间实验室之间最好有传递窗，以便传递临时需用的实验用品。培养室空气消毒可采取紫外线消毒或空气净化。2.3细胞学处理室细胞学处理室需要配备普通离心机、恒温水浴箱及恒温电烤箱（烤片用）等，主要用于染色体的收获与显带。2.4暗室暗室用于对荧光原位杂交技术结果的观察和分析，配备荧光显微

4、镜和分析系统。中南大学湘雅医院医学遗传学国家重点实验室作业指导书文件编号版本/修订号1.2 各类仪器设备标准操作规程发布日期实施日期1目的 规范各类仪器的正常使用和保养，延长仪器的使用寿命，确保各结果的准确性。2仪器使用环境：1）无灰尘、通风环境良好。2）避免阳光直射。3）室内温度1830，变化不超过24）室内湿度280%RH。5）电源电压变化再20V10V之内，5m内不能有配电器。3使用仪器程序3.1超净工作台超净工作台是目前实验室内普遍应用的无菌操作装置，在超净工作台内进行无菌操作，可明显地减少细菌污染的机会。超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气，通过高效空气微粒滤层净化，使操作范围形

5、成无菌环境。3.2CO2培养箱实验室一般应置备二台 CO2培养箱，将来自同一标本的培养瓶分两线放入不同的培养箱内培养，以保证细胞培养的成功率。 CO2培养箱常见的是隔水式培养箱。培养的细胞需要一个恒定的温度，过低或过高的环境温度均可导致细胞死亡，因此对培养箱的灵敏度要求在0.5。此外，一定浓度的CO2也是细胞培养所必需的。CO2培养箱可恒定地提供细胞所需的CO2（通常是5%）,使培养液的pH值保持稳定，适用于开放性培养。使用时应注意每三个月定期校正，如有异常应及时调整。培养箱内空气必须保持清洁，应定期用酒精擦拭消毒，消毒时每层隔板均需洗刷干净，并用75酒精纱布擦拭。每周定期更换箱底水盘中的水，

6、以保持相对湿度。为防污染可在水盘内加入1新洁尔灭。箱内高效空气过滤器堵塞时，指示灯提示后需及时更换3.3烤箱烤箱用于玻璃器皿的烘干和干热灭菌，一般以650mm500mm500mm的比较适用。烤箱都装有鼓风装置，鼓风与升温同时开始。干热灭菌物品时一般为180维持1.5h，灭菌后应待箱内温度下降至80时方可开门，以免骤冷而致玻璃器皿损坏。应注意的是橡皮制品、塑料培养板、有机玻璃制品禁用烤箱灭菌。3.4恒温水浴锅恒温水浴锅是实验室不可缺少的设备。主要用于显带处理和培养基的加温。由专人负责每周更换蒸馏水并添加防腐剂。3.5水纯化装置 离体培养的细胞对水的要求特别高，培养细胞用的器皿清洗最后一道程序应用

7、二蒸水冲洗，培养基的配制也应用二蒸水或超纯水。目前常用的有自动双重纯水蒸馏器（石英管加热），因为普通的橡皮对细胞是有毒的，所以制备好的二蒸水应避免通过橡皮管放出。3.6冰箱实验室必须配备有普通冰箱和低温冰箱（-20），普通冰箱用于培养液、生理盐水、Hanks溶液等试剂和标本短期的存放，低温冰箱用于贮存需要冷冻保持生物活性及长时间存放的试剂如血清等。3.7细胞冷冻贮存器细胞冷冻装置一般分为运输用和储存用二种液氮罐，用于细胞株和标本的保存，液氮罐双层结构中间为真空层，其内胆颈部与体部经焊接相连，故搬动和装入液氮时，应缓慢加入，使容器内的温度均匀下降，有条件可配备有程控降温仪的液氮储存系统，该系统的

8、特点是可自动控制冷冻箱的降温速度。3.8离心机细胞培养需要经常消化分离细胞、漂洗制备细胞悬液和进行传代以及染色体的收获，因此接种培养室与细胞处理室内可各配置一台可调速的小型台式离心机。3.9高压蒸汽灭菌装置高压灭菌是利用高压蒸汽使细菌体内蛋白凝固而达到灭菌，是最常用的灭菌方法。在115.5，30分钟就能杀死所有繁殖型细菌的芽胞。高压蒸汽灭菌比其它灭菌方法效果都好。由于蛋白质的凝固需有水分存在，当细菌体内含有水分在25以下时，蛋白质的凝固温度如下： 水分含量 凝固温度 25 74-80 8 80-90 6 145由此可见，在细菌体内有水分存在的条件下可以大大降低灭菌所需的温度。高压灭菌主要用于细

9、胞培养所需的二蒸水、生理盐水、手术器械、布类、橡皮类等。4显微镜与细胞遗传图象分析工作站显微镜是分析染色体的必备工具，一般要求每位实验室技术人员配备一台。有条件的实验室可配备细胞遗传图象分析工作站。4.1维护保养记录4.1.1每日保养每日登记各仪器的运行和使用情况，保证每台仪器的正常运行。4.1.2每周保养每周对各仪器进行清洁维护，检查各仪器是否存在各类使用的隐患。4.1.3每月保养 每月不定期的对各仪器进行抽样检查运行使用情况的检查。5小型设备5.1天平 普通称量0.1克的电子天平以及分析天平是实验室所必需的，要求每年做一次校正。5.2真空泵 培养液的配制都用过滤的方法进行除菌，一般30升旋

10、转式的真空泵即可。5.3酸度计 又称为氢离子测定计或pH计，是测定各种液体酸碱度的必须工具，要求每半年做一次校正。5.4加样器 加样器是细胞培养不可缺少的用具，其规格有0.5-10ul、10-100ul、100-1000ul,末端可安装不同容量吸管，吸入和注入液体较方便。使用时吸入的液体量不能在其设定范围之外，而且要求每半年做一次校正。5.5常用玻璃器皿及器械 培养器皿是供细胞接种生长等用的器皿，可用透明度好，中性硬质的玻璃制成。另外，还可使用透明、平滑、无毒、干净并经放射性核素照射灭菌密封包装的一次性使用塑料培养器皿，其优点是打开包装即可用于培养操作，缺点是费用较高。目前国内一般实验室使用的

11、还是玻璃器皿。5.5.1溶液瓶 其规格常为500ml、250ml、100ml的配胶塞的盐水瓶和配塑料螺旋盖的盛液瓶，用于贮存各种试剂等。5.5.2培养瓶 有玻璃和塑料二种，常用的规格有25cm2(70ml)和75cm2（275ml），160-175 cm2（600ml）等规格，国内培养瓶常用的规格有25ml，100ml和250ml等规格，主要用于细胞培养，早期的玻璃培养瓶是用胶塞封口，仅能用于密闭培养，现被螺旋盖培养瓶取代。螺旋盖培养瓶适宜在CO2培养箱中使用，瓶的底壁是供细胞贴壁生长的生长面，而其它内壁为非生长面。5.5.3培养皿 有玻璃和塑料二种，常用的有120mm，100mm和60mm等

12、规格，主要用于培养和分离组织用，也可用作单细胞分离及单层细胞贴壁培养等实验，。5.5.4多孔培养板 材料仅有塑料的一种，其规格有96孔，24孔，12孔，6孔，4孔，用于少量细胞或单个细胞的克隆生长，细胞转化及细胞毒性等各种检测实验。5.5.5吸管 有玻璃和塑料二种，主要用于移送培养基，玻璃吸管有直头和弯头二种，直头吸管用于吸加少量培养基，加抗菌素，加NaHCO3、调pH等用；弯头吸管用于吹打分散和混悬细胞用。5.5.6离心管 有玻璃和塑料二种，主要用于离心、漂洗和分离细胞，常用的规格有50ml， 10ml，5ml三种规格，此外还有微量离心管，规格有1.5ml，1ml， 0.5ml，以供贮存少量

13、试剂或其它实验用。5.5.7器械 主要用于取材和原代培养中切割组织。常用的器械有：组织剪、镊子等。使用过程中应注意保护刀锋，用毕擦净、晾干、以防生锈，消毒以煮、高压灭菌或75%酒精浸泡。5.5.8其它 如配制溶液的量筒、容量瓶以及试管、高压消毒用贮槽、铝饭盒、各种胶塞、冻存管、铝制吸管筒、各种试管架、研钵、各种橡皮塞、洗耳球、滴头、烧杯、玻棒、各种大小规格不同的试剂瓶、载玻片、盖玻片、针头式塑料抽滤器、0.45um醋酸纤维膜、酸缸、各种泡酸用的耐酸尼龙网袋、铜丝筐、耐酸手套、试剂瓶冲洗器、记号笔、染色缸、染色架、玻片板、酒精灯。 中南大学湘雅医院医学遗传学国家重点实验室作业指导书文件编号版本/

14、修订号 培养用品的清洗及准备发布日期实施日期 第二章 培养用品的清洗及准备1洗涤液的配制1.1重铬酸钾清洁液的配制1.1.1配制方法按比例称取置于特制的耐酸酸缸内（50克重铬酸钾加1000ml水），加热使其溶解，冷却后再慢慢加入工业粗硫酸（90ml粗硫酸），注意切不可将水加入硫酸中，边加边搅拌。配好的清洁液为深褐色。清洁液的配制，可分为强酸溶液与弱酸溶液（见表1.1）可视需要而选用表1.1 清洁液的配方成分强酸溶液弱酸溶液重铬酸钾（g）120g50g浓硫酸（ml）160ml90ml蒸馏水（ml）1000ml1000ml1.1.2配制清洁液的注意事项：1 戴防护面罩、手套、围裙等。2 如不慎将清

15、洁液洒出，应用沙土吸附，用塑料簸箕收起，然后用水冲洗。3 配制时切记千万不要以水加入硫酸，以防大量产热使容器爆裂而造成事故。4 一定待清洁液冷却后再放入容器中，以免热胀冷缩而使容器破裂，造成事故。1.1.3使用硫酸清洁液的注意事项：1. 硫酸为强吸水性物质，故泡酸的器皿一定要晾干，不要带水太多，这样可延长使用时间。2. 用碱处理过的器皿必须冲洗干净才可放入清洗细胞培养专用的酸缸。3. 硫酸比重大，应注意安全，不可单手握装满洗涤液的量筒等，以防掉在地上打破容器。4. 如不小心将硫酸溅到眼里，要尽快用水冲，并用眼杯装3NaHCO3溶液清洗。5. 当清洁液的颜色发绿或混浊时，说明使用过久，效力降低，

16、应重新配制。2玻璃器皿的清洗 细胞培养中，玻璃器皿的清洗是个十分重要的环节，清洗后的玻璃器皿不仅要求干净透明，无油迹，且不能残留任何有毒物质，一般玻璃器皿的清洗包括刷洗、浸酸和冲洗三个步骤。2.1刷洗将待清洗的玻璃器皿在洗涤液中煮沸30分钟后进行刷洗，刷洗时应注意二点，一是要选用软毛毛刷，刷洗时用力要轻，使用多次的毛刷要更换，防止损伤器皿表面或造成划痕；二是刷洗时不能留下死角，刷洗后，用自来水彻底冲洗，稍晾干，浸酸。2.2浸酸浸酸是将刷洗和晾干后的玻璃器皿浸泡到由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水配制的清洁液中，利用强氧化作用清除瓶皿表面可能残留的有机物，浸泡时一定要使器皿完全浸入清洁液中，器皿中不能有

17、气泡，浸泡时间4小时以上。2.3冲洗浸酸后的器皿必须用自来水冲洗干净，冲8-10次后再用一蒸水冲二次，二蒸水冲一次，整个冲洗过程应连续进行。3胶塞和塑料用品的清洗3.1胶塞新购置的胶塞有大量滑石粉应先用自来水冲洗干净后，再作常规处理。常规清洗方法是每次用完的胶塞要置入水中浸泡，然后用洗洁精或2%NaOH煮沸10分钟，自来水冲洗晾干后，再用1%稀盐酸浸泡30分钟到4小时，用自来水冲洗干净，最后分别用一蒸水和二蒸水各煮沸两次，二蒸水冲洗，晾干备用。3.2塑料用品塑料用品使用后也要用水浸洗，严防附着物干结，如残留有附着物，要即时用纱布拭掉，用流水冲洗干净后在2% NaOH溶液中浸泡过夜，自来水冲液，

18、再用1%稀盐酸浸泡30分钟，用自来水冲洗干净，最后分别用一蒸水和二蒸水冲洗，晾干备用。4清洗后物品的包装4.1目的清洗烘干后的培养物品应即时包装，以备消毒灭菌。4.2物品准备：包装常用牛皮纸、铝盒，贮槽、专用金属消毒筒等。4.3方法：对于较大的培养用品如溶液瓶、滤器等可用双层牛皮纸将瓶口紧密包起来，包好后用线绳扎紧，进行局部包装。对于小型的培养用品，如培养瓶、圆瓶、离心管、试管、吸管、培养皿、胶塞等可先装入铝盒，贮槽或专用金属消毒筒。5培养用品的消毒和灭菌5.1目的防止污染、保证实验结果的准确性。5.2方法1、物理灭菌法，包括紫外线、干热、湿热（高压蒸汽），过滤等手段。2、化学灭菌法主要指使用

19、化学消毒剂灭菌。5.3原理及用途1、紫外线是一种低能量的电磁辐射，可以杀死多种微生物。2、干热灭菌法主要用于玻璃器皿的消毒，温度180维持90分钟，才能杀死细菌芽孢，达到灭菌目的。3、干热灭菌法主要用于玻璃器皿的消毒，温度180维持90分钟，才能杀死细菌芽孢，达到灭菌目的。4、湿热灭菌法即高压蒸汽灭菌，用于布类、胶塞、金属器械、滤器、玻璃器皿以及培养用液的灭菌。5、过滤除菌是将液体用具有微孔的薄膜过滤，大多数培养用液如人工合成培养基、血清、酶溶液等，由于在高温下会发生变化，而失效，所以必须采取过滤除菌，常用的滤器有各种不同孔径的玻璃砂芯滤器。6、化学灭菌法主要指化学消毒剂。化学消毒法是利用化学

20、消毒剂消毒那些不能用物理消毒等方法进行消毒的物品和场地，如接种培养室的空间，操作台面以及操作者的皮肤。5.4具体标准及要求细胞培养实验最危险的是发生包括细菌、真菌和病毒等微生物的污染，它们都能直接影响实验结果，污染主要产生在操作者的疏忽，如培养室未定期消毒，操作台表面或周围空气不洁，培养器具消毒灭菌不彻底，或者放的用具时间过长等因素，因此细胞培养的每一个环节都要高度谨慎，认真。紫外线是一种低能量的电磁辐射，可以杀死多种微生物，主要用于培养室内空气、操作台面及地面的消毒，挂在离地10尺的高度，使得各地最少每平方尺有30微瓦特的照射，才能发挥有效作用。干热灭菌法主要用于玻璃器皿的消毒，温度180维

21、持90分钟，才能杀死细菌芽孢，达到灭菌目的。湿热灭菌法即高压蒸汽灭菌，用于布类、胶塞、金属器械、滤器、玻璃器皿以及培养用液的灭菌，实验室一般使用需求配备1-2台高压蒸汽灭菌器。培养用液、橡胶制品、滤器一般10磅15分钟，布类、玻璃制品、金属器械等一般15磅20分钟。过滤除菌是将液体用具有微孔的薄膜过滤，大多数培养用液如人工合成培养基、血清、酶溶液等，由于在高温下会发生变化，而失效，所以必须采取过滤除菌，常用的滤器有各种不同孔径的玻璃砂芯滤器。另外还有一次性滤器，品种极多，使用方便，我室目前主要使用一次性滤器。化学灭菌法主要指化学消毒剂。化学消毒法是利用化学消毒剂消毒那些不能用物理消毒等方法进行

22、消毒的物品和场地，如接种培养室的空间，操作台面以及操作者的皮肤。化学制剂包括新洁尔灭、过氧乙酸和酒精等，乳酸可用于接种培养室内和周围环境的定期空气消毒，过氧乙酸消毒能力极强，在0.5%浓度10分钟可将芽孢杀灭，可用作各种物品的表面消毒。1的新洁尔灭是细胞培养室常用的，可用于操作者的皮肤消毒，器械的浸泡，物品的清洗，操作台面的擦拭等第三章 常用实验溶液试剂的配制中南大学湘雅医院医学遗传学国家重点实验室作业指导书文件编号版本/修订号 常用实验溶液试剂的配置发布日期实施日期1目的规范试剂的配制，为临床实验的可靠性提供质量保障。2原则专人负责，一剂一皿，一配一录，双人核签。定期校对，可溯源。3性能特征

23、规范试剂的配制，为临床提供准确稳定有效的试剂，减少人为因素对临床试验结果的影响。4方法化学实验试剂的配制方法5试剂与耗材量筒、烧杯、玻棒、电子称、量杯、容量瓶、定容瓶、油纸、药勺、100ul加样枪、100ul枪头 6操作步骤6.1生理盐水准确称取氯化钠（NaCl）(生产商xxxx,批号xxxx有效期xxx)8.5 g，加二蒸水溶解定容至1L，待充分溶解混匀装瓶，贴标签（配置日期、药品名称、浓度、用途、有效期、配制双人），记录双人签名6.2 0.075M氯化钾溶液氯化钾（KCl）5.587g ，加二蒸水至1000ml，室温保存，用于细胞低渗处理。6.3 12SSC溶液 氯化钠（NaCl）105.

24、3g柠檬酸钠（Na3C6H3O75H2O） 52.94g加二蒸水至1000ml，室温保存，临用时用二蒸水稀释至所需浓度。6.4 0.25%胰蛋白酶溶液（Trypsin）胰蛋白酶粉末（1:250）250mg无Ca2+, Mg2+的PBS加至100ml先用少许消毒的PBS将胰蛋白酶粉末溶解，再补足PBS至100ml，搅拌混匀，置4冰箱4小时，用0.22um微孔滤膜除菌，分装成小瓶于-20保存，用于消化细胞。6.5 Giemsa染色液 Giemsa储备液：配制：Giemsa粉末1g加少许甘油混合研碎共计加入甘油66ml，充分混匀倒入烧杯中在55-60水浴中加热2小时冷却加入甲醇66ml，充分混合在室

25、温中静置2-3周，过滤贮存于棕色瓶中，可长期使用。6%Giemsa工作液：47ml蒸馏水中加入Giemsa储备液3ml，用于染色体标本的染色，一般染色时间为10-20分钟。6.6无钙镁离子溶液氯化钠（NaCl） 8 g氯化钾（KCl） 0.2g柠檬酸三钠（Na3C6H5O72H2O）1g磷酸二氢钠（NaH2PO4H2O）0.05g碳酸氢钠（NaHCO3）1g葡萄糖 1g依次溶于二蒸水，最后加二蒸水至1000ml，用除菌滤器除菌，保存于4冰箱备用。6.7 Hanks溶液（1） 原液甲：氯化钠（NaCl）80g氯化钾（KCl）4g硫酸镁（MgSO47H2O）1g氯化镁（MgCl26H2O） 1g氯

26、化钙（CaCl2）0.714g将氯化钙溶液于50ml二蒸水中，其它依次溶于100ml二蒸水中，两液混合，加二蒸水至500ml，加氯仿保存于4冰箱中。（2） 原液乙：磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.52g磷酸氢二钾（KH2PO4）0.6g葡萄糖10g0.4%酚红液50ml依次溶于400ml二蒸水中，加入酚红液，加二蒸水至500ml，加入氯仿，保存于4冰箱中。（3） 使用液：取原液甲25ml，原液乙25ml，加入已预先灭菌的二蒸水至500ml，分别装入溶液瓶中，以9磅高压蒸汽灭菌10分钟，冷却后，置4冰箱中保存，使用前以3.5%的NaHCO3液调pH。6.8 0.02%乙二胺四乙酸二钠溶液乙二胺四

27、乙酸二钠（EDTA） 0.1g氯化钠（NaCl） 4g氯化钾（KCl） 0.1g磷酸氢二钠（Na2HPO4H2O） 0.576g磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.1g葡萄糖 0.1g依次溶于二蒸水中，加入0.4%酚红溶液2.5ml，最后加入二蒸水至500ml，用溶液瓶分装，9磅10分钟高压蒸汽灭菌，保存于4冰箱，使用时用3.5%碳酸氢钠溶液调pH，用于分散细胞。6.9秋水仙素溶液称取2毫克秋水仙素，溶解于100 ml 0.85%的NaCl溶液中，用时最终浓度根据不同的培养材料而定，一般0.04-0.08g /ml培养液。6.10抗菌素和抗霉素溶液为了预防因无菌操作不严而发生污染，通常在培养液内加

28、入适量的抗菌素，常用的有青霉素和链霉素合用，浓度分别为50-100IU/1ml，还有放线菌素B（Actinomycin B）或制霉菌素（mycostatin）可抑制霉菌污染。组织、细胞培养常用抗生素见表3-5表3-5 组织、细胞培养常用抗生素液（引自Pollard et al. 1997）抗生素作用对象参考浓度（mg/ml）稳定性（d）二性霉素-B真菌13氨苄青霉素革兰氏阳性、阴性菌1003氯霉素革兰氏阴性菌55红霉素革兰氏阳性、支原体1003庆大霉素革兰氏阳性、阴性菌、支原体505卡那霉素革兰氏阳性、阴性菌1005制霉菌素真菌503青霉素-G革兰氏阳性菌100IU/ml3链霉素革兰氏阳性、阴

29、性菌1003利福平革兰氏阳性、阴性菌503四环素革兰氏阳性、阴性菌、支原体104* 使用表中所列出的工作浓度，可在37长时间控制轻度污染，而对细胞无毒性作用。大多数的体外培养都使用青霉素和链霉素，其它抗生素仅在特殊情况下使用。6.11小牛血清小牛的年龄约6个月，体重限于500磅以内，放血致死，取得小牛血清。6.12肝素溶液取肝素1g加无菌生理盐水2.5ml，即成4%的肝素溶液，可用于肝素化外周血培养基。而抽血时则用临床注射用肝素(每支2ml含肝素 12500U)6.13外周血细胞培养液25毫升培养瓶中加入RPMI-1640培养基4ml，小牛血清1ml，PHA适量，0.4%肝素0.05ml，双抗

30、：青霉素和链霉素，终浓度为100U/ml，用3.5%碳酸氢钠调节pH为7.2-7.4（目前实验室已采用商业化培养基）。6.14骨髓及其他悬浮细胞培养液含有20%小牛血清的RPMI1640培养基(或其他人工综合培养基)，培养基的用量可视骨髓细胞的多少而定，一般为5 ml。6.15Brdu和Frdu溶液Brdu 250g/ml 称取Brdu 62.5mg加生理盐水定容至250mlFrdu 2.6mM称取Frdu128.024mg，二蒸水溶解定容至200ml，过滤除菌，避光保存。6.1650% AgNO3称取AgNO3 5g ，HCOOH 10ul, 加去离子水至10ml6.17 卡诺固定液（甲醇:

31、乙酸=3:1）6.18 5% Ba(OH)2称取Ba(OH)2 2.5g加二蒸水50ml溶解7高分辨染色体制备试剂的配制7.1Frdu母液：准确称取5-氟脲嘧啶核苷（Frdu）粉末0.0248g，加去离子水溶解，定容至10ml，即配成10-2M的Frdu母液。过滤分装成1ml/管，-20中冻存待用。7.2Frdu工作液：准确量取已配制好的10-2MFrdu母液稀释1000倍，即配成浓度为10-5M的Frdu工作液。过滤分装，4中冷藏待用。7.3Uridine母液: 准确称取脲嘧啶核苷(Uridine) 粉末0.0246g, 加去离子水溶解，定容至10ml，即配成10-2M的Uridine母液。

32、过滤分装成1ml/管，-20中冻存待用。7.4Uridine工作液:准确量取已配制好的10-2MUridine母液加去离子水稀释100倍，即配成浓度为10-4M的Uridine工作液。过滤分装，4中冷藏待用。7.5TDR母液:准确称取胸腺嘧啶核苷（TDR）粉末0.2432g, 加去离子水溶解，定容至10ml，即配成10-1M TDR母液。 过滤分装成1ml/管，-20中冻存待用。7.6TDR工作液:准确量取已配制好的10-1M TDR母液稀释100倍，即配成浓度为10-3M的TDR工作液。过滤分装，4中冷藏待用。7.7EB 工作液:准确称取溴乙啶（EB）粉末0.05g, 加去离子水溶解，定容至

33、50ml, 即配成浓度为1mg/ml的EB溶液。过滤分装，4中冷藏待用。7.8秋水仙胺工作液: 准确称取秋水仙胺粉末0.01g，NaCl4.5g, 加去离子水溶解，定容至500ml, 即配成浓度为20g/ml的秋水仙胺溶液。过滤分装，4中冷藏待用。第四章 人体细胞培养及染色体制备中南大学湘雅医院医学遗传学国家重点实验室作业指导书文件编号版本/修订号4.1人淋巴细胞培养及染色体制备发布日期实施日期1目的规范外周血标本细胞培养及染色体制备过程，为临床外周血淋巴细胞染色体核型分析可靠性提供质量保证。2测试方法密闭式培养/手工收获3测试原理外周血中的淋巴细胞几乎都是处在G0期或G1期，一般情况下是不分

34、裂的。当在培养基中加入植物血凝素（phytohemagglutinin PHA）时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进行有丝分裂。经过短期培养后，用秋水仙素处理就可获得大量中期分裂相的细胞，制片后可以清楚地对染色体进行观察与分析。4性能特征经G显带处理后可见300-550条显带。5.样本特征及受检者准备外周血用5ml灭菌注射器吸取注射用肝素（6250U/ml）0.05 ml湿润管壁。消毒皮肤，于肘静脉采血约5ml，立即送检。6试剂人体外周血淋巴细胞培养基（必须具备三证），秋水仙素：浓度20g/ml低渗液：0.075mol/L的KCl溶液，卡诺固定液7试剂与耗材超净工作台、待检标

35、本、酒精灯，烧杯，天平，离心机，恒温培养箱，冰盒，载玻片，玻片盒，光学显微镜，灭菌注射器（5ml），离心管，无菌吸管，量筒，培养瓶，试剂瓶等。8操作程序8.1淋巴细胞培养与处理8.1.1取血：外周血用5ml灭菌注射器吸取注射用肝素（6250U/ml）0.05 ml湿润管壁。消毒皮肤，于肘静脉采血约5ml。在酒精灯火焰旁，向培养瓶内人体外周血淋巴细胞培养基中接种，外周血每瓶0.3-0.5ml（用5ml的注射器的7号黑色针头垂直滴加；男：G带：1线28滴，2线30滴；女性多种2滴）。接种后轻轻水平摇动几次混匀。8.1.2细胞培养：直立于培养箱内密闭式培养箱培养66-72小时。 外周血淋巴细胞培养环

36、境的温度为37C0.5C，且一定要以温箱内部温度为准，每隔24小时左右轻摇1次，以促进细胞生长增殖；8.1.3秋水仙素处理：培养终止前在培养基中加入浓度为20g/ml的秋水仙素0.01-0.02ml（用1ml注射器针头垂直滴加23滴），使最终浓度为0.04-0.08g/ml，37C0.5C培养箱中处理4小时；8.1.4低渗处理：秋水仙素处理完毕后，小心地从温箱取出培养瓶，用吸管吸取培养物入离心管，离心（1500rpm,10min）。然后加入37C温育的0.075mol/L的KCl低渗溶液8ml，用吸管吹打成细胞悬液，置37C水浴处理35min；8.1.5预固定：在每个离心管中加入1.5ml的固

37、定液，继续37C水浴，5-10min；8.1.6离心：1500rpm 10min，弃上清液；8.1.7 固定：在离心管中加入固定液6-8ml，立即用吸管轻轻吹打，单个细胞悬液，在37C水浴中固定5-10min后，离心，1500rpm，10min，弃上清液；再固定：重复第6步；8.1.8制片：在离心管中滴入新固定液0.2毫升，用吸管将淋巴细胞团轻轻吹打成细胞悬液，从冰箱的冷冻室内取出冰片，每片滴加悬液1-2滴，75C烤3小时；8.1.9 染色：用0.025%胰酶消化后用Giemsa染液染色（消化时间和染色时间因环境变化有差别，因此每次显带染色应进行预实验），然后用镊子夹出玻片，用自来水轻轻冲洗两

38、面，室温干燥或电吹风吹干；8.1.10镜检：待玻片干后，在显微镜下检查。先用低倍镜寻找良好的分裂相，然后用高倍油镜观察。9参考范围染色体数目：46,XN ；染色体结构：无明显结构异常10潜在变异来源1）不排除细胞培养过程中发生突变的可能性，从而导致染色体数目或结构改变，因此应严格执行1-2线平行操作，以发现因培养过程导致的结果异常。2）接种所用器皿要进行严格的灭菌处理。3）秋水仙素处理时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长。都不宜观察形态及计数。故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。4）低渗使红细胞膜破裂，淋巴细胞膨胀，低渗处理浓度及时间要适当。且低渗后混匀细胞一定要轻，否则引起膜破裂

39、、染色体散失。5）固定液应在使用前临时配制，要求新鲜，否则将形成脂类，从而影响固定效果11环境安全1)试剂中含有防腐剂和稳定剂,请勿直接接触皮肤、眼睛、黏膜，一旦接触，立即用大量清水冲洗；受检标本均应假定含有传染性病原菌，其废弃过程应遵循实验室生物安全管理程序进行处理；2)实验过程中应严格控制环境及实验仪器/设备的温度、湿度等相关条件，以确保实验条件稳定。中南大学湘雅医院医学遗传学国家重点实验室作业指导书文件编号版本/修订号4.2白血病外周血细胞培养及染色体制备发布日期实施日期1目的 反映那些病理细胞的染色体改变，为临床提供辅助诊断。 2实验方法密闭培养/手工收获。3实验原理在不受外界抗原的刺

40、激下，通过短期培养和直接制片法可以观察到血液病患者外周血中的异常肿瘤细胞的核型。4性能特征经G显带处理后可见300-550条显带5.样本类型及受检者准备外周血用5ml灭菌注射器吸取注射用肝素（6250U/ml）0.05 ml湿润管壁。消毒皮肤，于肘静脉采血约5ml，立即送检。6试剂完全培养基： RPMI-1640培养基4ml，小牛血清1ml，肝素0.05ml，双抗：青霉素和链霉素，终浓度为100U/ml，最后用3.5%碳酸氢钠调节pH为7.2-7.4；秋水仙素：浓度20g/ml，低渗液：0.075mol/L的KCl溶液，卡诺固定液，0.25% EDTA-trypsin：A液：将0.25g的tr

41、ypsin溶于100ml的PBS中， B液：另将0.02g的EDTA溶于100的PBS中，0.25% EDTA-trypsin：A:B=1:1(V/V)；10ml温育液：1ml 0.25% EDTA-trypsin、9ml 0.075 mol/LKCl。7试剂与耗材超净工作台、待检标本、酒精灯，烧杯，天平，离心机，恒温培养箱，冰盒，载玻片，玻片盒，光学显微镜，灭菌注射器（5ml），离心管，无菌吸管，量筒，培养瓶，试剂瓶等。8实验步骤8.1短期培养法8.1.1取血液病患者外周血，1640或Hanks液离心洗脱2次，去除脂肪颗粒，根据白细胞量的多少来确定接种细胞量，无菌注入装有5ml培养液的培养瓶

42、中，37培养24或48小时；8.1.2加入秋水仙素（终浓度为0.04-0.08g/ml），继续培养55分钟，收获；8.1.3将标本移入离心管，1500rpm离心10min，去上清，加入0.075mol/L的KCl ，37低渗30min；8.1.4预固定：加固定液1.5ml，轻混匀，水浴5分钟。8.1.5固定：加固定液至7ml，轻混匀，1500rpm，10min，去上清。8.1.6再固定：加固定液至7ml ，轻混匀，1500rpm，10min，去上清。8.1.7视细胞量调整悬液，滴片，烤片3小时，显带。8.2直接制备法8.2.1取1-2毫升血液病患者外周血加入RPMI-1640液或Hanks液8

43、毫升混匀离心1500rpm，10分钟洗脱2次，去除脂肪颗粒。8.2.2弃上清，加1毫升 0.25% EDTA-trypsin与9毫升 0.075 M KCl混合液至10毫升吹打混匀；8.2.3加秋水仙素（使终浓度为0.02g/ml），混匀；8.2.4放至水浴箱，37低渗30分钟； 8.2.5加1.5ml固定液预固定，水浴5分钟，轻混匀；8.2.61500rpm，室温，10分钟，去上清；8.2.7加固定液至7毫升，轻混匀；8.2.81500rpm，室温，10分钟，去上清；8.2.9重复固定一次；8.2.10视细胞量调悬液，滴片，烤片3小时，显带。9潜在变异来源1）采取标本注意抗凝，根据血象调整接

44、种密度;2）直接法主要用于急性白血病 10环境和安全控制1） 试剂中含有防腐剂和稳定剂,请勿直接接触皮肤、眼睛、黏膜，一旦接触，立即用大量清水冲洗；2） 受检标本均应假定含有传染性病原菌，其废弃过程应遵循实验室生物安全管理程序进行处理；3） 实验过程中应严格控制环境及实验仪器/设备的温度、湿度等相关条件，以确保实验条件稳定。中南大学湘雅医院医学遗传学国家重点实验室作业指导书文件编号版本/修订号4.3外周血淋巴细胞建株发布日期实施日期1目的规范外周血淋巴细胞建株操作过程，通过建立永生化大量增殖的类淋巴母细胞系，为保存家族性疾病家系成员特有的基因组资源及临床研究奠定物质基础。 2方法EB病毒转化3

45、原理3.1环孢霉素（CYA）是一种能在G0-G1期之间选择性地抑制T淋巴细胞RNA聚合酶II的免疫抑制剂，与EBV同时加入时可有效地阻止T淋巴细胞对EBV的应答反应，防止已转化的B淋巴细胞受T 淋巴细胞攻击而退化。3.2EB病毒一般感染B淋巴细胞，通过受体CD21进入宿主细胞后可自行环化以游离体的形式长期存在于宿主细胞体内，形成潜伏感染。EB病毒潜伏感染人外周血B淋巴细胞后可活化B淋巴细胞，促进静息期的B细胞转化为永生化大量增殖的类淋巴母细胞系（LCL）。4实验性能4.1EBV转化结果转化培养1周后，倒置显微镜下观察可见聚集的细胞团块，细胞透明发亮，体积明显增大，细胞外壁有不规则毛刺状突起，即

46、为淋巴母细胞样B细胞；3周后，镜下可见转化细胞克隆明显增多；1个月以后，细胞增殖旺盛，形成生长密集的大克隆，标志转化成功。 4.2冻存细胞复苏后生长情况分别于冻存10 d、1个月、3个月后进行了复苏，所有冻存后的细胞复苏成功率都为100，复苏后3d即可传代培养，镜下观察细胞形态正常，所有细胞株依然保持旺盛的增殖特性，表明成功获得永生细胞株。 4.3细胞生物学特性4.3.1染色体核型分析：采用染色体核型分析技术比较转化后永生细胞与来自同个体新鲜外周血淋巴细胞染色体的G带，未发现有任何变异，表明转化后的B淋巴细胞保留了正常的染色体核型，未发生畸变，即保留了原有细胞的遗传特性。4.3.2细胞表型分析

47、：转化后的细胞经荧光抗体CD3CD19。染色，用流式细胞仪分析，结果100表达成熟B淋巴细胞CD19。5样本类型及受检者准备 在无菌条件下采集静脉血3ml(肝素抗凝，空腹为宜)，立即送至实验室。 6仪器及耗材离心机，CO2培养箱，离心管（15ml，50ml），10ml吸管，电动枪，大中小Tip头及移液枪，25cm2培养瓶，0.22mm针式过滤器，10ml 注射器，冻存液，冻存管。7实验试剂1) 环孢霉素：用无血清培养基RPMI-1640配制成200g/ml，分装到小离心管中冻存于-20C，有效期2个月。2) EB病毒：B95-8细胞常规接种至25cm2培养瓶中培养，放置5-7 天不换液后方可冻

48、存。将细胞与培养液一起放入一次性的15ml离心管中，直接置-70C冰箱保存。使用前将其取出反复冻融三次。3) RPMI-1640培养基，完全培养基：75ml RPMI-1640 加25ml FBS， 无菌试验阴性后方可使用。4) 淋巴细胞分离液 。5) 冻存液的配制：25% FBS 1640 / DMSO =9/1（V:V）需使用前新鲜配制。8操作步骤8.1在离心管中将外周血用无血清RPMI-1640 按1:1稀释，另取一离心管，加入适量淋巴细胞分离液，然后用吸管将血液轻轻悬浮于淋巴细胞分离液上，注意不要将两者混和，比例是2:1。8.2用水平离心机于20-25C，离心2500rpm，10分钟。

49、8.3用吸管吸取淋巴细胞层到6-8ml无血清的RPMI-1640中，并轻轻吹打淋巴细胞。8.4洗脱：室温，离心1500rpm，10分钟。8.5再洗脱：去掉上清，加6-8ml无血清的1640重复步骤（4）。8.6弃上清，加2ml的25%FBS的完全培养基轻轻吹打细胞形成单个淋巴细胞悬液。8.7接种于一个25cm2培养瓶中。8.8再加入40ml环孢霉素和1.5mlEBV。8.9侧放在37C，5% CO2培养箱中开放式培养。8.10待三天后观察，如果细胞形态较好，培养基颜色变成金黄色，则细胞增殖明显，可加入0.5ml 含25%FBS 的1640于培养瓶中；如果细胞形态不好，瓶底可见一层红细胞，镜下可

50、见成堆的死细胞碎片，则需要重新做分离，重新接种培养。8.11以后每隔2-3天需观察一次，细胞处理视情况而定（原则上建株前一段时间宜缓慢加培养基，并让其液体保持偏酸性为佳）。8.12待其培养基液体增加到10-15ml，可选择半量换液，细胞密度较大时则需要传代。8.13等细胞长到50ml左右，一般以1106管冻存，复苏检测登记入库。9潜在变异来源9.1建株用的外周血淋巴细胞放置不宜超过72小时，最好时间段为12-24小时，标本可保存于室温。9.2分离淋巴细胞时，分离液和外周血不能混和，否则分离不好。9.3EBV必须效价好，放-70C保存不宜超过6个月。9.4要注意细胞的密度，2ml全血分离得到的淋

51、巴细胞加2ml培养基较宜。9.5所有试剂用品必须分两线使用，防止污染。9.6建株前期细胞生长状态的原则是耐酸不耐碱。9.7建株前期不能以肉眼或培养液的pH值来判断细胞生长状态，需要于镜下观察，防止错误判断。10环境和安全控制10.1试剂中含有防腐剂和稳定剂,不可直接接触皮肤、眼睛、黏膜，一旦接触，立即用大量清水冲洗；受检标本均应假定含有传染性病原菌，实验操作过程及废弃物处理过程应遵循实验室生物安全管理程序进行处理；10.2实验过程中应严格控制环境及实验仪器/设备的温度、湿度等相关条件，以确保实验条件稳定。 中南大学湘雅医院医学遗传学国家重点实验室作业指导书文件编号版本/修订号4.4骨髓细胞培养

52、及染色体制备发布日期实施日期1目的规范骨髓标本细胞培养流程及染色体制备过程，为临床骨髓细胞染色体核型分析提供质量保证。2测定方法5%CO2培养/手工收获。3测定原理 骨髓染色体标本制备通常用于血液病患者，特别是慢性或急性粒细胞性白血病，因为骨髓反映粒系细胞增生情况。在不受外界抗原的刺激下，通过短期培养和直接制片法可以观察到异常肿瘤细胞的核型。反映那些病理淋巴细胞的染色体改变，为临床提供辅助诊断。4性能特征经G显带处理后可见300-550条显带。5样本类型及受检者准备在无菌条件下1-2毫升骨髓加入RPMI-1640液或Hanks液8毫升于15ml一次性离心管中，立即送检。肝素抗凝。7实验耗材与仪

53、器酒精灯，烧杯，天平，离心机，恒温培养箱，冰盒，载玻片，玻片盒，光学显微镜，恒温水浴箱，记时器，灭菌注射器（5ml），离心管，无菌吸管，量筒，培养瓶，试剂瓶等。8实验试剂1) 完全培养基： RPMI-1640培养基4ml，小牛血清1ml，肝素0.05ml，双抗：青霉素和链霉素，终浓度为100U/ml，最后用3.5%碳酸氢钠调节pH为7.2-7.4。2) 秋水仙素:浓度20g/ml3) 低渗液：0.075mol/L的KCl溶液4) 卡诺固定液5) 0.25% EDTA-trypsin：A液：将0.25g的trypsin溶于100ml的PBS中B液：另将0.02g的EDTA溶于100的PBS中0.

54、25% EDTA-trypsin：A:B=1:1(V/V)6) 10ml温育液：1ml 0.25%的0.25% EDTA-trypsin9ml 0.075 mol/LKCl9实验步骤 9.1短期培养法（1） 从髂骨取骨髓液适量，1640或Hanks液离心洗脱2次，去除脂肪颗粒，无菌注入装有5ml培养液的培养瓶中，37培养24-48小时；（2） 加入秋水仙素（终浓度为0.04-0.08g/ml），继续培养55分钟，收获；（3） 将标本移入离心管，1500rpm离心10min，去上清，加入0.075mol/L的KCl ，37低渗30min；（4） 预固定：加固定液1.5ml，轻混匀，水浴5分钟；（5） 固定：加固定液至7ml，轻混匀，1500rpm，10min，去上清；（6） 再固定：加固定液至7ml ，轻混匀，1500rpm，10min，去上清；（7） 视细胞量调整悬液，滴片，烤片3小时，显带。9.2直接制备法（1） 取1-2毫升骨髓加入RPMI-1640液或Hanks液8毫升混匀离心1500rpm，10分钟洗脱2次，去除脂肪颗