分子生物学课件3Ch3.-DNA-Replication-Repair

1、Ch3. DNA Replication, Repair,3.1.复制的特点: 1. 复制机制的多样性; 方式多样:线状、环状 D-环复制，型复制，滚环复制 2. 复制的完整性； 3. DNA复制与细胞周期的协调性 （一致） 4. DNA复制的真实性 DNA复制错误率10-9 10-10 （生物进化、多 样性的来源,The mammalian cell cycle,G1,S,G2,M,G0,DNA synthesis and histone synthesis,Growth and preparation for cell division,Rapid growth and preparati

2、on for DNA synthesis,Quiescent cells,phase,phase,phase,phase,Mitosis,3.2.DNA复制反应的共同特点 1.半保留复制； 以母链为模板，合成新的互补链 2. 半不连续复制； 3. 有特定的复制起点； 复制子（复制单元） 4. 需要引物；（3-OH） 5. 复制真实性； 6. 复制叉的双向移动，DNA合成的单向延伸53 ； 8. 复制受控制,DNA replication is semi-conservative,Parental DNA strands,Daughter DNA strands,Each of the pare

3、ntal strands serves as a template for a daughter strand,DNA的半不连续复制 由于DNA的两条链为反向平行，以复制叉移动的方向为基准，一条链为3 5，其新合成的DNA链沿5 3 连续进行前导链 另一条链为5 3 ，新生的DNA链先合成短的冈崎片段，不连续合成滞后链，再由DNA连接酶连接成完整的DNA链。 这种前导链的连续复制和滞后链的不连续复制称为半不连续复制,Discontinuous synthesis of DNA,3 5,5 3,3 5,Because DNA is always synthesized in a 5 to 3 d

4、irection, synthesis of one of the strands. 5 3 .has to be discontinuous. This is the lagging strand,5 3,3 5,5 3,RNA primer,5 3,3 5,3 5,direction of leading strand synthesis,direction of lagging strand synthesis,replication fork,5 3,5,3,Movement of the replication fork,Movement of the replication for

5、k,从复制起点到终点的DNA单位复制子（复制单元,origins of DNA replication (every 150 kb,replication bubble,daughter chromosomes,fusion of bubbles,bidirectional replication,Origins of DNA replication on mammalian chromosomes,5 3,3 5,5 3,3 5,3 5,5 3,3.3.原核生物DNA的复制 1. 参与DNA复制的酶和蛋白因子 螺旋酶 （Helicase） 促使DNA在复制叉处打开双链，与单链DNA结合，与A

6、TP结合，分解成ADP+Pi，产生能量沿DNA链向前运动，促使DNA双链解开,单链DNA结合蛋白（SSBP） 与单链DNA结合，防止解开的单链重新配对形成双链或被核酸酶降解; 使单链DNA呈伸展状态，无弯曲和结节，利于作为模板； SSBP可重复使用。 形成稳定的单链构象,拓扑异构酶Topoisomerase 导入负超螺旋 引物酶 Primase 催化引物RNA分子的合成 DNA聚合酶 DNA Polymerase 特点：1. 以dNTP为前体催化合成DNA； 2. 需要模板和引物； 3. 催化dNTP加到DNA链的3-OH端； 4. 催化合成方向53,Properties of DNA pol

7、ymerases DNA polymerases of E. coli_ pol Ipol IIpol III (core) Polymerization: 5 to 3 yes yes yes Proofreading exonuclease: 3 to 5 yes yes yes Repair exonuclease: 5 to 3 yes no no DNA polymerase III is the main replicating enzyme DNA polymerase I has a role in replication to fill gaps and excise pri

8、mers on the lagging strand, and it is also a repair enzyme,all DNA polymerases require a primer with a free 3 OH group all DNA polymerases catalyze chain growth in a 5 to 3 direction some DNA polymerases have a 3 to 5 proofreading activity,DNA polymerases III,DNA连接酶 将双链DNA上的切口连接起来； 主要用于冈崎片段的连接，DNA修复

9、、重组，两个复制单元间片段的连接。 连接双链DNA的要求： 切口 3 -OH 5 -磷酸基团 需要能量,newly synthesized DNA (Okazaki fragment,5,3,5,3,DNA ligase seals the gap by catalyzing the formation of a 3, 5-phosphodiester bond in an ATP-dependent reaction,2.大肠杆菌DNA的复制过程 起始延伸终止,起始阶段,dnaA蛋白+重复序列（ 9bp ） dnaB和dnaC+重复序列（ 13bp ）结合 其它蛋白因子结合装配成全酶（引发前

10、体）+引物酶 引发体 Primosome,Initiation of DNA synthesis at the E. coli origin (ori,origin DNA sequence,binding of dnaA proteins,dnaA proteins coalesce,DNA melting induced by the dnaA proteins,B,dnaB further unwinds the helix and displaces dnaA proteins,G,dnaG (primase) binds,B,G,and synthesizes an RNA prim

11、er,RNA primer,5,3,template strand,RNA primer (5 nucleotides,Primasome dna B (helicase) dna C dna G (primase,OH,3,5,3,5,3,RNA primer,newly synthesized DNA,5,5,DNA polymerase,链的延伸 螺旋酶解开双链； 拓扑异构酶改变双螺旋数，使复制叉前进； SSBP结合，保持双链状态； DNA聚合酶 合成前导链和滞后链，前 导链引发1次，滞后链引发几次； DNA聚合酶 切除RNA引物，补齐空缺 的碱基； DNA连接酶连接冈崎片段,5 3,3

12、 5,Proteins at the replication fork in E. coli,Rep protein (helicase,Single-strand binding protein (SSB,Primasome,pol III,pol III,DNA gyrase - this is a topoisomerase II, which breaks and reseals the DNA to introduce negative supercoils ahead of the fork,3,RNA primer,5,DNA polymerase III initiates a

13、t the primer and elongates DNA up to the next RNA primer,5,5,3,5,newly synthesized DNA (100-1000 bases) (Okazaki fragment,5,3,DNA polymerase I inititates at the end of the Okazaki fragment and further elongates the DNA chain while simultaneously removing the RNA primer with its 5 to 3 exonuclease ac

14、tivity,pol III,pol I,newly synthesized DNA (Okazaki fragment,5,3,5,3,DNA ligase seals the gap by catalyzing the formation of a 3, 5-phosphodiester bond in an ATP-dependent reaction,终止 环状DNA：合成完即终止； 线状DNA：末端合成问题,Components of the replication apparatus,dnaAbinds to origin DNA sequence Primasome dnaBhe

15、licase (unwinds DNA at origin) dnaCbinds dnaB dnaGprimase (synthesizes RNA primer) DNA gyraseintroduces negative supercoils ahead of the replication fork Rep proteinhelicase (unwinds DNA at fork) SSBbinds to single-stranded DNA DNA pol IIIprimary replicating polymerase DNA pol Iremoves primer and fi

16、lls gap DNA ligaseseals gap by forming 3, 5-phosphodiester bond,复制体： 在DNA复制过程中，在复制叉附近，形成以两套DNA聚合酶全酶分子、引发体和螺旋酶构成的类似核糖体大小的复合体称为DNA复制体,回环模型： 在DNA复制叉处由两套DNA聚合酶在同 一时间分别复制前导链和滞后链，如果滞后 链模板环绕 DNA聚合酶全酶，并通过DNA 聚合酶 ，再回折与未解链的双链DNA在同 一方向，则滞后链的合成与前导链的合成在 同一方向上进行,Replisome model,Replisome in covalence elongation,3

17、.DNA复制方式： 型复制,滚环复制,许多病毒、细菌因子的复制方式,D-环复制： 线粒体、叶绿体环状DNA复制方式之一； 特点：1.以轻链为模板先复制其互补链； 2.以轻链为模板的子链继续合成，以 重链为模板开始合成； 3.复制完成。 两条链的合成不是同步的,D环复制,4. 线状DNA的复制 线状DNA复制的一个重要问题是末端RNA引物消除后如何补齐？ 形成环状DNA进行复制 -phage 形成聚合体 T7 DNA 末端形成发夹结构 痘病毒,线状DNA的不完全复制,带发夹环的线性病毒DNA的复制,不需要RNA引物的复制 腺病毒 蛋白质分子介入，进行末端的引发。 腺病毒中发现80Kd的末端结合蛋

18、白（Tp），由丝氨酸残基（Ser）的-OH基团通过磷酸二酯键与胞苷酸（C）的5-共价连接。Tp内的胞苷酸与线状DNA的3端配对，成为病毒DNA复制起始的引物，在酶作用下合成新链。 其它枯草杆菌噬菌体29中也发现了27Kd的末端蛋白,Replication of linear Adnovirus-2 DNA,IR ; including 50 bp replication origin rich AT pre-Terminal protein 80 kd TP 55 kd SSB ; S.S. DNA binding protein 72 kd Ad2 DNA polymerase ; 140

19、kd,避免5-end shortent,3 OH,5. 单链DNA的复制 单链环状DNA的复制 174 、G4、M13 复制三阶段： 将单链DNA 双链DNA（复制型DNA）； 复制足够多的双链DNA（滚环复制）； 以负链为模板，合成正链，并包装成病毒颗 粒,A蛋白参与的滚环复制,单链线状DNA的复制细小病毒,上节回顾： 1. DNA复制的特点: 2. 原核生物DNA的复制 过程 类型(双链环状, 单链环状 线状单链DNA,6. DNA复制的真实性 DNA复制错配率10-910-10，大肠杆菌染色体中有4.5106bp，每1000个细胞经过一次分裂才会插入一个不正确的碱基,维持DNA复制准确性

20、的因素： 内因： 按碱基配对原则，10-410-5 DNA聚合酶的作用 10-410-5 对碱基的识别作用； 选择正确的碱基参入到引物末端 对底物的识别作用； 先识别引物最后一个碱基是否正确，后识 别参入的dNTP是否正确 校正阅读 3 5外切酶的作用 RNA引物最终被切除，提高了复制的准确性,3 5外切酶的校正阅读,外因： 四种dNTP要平衡； Mn+2和Mg+2的比例、浓度（酶活,3.4.真核生物DNA的复制 与原核生物相似 半保留、半不连续复制 复制过程：引发延伸终止三个阶段 需要酶和蛋白因子 不同点 复制特性上 复制酶 复制过程,3.4.1.真核生物的复制特点： 1. 原核生物是单复制

21、子，真核生物是多复制子（每条染色体上有多个复制起点）； 2. DNA全部复制完毕才进行第二轮复制，原核生物在第一轮复制未完成就进行第二轮复制,3.4.2.参与DNA复制的酶： DNA聚合酶 真核生物DNA聚合酶有五种，DNA聚合酶，其中与核DNA复制有关的酶是DNA聚合酶和。其他因子可能与DNA的修复，重组等过程有关,DNA聚合酶 是DNA复制的主要酶，由4个亚基组成，分子量分别是160185kd、70kd、60kd和50kd，除具有5 3的聚合酶活性外，还有引物酶活性，是一个双功能酶，但无3 5 外切活性,停靠蛋白 DNA聚合酶中的一条70kd的多肽，把DNA聚合酶亚基和引物酶亚基连接起来的

22、蛋白,DNA聚合酶 由2个亚基组成，125kd和25kd，既具有3 5 外切酶活性，又有5 3的聚合酶活性，是前导链合成的主要酶类。 酶需要一个37kd的辅助蛋白促进酶与模板/引物相互作用。PCNA分裂细胞核抗原，它是控制细胞分裂的“细胞周期调控蛋白”的一种，研究发现，PCNA表达水平高，DNA聚合酶活性高，细胞分裂、复制旺盛,DNA聚合酶 具有象一样的3 5 外切酶活性，但不依赖于PCNA，在许多细胞中均分离得到，是DNA聚合酶中的一种酶类。辅因子： PCNA 复制因子C （RF-C） 具有ATP活性，是 酶的辅助因子 复制因子A （RF-A） 单链结合蛋白 DNA解旋酶,Propertie

23、s of DNA polymerases DNA polymerases of humans a b g d e Location nucl nucl mito nucl nucl Replication yes no yes yes (no) Repair no yes no no yes3 Functions 5 to 3 polymerase yes yes yes yes yes 3 to 5 exonuclease no no yes yes yes 5 to 3 exonuclease1 no no no no no Primase yes no no no no Associat

24、es with PCNA2 no no no yes no Processivity low high Strand synthesis lagging repair both leading repair 1 activity present in associated proteins 2 Proliferating Cell Nuclear Antigen 3involved in transcription-linked DNA repair,5 3,3 5,Proteins at the replication fork in humans,helicase,SSB,pol a,to

25、poisomerases I and II,PCNA,primase activity associated with pol a,leading strand,lagging strand,5 to 3 exo associated with the complex,pol e,3.4.3.复制过程： 以SV40 DNA的复制为例说明 SV40 猿猴空泡病毒，一种动物病毒，具有环状双链DNA与四种组蛋白组成的染色质。基因组有5243bp，除了T抗原外，SV40 DNA的复制全部依赖于宿主细胞的复制系统，因此，了解该病毒的DNA复制机制对研究真核生物DNA复制有重要的意义,复制起点：5208-

26、29的64bp的序列 40%-50% 5192-30的82bp的序列 100% T抗原结合区： I 、 、III 三个功能区：前期区、中心区和后期区， T抗原蛋白是SV40复制必不可缺的，其作用是结合起始区的三个结合位点，具有ATP酶和解旋酶活性,复制过程,T抗原识别，使AT富含区解链，形成复制叉,T抗原随复制叉向左移动至T抗原结合位点 的回文结构,DNA pol a,引物合成，向左合成的前导链延伸,合成至 区时，引发体复合物与模板结合， 合成引物，向右合成的前导链延伸,前导链合成一段后， DNA pol a脱落， pol d延伸，DNA pol a引发合成滞后链,特点： 1.T抗原的依赖性；

27、 2.从复制起始位点开始的两个方向复制并不是同时开始的,终止：由端粒酶合成末端 端粒（Telomere）：真核细胞内染色体末端的蛋白质-DNA结构，其功能是完成染色体末端的复制，防止染色体免遭融合、重组和降解 。端粒酶(Telomerase) 一种核糖核蛋白（RNP），由RNA和蛋白质两种成分组成，催化端粒DNA的合成，能够在缺少DNA模板的情况下延伸端粒寡核苷酸片段。 端粒酶中的RNA长约159bp，其中含有“CAACCCCAA”序列，能附着于DNA末端并与末端互补配对，起到模板的作用，蛋白质起到反转录酶的作用，合成末端,端粒,端粒,端粒酶一旦出问题，往往会导致疾病的发生： 端粒及端粒酶与衰

28、老有关越来越多的证据表明端粒长度控制着衰老进程，端粒缩短是触发衰老的分子钟。 端粒酶活化与肿瘤在正常的人体细胞中，端粒程序性地缩短限制了转化细胞的生长能力，这很可能是肿瘤形成的一个抑制机制,人体发育完成，端粒酶被抑制， 细胞分裂次数与端粒长短呈正比,端粒长短 端粒酶活,Harley (1989) 端粒的重复片段为探针检测,早衰性侏儒症的端粒明显较正常人短,多莉”的衰老,PCD机制、癌细胞的无限繁殖 (癌细胞中的端粒酶被激活,与复制有关的一些问题： 1.DNA复制通常从非转录区开始，向两侧进行，在转录不旺盛的细胞中，由于非转录区相对较多，DNA复制快，而在转录旺盛的细胞中，非转录区少，复制起点少

29、，复制慢。 2.核小体的组装 有人认为，细胞内有一类蛋白质能够将组蛋白转移到DNA上，进而组装成核小体。 例如 核浆素：转移H2A、H2B N1：H3、H4,DNA 复 制 速 率 及 拷 贝 数 的 调 控 ( ? !,a) 影响因素,多种专一性的蛋白质因子浓度 除引物以外的其他RNA分子（anti-RNA） 营养条件（aa starved的抑制)（原核生物） 细胞复制周期速率的影响（真核生物,b) 严格的自我调控机制,e.g. plasmid （parasite,independent replication stringent type (1-2copies) relaxed type

30、(10-100copies) incompatibility (具有相同的复制机制，酶，repressor.) compatibility (具有不同的复制机制 F, ColEI,Repressor model,Antisense RNA model,RNA-2 positive control,RNA-2,OH,RNA-2,DNA / RNA primer for DNA replication,RNA-1,110 bp,RNase H 不能识别D.S. RNA-1/RNA-2, 不能形成primer 的3-OH,RNA-2,Rom gene expression RNA-1 / RNA-2

31、 D.S. repression,RNA-1 / RNA-2,不能形成primer的 3-OH,促进,限 制,63 aa ROP (Rom protein,RNA-2 只能转录到100-220 base, 不能到达“0”原点,能形成primer 的3-OH,Checkpoints in Eukaryotic cell,3.5.RNA的复制 遗传信息DNA 有一些RNA病毒以RNA作为遗传信息的载体 RNA病毒： 正链RNA病毒 负链RNA病毒 逆转录病毒,正链RNA “+”：RNA分子本身即有编码功能， 进入宿主细胞后便可翻译成蛋白。负链RNA “-”：只有它们的互补链才有编码功能。逆转录RN

32、A,RNA的复制过程： 1.复制酶是RNA复制所必需的； 宿主细胞内的RNA不能作为模板合成新的RNA分子 病毒RNA的复制需要一种全新的酶RNA复制酶 2.RNA复制酶 （+）RNA：感染宿主后，利用宿主的翻译系统合成复制酶； （-）RNA：复制酶来自病毒,辅因子（宿主细胞蛋白） Tu、Ts因子：协助复制酶识别病毒3端的CCA-OH， 引发RNA复制开始； S1因子： 以（+）链为模板合成（-）链时需要 ， 作用：协助复制酶识别RNA上特异位点,RNA复制的特点和调节 1. 新生的RNA链与模板之间不形成双螺旋结构，只在复制生长点的末端形成一段RNA-RNA的双链区； 2. 新生成的子链又可

33、作模板生成更多的子链，（“+”链较多复制酶更容易与负链结合） 3. 调节 复制酶不但可和RNA-3端结合,合成互补RNA分子，还可以和RNA分子内部的两个位点结合： 外壳蛋白基因的结合位点 复制酶基因内的结合位点,3.6.逆转录病毒遗传信息的传递 1. 逆转录病毒RNA的结构 二倍体结构 基因组含三个结构基因： gag基因（病毒核心蛋白基因） pol基因（反转录酶基因） env基因（病毒外膜糖基因,Types and rates of mutation Type Mechanism Frequency_ Genome chromosome10-2 per cell division mutat

34、ion missegregation (e.g., aneuploidy) Chromosome chromosome6 X 10-4 per cell division mutation rearrangement (e.g., translocation) Gene base pair mutation10-10 per base pair per mutation (e.g., point mutation, cell division or or small deletion or 10-5 - 10-6 per locus per insertion generation,3.7.M

35、utation,Mutation rates* of selected genes,Gene New mutations per 106 gametes Achondroplasia(软骨发育不全) 6to 40 Aniridia(无虹膜) 2.5to 5 Duchenne muscular dystrophy(杜氏肌肉营养障碍） 43to 105 Hemophilia A（血友病） 32to 57 Hemophilia B （血友病） 2 to 3 Neurofibromatosis -1 44to 100 Polycystic kidney disease（多囊性肾病） 60to 120

36、Retinoblastoma 5 to 12 *mutation rates (mutations / locus / generation) can vary from 10-4 to 10-7 depending on gene size and whether there are “hot spots” for mutation (the frequency at most loci is 10-5 to 10-6,Polymorphisms exist in the genome the number of existing polymorphisms is 1 per 500 bp

37、there are 5.8 million differences per haploid genome polymorphisms were caused by mutations New germline mutations each sperm contains 100 new mutations a normal ejaculate（一次射出的精液） has 100 million sperm 100 X 100 million = 10 billion new mutations 1 in 10 sperm carries a new deleterious mutation at

38、a rate of production of 8 X 107 sperm per day, a male will produce a sperm with a new mutation in the Duchenne muscular dystrophy gene approximately every 10 seconds,3.8.DNA损伤及修复 自发性DNA损伤： 错配 mismatch/mispairing 互变异构现象 tautomerism 碱基“环出（looping out）” 环境因素： 化学诱变烷化剂、亚硝酸 物理因素紫外线、电离辐射,DNA损伤的化学及物理因素,互变异构

39、引起的突变,Tautomeric forms of the DNA bases,Adenine,Cytosine,AMINO（氨基,IMINO（亚氨基,Guanine,Thymine,KETO（酮式,ENOL（烯醇式,Tautomeric forms of the DNA bases,Mutation caused by tautomer of cytosine,Cytosine,Cytosine,Guanine,Adenine,cytosine mispairs with adenine resulting in a transition mutation,Normal tautomeric

40、 form,Rare imino tautomeric form,Mutation is perpetuated by replication,replication of C-G should give daughter strands each with C-G,tautomer formation C during replication will result in mispairing and insertion of an improper A in one of the daughter strands,A,C,which could result in a C-G to T-A transition mutation in the next round of replication, or if improperly repaired,C,G,C,G,and,C,G,C,G,C,A,T,A,碱基环出,Chemical mutagens 化学诱变,Deami