拟南芥蛋白质二硫键异构酶(AtPDI1)活性位点对抗逆功能的影响

1、拟南芥蛋白质二硫键异构酶（AtPDI1 ）活性位点对抗逆功能的影响蛋白质二硫键异构酶（ protein disulfide isomerase,PDI）可以催化二硫键异构化、氧化及还原 , 也往往具有分子伴侣功能。来源于不同动、植物的PDI的活性中心都有2 对保守半胱氨酸（ Cys） , 突变后造成催化活性丧失, 但不影响PDI 的分子伴侣功能。前期研究表明体外重组表达的拟南芥AtPDI1 具有二硫键异构酶活性 , 且能提高大肠杆菌细胞的抗逆能力。为了探究AtPDI1 在植物体内是否有抗逆功能且是否与其二硫键异构酶活性有关, 本研究将编码 AtPDI1 活性位点的 Cys序列进行了突变 , 并

2、回补拟南芥 AtPDI1 缺失突变体（pdi ）, 研究不同株系对非生物胁迫的响应 , 主要研究结果如下 : （1）突变 AtPDI1 活性中心半胱氨酸位点的编码序列,构建表达载体并转化拟南芥pdi, 获得 T3 代纯合转基因植株。将编码 AtPDI1 活性位点的 Cys（ Cys128/Cys131、Cys467/Cys470）的密码子进行突变 , 得到两个突变体 AtPDI1, 即 PDI1C128AC131A和PDI1C467AC470A,用 PDI1m1和 PDI1m2表示。将之前构建的野生型AtPDI1 及 PDI1m1和 PDI1m2转化拟南芥 pdi, 通过抗生素筛选、外源基因P

3、CR鉴定 , 在 T3代获得纯合的转基因株系 , 分别表示为 pdi-PDI1m1 、pdi-PDI1m2 和pdi-PDI1 。（2）AtPDI1 活性半胱氨酸位点突变影响了种子萌发阶段对胁迫的耐受性。对上述 3 个株系及野生型拟南芥（WT）、AtPDI1 超表达株系（ WT-PDI1）及 pdi进行不同的处理 , 在非胁迫培养下 , 不同株系的萌发率及萌发速度基本一致, 但胁迫培养下（培养基分别含有NaCl、甘露醇、H2O2和 ABA）,各株系的萌发差异明显 ,pdi-PDI1m1 和 pdi-PDI1m2 的萌发率明显低于pdi-PDI1,pdi-PDI1的萌发率与 WT相似 , 但低于

4、超表达株系WT-PDI1;胁迫条件下根长的差异与萌发率有相似的趋势。（3）AtPDI1 活性半胱氨酸位点突变也影响了幼苗对胁迫的耐受性。对苗期的不同 AtPDI1 株系进行胁迫处理 , 结果表明盐胁迫、 渗透胁迫、低温和高温处理后 ,pdi-PDI1m1 、pdi-PDI1m2 和 pdi 突变体均表现出较低的胁迫耐受性 , 与 WT、pdi-PDI1 和 WT-PDI1相比 , 生长缓慢 , 存活率较低 ;WT-PDI1 抗性最强 ,pdi-PDI1 与 WT较为接近 , 说明野生型 PDI1 可以回补 pdi功能的缺失 , 而保守半胱氨酸突变之后则不能回补pdi 功能的缺失 , 表型与 p

5、di相似 , 抗逆能力降低。（4）AtPDI1 抗逆功能与 ABA信号途径有关。利用qRT-PCR技术对 ABA合成有关的基因（ NCED3、 ABA1、 ABA2）的表达量进行检测 , 发现盐胁迫下pdi-PDI1m1 、pdi-PDI1m2 与 pdi 突变体的上调倍数差异不大 , 但明显低于 pdi-PDI1 、WT和 WT-PDI1;盐胁迫也影响了ABA信号转导途径相关基因（ RD29A、KIN1、AnnAt）的表达 , 不同株系变化趋势的差异与ABA合成有关的基因类似。说明 AtPDI1 提高植物的抗逆能力与ABA合成和其信号途径有关 , 且保守 Cys对 AtPDI1 功能的发挥起重要作用。（ 5）AtPDI1 活性位点突变影响了植物体内ROS清除能力。对盐和渗透胁迫处理后的ROS积累量进行了 NBT染色检测 ,pdi-PDI1m1 、pdi-PDI1m2 与 pdi 的染色程度最深 ,说明其 ROS积累多 ;pdi-PDI1与 WT的染色次之 , 但重于 WT-PDI1的染色。各株系活性氧清除相关基因SOD、 POD、CAT和 APX的表达与 ROS的积累相反 ,WT-PDI1表达量上调倍数最多 , 而 pdi-PDI1m1 、pdi-PDI1m2 与pdi