肠道微生物组的现代分子生物学研究方法综述

1、肠道微生物组的现代分子生物学研究方法综述引言微生物遍布于人体所有与外环境相通的器官。成人胃肠道黏膜表面积达300m2,是与外界环境接触并相互作用的最大区域，在其中定殖着约1×1014个微生物，数量是人体体细胞总数的10倍。肠道微生物参与宿主的能量吸收和储存，帮助宿主降解并吸收食物中的营养成分，还能促进免疫细胞分化与成熟、激活肠道免疫系统1-3,具有非常重要的生理意义。但是由于人体肠道复杂的厌氧环境，40%80%的肠道微生物难以在体外培养，仅凭培养手段进行微生物组研究会大大削弱肠道微生物的多样性。随着分子生物学技术的飞速发展，利用分子生物技术研究肠道微生物组的技术取得了极大的进展。掌

2、握并运用这些新技术对肠道微生物组的研究十分关键，该文主要对肠道微生物组的现代分子生物学研究方法进行总结和介绍。1传统纯培养检测方法传统微生物检测方法是用各种培养基培养分离微生物，并通过革兰染色、生物化学和血清学试验等方法来确定微生物种类，通过倍比稀释、菌落计数等方法来测定微生物数量。但由于传统微生物培养技术中，菌株的富集或衰减不可避免，原始的微生态结构被改变，这会导致研究结果存在较大偏差。Moore等4利用传统培养方法对20例男性的粪便样品中微生物种类和相对数量进行了研究，研究对象包括日本到夏威夷的6080岁的健康个体，食谱包括东西方饮食，将取到的粪便样品进行培养分析，得到1 147个纯培养物

3、，鉴定为113种不同的微生物。然而据报道，人体肠道至少存在400种微生物4,因此这种培养方法会漏掉多数的、营养条件要求更为苛刻的微生物。2传统分子生物技术2.1肠道菌群DNA提取技术从粪便样品中提取高质量的、具有代表性的肠道菌群总DNA是肠道微生物分子生物技术研究的基础。目前提取肠道菌群总DNA的方法主要有酚/氯仿抽提法、Chelex-100煮沸法、GuSCN/silica法以及一些商业试剂盒，如Fast DNA kit、QuantumPrep Aquapure Genomic DNA isolation kit、QIAamp DNA Stool Mini kit等。其 中QIAampDNA

4、Stool Mini kit的提取效果得到较多肯定。试剂盒应用方便、快捷，但价格昂贵，处理大批样品时科研成本太高。相较而言，酚/氯仿抽提法快速且成本低，适合用于肠道微生物研究中总DNA提取，尤其适合处理大批量样品。2.2构建基因文库测序技术2.2.1构建16SrRNA基因文库16SrRNA基因克隆文库通过扩增各种细菌共有基因序列片段对细菌进行定性定量分析，是一种有力的细菌学检测分析手段，现已广泛用于肠道和人体其他部位微生物多样性研究5-7,并通过该方法发现了许多尚未培养到的菌种。16SrRNA基因克隆文库技术可以分析标本中的菌群结构，反映各种细菌的相对比例及数量，具有培养法难以比拟的优势，不足

5、之处是实际操作中技术环节多、影响因素复杂、不同实验室操作条件难以标化以及对标本中的细菌数量有一定要求等。但相信随着技术的不断提高，16SrRNA基因序列分析将逐步成为微生物组结构研究的有力工具。2.2.2全基因组鸟枪测序分析技术Gill等8利用全基因组鸟枪（Shot-gun）测序技术分析了两名健康成年人粪便中的菌群，首次对人体肠道微生物多样性进行了全面的描述。Qin等9运用深度Shot-gun测序法研究发现，型糖尿病患者的肠道菌群中度失调，产丁酸盐细菌丰度降低，而致病微生物的功能增加。相较于传统的基于rRNA的研究，Shot-gun测序分析技术可以找到更多的进化标记，得到更多的菌群信息，且Sh

6、ot-gun技术不需PCR扩增，因此分析出的结果偏差较小；此外，通过序列数据分析，还可以对微生物基因表达及功能状态情况进行研究。其缺点在于微生物系统组成复杂，将大量的序列信息正确地装配成每个成员的基因组全序列，是一个较大的难题。2.3遗传指纹图谱技术构建基因文库的方法可以得到样本中的菌群种类和相对进化信息，然而，我们常需要对整个肠道微生物组进行动态监测，构建基因文库方法会显得费时、费力，不能做出快速检测，这时遗传指纹图谱技术可克服上述不足，快速灵敏地检测生态系统的动态变化。2.3.1变性梯度凝胶电泳及其衍生技术变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electroph

7、ore-sis,DGGE）技术是由Fisher等发明的，Muyzer等首次将其应用于微生物群落结构研究，随后Zoeten-dal将其用于人体肠道菌群的分析研究。后来在其基础上衍生出温度梯度凝胶电泳（temperature gra-dient gel electrophesis,TGGE）、瞬时温度梯度电泳（temporal temperature gradient gel electrophesis,TTGE）、脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electro-phoresis,PFGE）和单链构象多态性检测 （single-stranded conformational polymorphisms,SSCP）等。此后，该技术被广泛应用于消化道排泄物中微生物的分析10-11.DGGE及其衍生技术既可以对比分析不同的微生物群落