玉米遗传转化体系的优化及HrpZ基因转化玉米的研究

1、玉米遗传转化体系的优化及HrpZ 基因转化玉米的研究HrpZ 基因是一种来源于植物病原菌丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的蛋白激发因子 , 它能引起非寄主植物的过敏性反应(hypersensitive response,HR), 表现为受侵染组织的快速、局部的萎缩和死亡, 这就限制了病原菌进一步扩散的可能性。 HR反应后 , 植物体内出现了一系列的防反应, 如强化结构屏障作用 ,合成裂解酶或者产生植物抗毒素, 具体表现在能够防止病菌二次或继发性侵染。这种非局部化、长期的诱导保护作其抗菌谱很广, 极类似于“系统获得性抗性” (systematic acquired res

2、istnace SAR)。玉米 (Zea may L.) 是世界上重要的粮食、饲料作物 , 也是现代食品工业、医药工业和化学工业的重要原料。产量居农作物之首 , 也是重要的遗传模式植物。 长期以来 , 玉米优良基因型高效再生体系的建立一直是人们研究的热点。我国是世界上仅次于美国的第二大玉米生产国, 玉米生产在国民经济中占有非常重要的地位。然而 , 生产上玉米病害一直是影响玉米产量的重要限制因素,传统的常规育种由于抗源的缺乏和不同物种间的遗传隔离, 使抗病育种工作受到了极大的限制。利用基因工程技术进行玉米遗传改良, 增强玉米抗病虫和耐逆境能力, 提高产量 , 改善品质 , 是玉米遗传育种的一个新

3、方向。因此, 玉米的基础研究和遗传改良具有重大的理论和现实意义。为进一步筛选和建立优良玉米自交系的再生和遗传转化体系, 本文分别以玉米幼胚 , 成熟胚 , 茎尖 , 根尖及幼叶为外植体进行愈伤诱导, 较系统地研究了常规优良自交系的愈伤组织形成及分化再生的影响因素、农杆菌介导遗传转化体系,并对转化株进行了PCR检测 , 获得了如下主要结果： 1. 选用了生产上广泛应用的10 个玉米优良自交系 , 通过组织培养研究其愈伤诱导及植株再生情况, 并优化了玉米愈伤诱导及再生的条件, 为开展转基因育种提供了技术基础。 结果表明 , 玉米自交系基因型间的培养能力具有较大的差异,10 个玉米自交系幼胚都能诱导

4、出初级愈伤组织 , 但是形成胚性愈伤组织的能力上具有很大的差异, 其中仅 6 个自交系： H99,丹 988, 铁 7922,1322,7319 和 PH4CV能形成胚性愈伤组织；以实验室多年来筛选的优良自交系H99,丹 988 和铁 7922 的幼胚 , 成熟胚 , 茎尖 , 根尖及幼叶为外植体诱导愈伤 , 实验证明 , 根尖和幼叶只能诱导出初级愈伤。三个基因型中仅丹988 的幼胚 , 成熟胚 , 茎尖能够诱导出胚性愈伤组织, 可见丹 988 为愈伤诱导的优良自交系。 此外 , 适当浓度的 6-BA 仅能提高茎尖的愈伤诱导率 , 培养基种类 , 胚龄 ,4 冷存时间 , 不同附加物 KT,C

5、aCl2, AgNO3 的添加对幼胚来源的愈伤也有一定的影响。2. 采用正交试验法 , 选用丹 988 的茎尖来源幼胚为受体材料 , 以pCAMBIA1301-HrpZpsta和 PCAMBIA3301-HrpZpsta为表达载体 , 对农杆菌转化中的菌液 OD值、侵染时间、共培养时间和 AS浓度四因素进行了优化。 确定了农杆菌介导的转化体系的最优条件为菌液OD值 0.6 、浸染时间 20mi n 、共培养时间2d 和 AS浓度 300mol/L 。此外 , 鉴定了 H99和月 988 的玉米愈伤组织耐盐碱敏感性和抗草胺磷敏感性,确定玉米愈伤组织盐和草胺磷临界浓度；茎尖来源的愈伤组织的抗性愈伤率, 再生率及转化率均略高于幼胚, 显著高于成熟胚。将含有 HrpZ 基因的重组质粒经农杆菌介导法转化玉米愈伤, 经 PCR检测共获得 H99 抗盐植株 18 株, 抗草胺磷植株10 株, 丹 988 抗盐植株 12 株, 抗草胺磷植株 5 株。但并未收获 T1 代果实。 3. 对花粉管通道法的外源DNA导入时期