肠道营养干预管理论文

1、肠道营养干预管理论文【摘要】目的研究早期肠道营养对血清肿瘤坏死因子(TNF-)和氧自由基水平的影响以及对机体的保护作用，为临床烧伤患者早期肠内营养支持治疗提供依据。方法建立Wistar大鼠重度烧伤模型。随机将烧伤大鼠分为禁食组(n=10)和早期肠内营养组(早期营养组n=10)，另设未烧伤的对照组(n=10)。禁食组和早期营养组于烧伤后48h内分别给予腹腔注射平衡液和胃灌注营养制剂，均为30ml/(kg次)，每6h一次；其后自由进食至实验后第7天。统计各组死亡率；检测各组大鼠6、12、24、48h及第7天时TNF-及氧自由基；电镜下观察创面成纤维细胞；苏木精-伊红染色观察肝细胞变性情况。结果禁食

2、组、早期营养组和对照组的死亡率分别为80%、30%、0。与对照组相比，禁食组大鼠血清TNF-和丙二醛(MDA)水平明显升高，而超氧化物歧化酶(SOD)水平明显下降(P 【关键词】烧伤；氧自由基；肿瘤坏死因子；肠内营养 StudyoftheexpressionofTNF-,oxygenfreeradicalandtheeffectsofearly enteralnutritioninterventioninratswithsereveburninjury LIZhihua1,LIXiangnong2 (1.DepartmentofBurnsandPlasticSurgery,Affiliated

3、HospitalofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou, Jiangsu221002,China;2.DepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege) Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectofenteralfeedingatearlystageontheexpressionofTNF-andoxygenfreeradical(OFR)andtheprotectiveeffectsontheorganism,soastoprovidetheexp

4、erimentalbasisofclinicaltherapyofenteralfeedinginpatientswithsevereburns.MethodsThesevereburnmodelwasestablishedwithWistarrats.BurnedWistarratswererandomlydevidedintofastinggroup(n=10)andearlyenteralnutritiongroup(n=10)tocomparewiththecontrolgroup(n=10).Theratsinthefastinggroupandearlynutritiongroup

5、weregivenintraperitonealinjectionofbalanceliquidandgastricclysisofnourishmentproductrespectively,30mlevery6hwithin48hafterburninjury.Subsequently,theratswereallowedaccesstofoodadlibitumuntil7thdayandthemortalitiesofthethreegroupswerecalculated.TheexpressionofbloodTNF-andOFRofthethreegroupsat6,12,24,

6、48,72handon7dweredetected.ThefibroblastsinthewoundwereobservedundertheelectronmicroscopeandthedenaturalizationofhepatocyteswasobservedbyH-Estainingunderthelightmicroscope.ResultsThemortalityoffastinggroup,earlynutritiongroupandcontrolgroupwas80%,30%and0,paredwiththecontrolgroup,thelevelofTNF-andmalo

7、naldehyde(MDA)obviouslyascended,whilethelevelofsuperoxidedismutase(SOD)obviouslydescendedinthefastinggroup(P Keywords:burn;oxygenfreeradical;tumornecrosisfactor-;entericnutrition 本实验应用重度烧伤大鼠模型，探讨早期肠内营养对肿瘤坏死因子(TNF-)表达和氧自由基产生的影响以及早期肠内营养对重度烧伤机体的保护作用，为临床重度烧伤患者的早期肠内营养(EN)治疗提供理论依据。 1材料和方法 1.1实验动物及试剂Wistar

8、大鼠30只，雌雄不拘，体重（22020）g，购于徐州医学院实验动物中心。大鼠饲养于恒温(2225)、恒湿的SPF（specificpathogenfreecondition）层流罩中，经高压灭菌的标准饲料和水供动物自由饮食。动物实验根据NIH实验动物的护理和使用指导说明实施。 主要试剂包括TNF-ELASA试剂盒（北京帮定泰克公司）,超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒（南京建成生物工程研究所）。主要仪器及设备有普通光学显微镜（Olympus公司）、TGL-16B台式离心机（上海安亭科学仪器厂）、H-600型透射电镜（日立公司）、Spectrumlab22pc型分光光度计（上海棱光

9、技术有限公司）及BIO-RAD550型酶标仪（美国BIO-RAD公司）。 1.2模型制备大鼠术前一天禁食过夜。2.5%戊巴比妥钠35mg/kg腹腔注射麻醉，将大鼠固定于操作板上，8%硫化钠制剂背部脱毛。3%凝固汽油涂抹背部燃烧18s致约30%烧伤体表总面积（TBSA）深度烧伤(病理证实)。拟烧伤面积按下列公式计算：烧伤面积(cm2)体表面积(cm2)拟烧伤面积百分比(%)，体表面积(cm2)K体重(kg)2/3，K0.1)。烧伤后立即予腹腔注射平衡液50ml/kg复苏。更换垫料，单笼饲养。 1.3动物分组及处理将20只烧伤大鼠随机分为禁食组（n=10）及早期肠内营养组（早期营养组，n=10）。

10、禁食组伤后2h开始腹腔注射5葡萄糖盐液30ml/(kg次)，每6h一次。早期营养组伤后2h开始胃灌注，30ml/(kg次)，每6h一次，所灌注的肠内营养制剂为能全力荷兰Nutricia公司产品：4.18103kJ/L，总热量752.4kJ/(kgd)，非蛋白热量氮（NPCN）为1331。上述2组于伤后48h停止腹腔注射平衡液或胃灌注，自由进食。另设未烧伤大鼠10只为对照组，该组于整个实验期间均自由进食。3组共喂养7天，7天后颈椎脱臼法处死取样本。 1.4观察指标 1.4.1大鼠死亡情况记录各组死亡大鼠死亡时间及数量。 1.4.2血清TNF-及氧自由基检测各组大鼠在伤后6、12、24、48h及7

11、天时内眦静脉取血0.5ml，1000r/min离心5min，取上清，-20保存，试剂盒检测。中途死亡大鼠的标本弃之不用。 1.4.3肝组织切片苏木精-伊红染色检查分别于第7天末，肝脏活体取材，利刃楔形切取少许肝组织固定于40g/L甲醛中，石蜡包埋，切片厚4m，行苏木精-伊红染色，切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水等处理后中性树胶封片，显微镜下观察。 肝脏脂肪变性的严重程度评估：根据肝细胞脂肪变性在肝脏的累及范围将脂肪肝分为轻、中、重度。轻度：光镜下（400）每视野见1/31/2的肝细胞内含有脂滴。中度：每视野见1/22/3肝细胞有脂肪变性。重度：每视野2/3以上肝细胞发生脂肪变。 1.4.4创面组

12、织电镜观察动物处死后剪取小块烧伤创面组织放于下置有冰块的蜡板上，其表面滴4预冷的3戊二醛，用双面刀片常规双向切割创面组织成1.0mm1.0mm1.0mm大小的组织块；浸入4预冷的3戊二醛固定2h后过夜；然后脱水、包埋、超薄切片，醋酸双氧铀和枸橼酸双重染色。上透射电镜观察，拍照。 1.5统计学处理SPSS11.0统计软件进行数据处理，计量资料以s表示，组间比较分别用用单因素方差分析（ANOVA）检验、秩和检验和Fishers确切概率法。P 2结果 2.1动物模型和动物死亡率动物模型的烧伤面积为（301）%TBSA。经病理证实，均为深度烧伤。 对照组大鼠麻醉清醒后活动正常。禁食组及早期营养组均出现

13、较为明显的感染症状，包括创面毁损、出血和脓性分泌物，大鼠的毛发无光泽并且有不同程度的脱落。对照组无死亡，禁食组于制模24h后4例死亡，早期营养组制模24h后1例死亡。7天后禁食组总死亡为8只，早期营养组总死亡为3只。见表1。表1各组大鼠死亡情况 2.2血清TNF-变化模型制成后6h，禁食组及早期营养组血清TNF-较对照组明显升高，12h达到高峰，之后开始下降，但第7天时TNF-水平仍高于制模后6h。早期营养组各时间点TNF-水平均低于禁食组（P0.05），且于伤后12h差异最大（P0.05）。见表2。 2.3血清自由基的检测模型制成后6h，禁食组及早期营养组血清SOD较对照组显著降低，至第7天

14、2组血清SOD水平仍维持在较低水平；禁食组各时间点的SOD水平均显著低于早期肠内营养组（P0.05）。上述2组血清MDA水平于伤后6h显著升高，至24h达到高峰，随后开始下降；禁食组血清MDA水平在48h、7天时明显高于早期营养组（P0.05）。见表3、4。表2各组大鼠血清TNF-水平的变化与对照组比较：*P0.05；与禁食组比较：#P0.05表3各组大鼠血清SOD水平的变化与对照组比较：*P0.05；与禁食组比较：#P0.05表4各组大鼠血清MDA水平的变化与对照组比较：*P0.05；与禁食组比较：#P0.05 2.4肝组织光镜检查见图1。禁食组大多数见广泛且较严重的肝细胞混浊肿胀、胞质疏松

15、、气球样变、嗜酸性变及脂肪变性；部分肝细胞有坏死。肝细胞脂肪变性以小泡性脂肪变为主，主要分布于肝腺泡区和区，严重者脂滴弥散性分布累及肝腺泡区。坏死肝细胞多位于肝小叶中央和中间带，呈桥接样坏死或大块性分布。坏死灶内的肝细胞见核固缩、核碎裂或核溶解，胞质嗜酸性增强或含色素颗粒；坏死灶内或其周围有明显的库普弗细胞增殖，其胞质丰富、嗜碱性，有不同程度的吞噬现象。肝窦内常见数量不等的各类型炎细胞，包括中性白细胞、单核细胞、淋巴细胞及坏死细胞(图1b)。 早期营养组肝细胞也有轻度的混浊肿胀及胞质疏松,肝窦内有少量炎细胞浸润。肝小叶脂肪变性范围较小,表现为散在性或小灶状肝细胞脂肪变性，主要分布于肝腺泡区和区

16、，累及整个小叶者少见。部分肝窦内有散在的坏死细胞(图1c)。 2.5创面组织成纤维细胞电镜观察早期营养组细胞明显肿胀，胞质空淡，核周围间隙增宽，核仁浓缩或边集，并可见核膜内陷，形成核内小管及核内假包涵体。细胞凋亡并可见凋亡小体。常染色质减少，图1各组大鼠肝组织病理检查结果比较 （苏木精-伊红染色，400） a.对照组：正常肝组织；b.禁食组：重度脂肪变性;c.早期营养组：轻度脂肪变性 异染色质边集。胞质内空泡形成,溶酶体增多，可见数量不等的圆形、低电子密度的脂肪空泡及肿胀、脱落的微绒毛。线粒体肿胀，嵴缩短、减少或消失，基质透明，甚至空化成囊泡状；少部分线粒体则固缩，基质电子密度增加而均质化。粗

17、面内质网增生、肥大或呈扁囊状、囊泡状扩张；增生的内质网密集成片，形成指纹状结构或围绕着变性的线粒体(图2a)。 禁食组细胞体积增大，胞质疏松化，或胞质空淡；核膜完整，边集。可见粗面内质网代偿性增生、扩张；线粒体轻度肿胀，基质浅淡，嵴模糊；细胞内脂肪空泡体积小，溶酶体、髓样小体数量多(图2b)。 3讨论 3.1烧伤动物模型的特点与死亡率本实验中采用凝固汽油造成的30%TBSA深度烧伤模型，具有以下特点：用创伤单相打击，较好地模拟了临床上全身炎症反应综合征（SIRS）及单相速发多器官功能不全综合征（MODS）的发病过程；器官功能不全发生率高，有一定动物死亡率；重复性好；所用动物大鼠相对价廉易饲养，

18、且检测各项指标的试剂和仪器最齐全。 本实验中禁食组及早期营养组于术后24h均出现较为严重的感染症状，包括创面毁损、出血，大鼠的毛发无光泽并且有不同程度的脱落等。2组大鼠于术后24h相继出现死亡，但早期营养组在24h、48h、7天3个时间点上的死亡数及死亡率均低于禁食组，提示早期肠内营养有利于提高烧伤后生存率。本实验中早期营养组和禁食组的总死亡数（分别为3只和8只）差别较大。 3.2局部创面变化创面愈合过程涉及一系列快速增长的细胞群，这些细胞群一旦完成了修复任务，就必须从创面消除，从而进入愈合过程的下一阶段。文献报道，在创面愈合过程中，生长因子减少或消失，可诱发生长因子依赖的成纤维细胞发生凋亡1

19、。 表皮细胞生长因子（EGF）、TNF、前列素（PGE2）等均能促进细胞凋亡2-3，而这些因子和介质恰恰以较高的含量存在于创面微环境中3-4。Desmouliere等2利用末端标记技术证实伤口愈合后期，功能活跃的修复细胞以细胞凋亡形式消退，因而使修复细胞数量减少。深度烧伤往往导致真皮的严重损伤，其愈合主要依赖于创面形成肉芽组织支架，并在此基础上借助于创面残存附件上皮及创周表皮的增殖爬行覆盖创面。胶原蛋白和成纤维细胞均为肉芽组织的主要成分；胶原蛋白在创面的沉积主要依靠成纤维细胞的合成与分泌，并主要与成纤维细胞的数量相关。 因此，成纤维细胞凋亡是创面进入愈合期的标志。Darby等5报道在创面闭合早

20、期，创面内的肌成纤维细胞就发生凋亡，并且该作用对靶细胞是持续的。本实验中，早期营养组成纤维细胞体积变小，呈现核固缩、染色体沿核膜聚集及胞质减少等退行性变细胞凋亡的表现，并可见凋亡小体；而禁食组成纤维细胞体积增大，胞质疏松化、空淡，核膜完整，边聚。可见早期营养组创面进入愈合期较禁食组早，提示早期营养有促进创面早期愈合的作用。 3.3肝脏病理研究的结果和意义烧伤主要死因是MODS，其发病机制公认为是严重烧伤后过度应激，发生SIRS。肠黏膜正常结构和功能的维持是肠道正常吸收和屏障功能的基础。烧伤时，肠黏膜损伤，通透性增强，导致内毒素、细菌、细胞碎片等刺激肠相关淋巴系统，使肠黏膜成为大量炎性细胞因子的

21、早期释放器官；随着肠黏膜通透性进一步增高，大量内毒素、细菌、细胞碎片进入肝脏，激活肝脏巨噬细胞系统，成为SIRS的主要原因6-7。一般认为，微循环障碍、严重感染和肠道细菌与内毒素移位是导致SIRS及MODS的机制8。而肝脏作为人体最大的化工厂和血库，在上述3种病理生理改变中起着关键的作用。 本实验试图通过对肝细胞病理变化的观察，从一个侧面了解早期肠内营养对重要器官的干预结果。实验结果显示：早期营养组与禁食组均出现不同程度的肝细胞脂肪变性，但早期营养组脂肪变性程度较禁食组轻，2组间比较差异有统计学意义。这一结果显示：烧伤早期肠内营养的干预可以显著减轻肝脏的病理损害，可能有助于抑制SIRS及MOD

22、S的发生作用。 3.4细胞因子和氧自基的变化和意义TNF可刺激外周血多形核白细胞（PMN）生成、释放和趋化反应，并活化产生大量毒性产物损伤组织细胞9。TNF对内皮细胞具有直接毒性，如作用于内皮细胞，使其表面成为促凝性致血栓形成；或使内皮细胞分泌递质而使PMN黏附、活化。TNF又可作用于肝细胞抑制白蛋白的生成和促进某些急性期蛋白合成10。本实验观察到伤后6h血清TNF即显著增高，至12h达到高峰。虽然随后有所下降，但至7天时仍高于正常值，提示烧伤后有大量TNF产生；其产生机制可能与严重烧伤后发生的体液大量丢失或严重休克造成的组织缺血缺氧、坏死组织的大量产生、某些递质如补体的活化以及应激反应等有关

23、11，因为这些因素均可激活单核巨噬细胞系统(MPS)，从而使TNF大量产生。 3.5早期肠内营养严重烧伤后机体缺血/再灌注损害可生成大量氧自由基,后者可导致血管内皮细胞损害，使毛细血管通透性明显增加12。由于肠黏膜上皮细胞富含黄嘌呤氧化酶(xanthineoxidase，XO)，当肠黏膜发生缺血/再灌注后，将产生大量来源于黄嘌呤氧化酶系统的氧自由基，后者能攻击生物膜磷脂中的多不饱和脂肪酸(PUFA)，形成脂质自由基和脂质过氧化物13。本实验中我们观察到早期营养组SOD高于禁食组，而MDA则低于后者，提示早期肠内营养对抑制烧伤患者氧自由基的产生具有积极作用。 在重危感染患者，肠内营养的药理作用大

24、于其营养作用。EN之所以能改变疾病的治疗效果，不仅是由于纠正患者的营养不足，更重要的是通过其中特异营养素的药理学作用达到治疗目的，如一些营养物质能以某种特定方式刺激免疫功能,恢复免疫反应，调控细胞因子的产生及释放，维护肠道功能，即营养药理（nutritionalpharmacology）或免疫营养（immunonutrition）作用。有研究表明14只要提供不低于所需总热量20%的肠内营养就可避免肠道屏障功能的破坏与肠道细菌移位。 本研究结果显示，烧伤后早期肠道营养可降低血中TNF-和氧自由基水平、促进烧伤创面愈合并减轻内脏器官如肝脏的损伤，其机制尚不完全清楚。推测早期肠内营养有利于烧伤后整体

25、调节和肠道的局部调节，既可以减轻应激、保护肠道黏膜、增加内脏血流量、减轻氧自由基损害，又可调理免疫和代谢，使营养支持更有效。 【参考文献】 1陈意生，史景泉，吴军，等.严重烧伤后输液对多器官功能障碍综合征的病理组织学和超微结构变化的影响J.中华烧伤杂志，2002，18（1）:25-27. 2DesmouliereA,RedardN,DarbyI,etal.ApoptosismediatesthedecreaseincellularityduringthetransitionbetweengranulationtissueandscarJ.AmJPathol,1995,146(1):56-66.

26、 3PanMH，LinJH，LinShiau-SY，etal.Inductionofapoptosisbypenta-O-galloyl-beta-D-glucosethroughactivationofcaspase-3inhumanleukemiaHL-60cellsJ.EurJPharmacol，1999,381(2-3):171-183. 4刘毅,陈璧，贾赤宇,等.小鼠深烫伤创面愈合过程中成纤维细胞凋亡的意义J.第四军医大学学报，1999，20(5):455-456. 5DarbyIA,BisucciT,PittetB,etal.Skinflap-inducedregressionofgranulationtissuecorrelateswithreducedgrowthfactorandincreasedmetalloproteinaseexpressionJ.JPathol，2002，197(1):117-127. 6汪仕良，黎鳌，尤忠义，等.肠源性高代谢与早期肠道营养研究烧伤引发肠源性高代谢J.普外临床杂志，1