携带β-内酰胺酶肠杆菌科细菌的耐药分子机制研究

1、携带 - 内酰胺酶肠杆菌科细菌的耐药分子机制研究背景肠杆菌科细菌尤其大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌是医院和社区感染的常见病原体 , - 内酰胺类抗生素是治疗肠杆菌科细菌感染的最常用药物。不同国家和地区的 - 内酰胺耐药菌株的流行特征往往有较大差异, 研究这些菌株的临床特点和耐药分子机制 , 对医院感染控制有重要的意义。目的深入研究我院 - 内酰胺耐药肠杆菌科细菌的临床特点和耐药分子机制,为临床相关疾病的抗感染治疗提供实验依据。方法收集 2010-2015 年广州医科大学附属第一医院临床肠杆菌科细菌, 用 SPSS软件对临床数据进行统计分析, 用多重 PCR法检测 - 内酰胺酶基因和质粒类型。使用双纸

2、片协同试验测定肺炎克雷伯菌KP01的超广谱 - 内酰胺酶 (ESBL)表型 , 用多重 PCR法确定 KP01携带的 - 内酰胺酶基因 , 用细菌接合试验和电击转化试验进行质粒的转移。 使用生物细菌基因组DNA提取试剂盒进行肺炎克雷伯菌KP01和大肠埃希菌 HX43的 DNA提取 , 并用 IlluminaMiseq 高通量测序仪进行高通量测序。使用 Edena、RAST、ResFinder 、 PlasmidFinder 、MLST和 NCBIBlast等进行生物信息学分析。结果 2010-2015 年间共收集 5829 株肠杆菌科细菌 , 其中 4474株 (76.8%) 为 - 内酰胺耐

3、药菌 , 主要分离自尿液 (50.8%) 和痰液 (20.9%), 病区来源主要为泌尿外科 (27.6%) 和重症病区 (11.9%), 细菌种属以大肠埃希菌 (45.5%)和肺炎克雷伯菌 (35.6%) 为主。这些菌株对氨苄西林、 头孢曲松、头孢吡肟、 亚胺培南和厄他培南的敏感率分别为 0%、36.7%、 71.9%、96.4%和 95.2%, 对非 - 内酰胺类抗生素也呈现不同程度的耐药。 - 内酰胺酶基因检测显示blaTEM、 blaCTX-M和 blaSHV 为主要的 - 内酰胺酶基因型 , 质粒分型则以 IncF 为主。肺炎克雷伯菌 KP01分离自一位老年重症肺炎患者, 呈现对多种药

4、物的耐药性 ,PCR检测发现其同时携带 blaCTX-M-24、blaSHV-11 和 blaGES-5 - 内酰胺酶基因。这是国内首次发现携带 blaGES-5 的肠杆菌科细菌。blaGES-5 基因只能通过电击转化进行转移 , 可见 blaGES-5 基因定位在不可接合的质粒上。携带 blaGES-5 的转化子对 - 内酰胺类药物的 MIC 值显著提高。高通量测序获得覆盖度为167.7 倍的测序深度 , 数据拼接后获得 500 bp 以上contig共 99 条。耐药基因分析发现KP01携带 - 内酰胺酶耐药基因3 个(blaGES-5,blaSHV-11 和 blaCTX-M-24),

5、氨基糖苷类耐药基因3 个 (aadA2,strA和 strB),磺胺类耐药基因1 个 (sul2),甲氧苄啶耐药基因1 个(dfrA12),四环素耐药基因有 1 个 (tetA) 。MLST分析发现 KP01属于 ST895。blaGES-5 被发现定位于一个约28.5 kb 的质粒 pGES-GZ上 , 该质粒的复制相关基因与非发酵菌质粒有高度同源性(99%)。对 blaGES-5 基因环境研究发现它定位于一个新型的1 类整合子中 , 该整合子缺乏 3保守区域 (3 CS)结构 , 携带 blaGES-5 和两个序列完全一致的orf28 基因。大肠埃希菌 HX43分离自一位儿科重症肺炎患者,

6、 该菌株除对碳青霉烯类敏感外 , 对其他临床抗生素均耐药。高通量测序获得覆盖度为142 倍的测序深度 , 数据拼接后获得 500 bp 以上contig共 169 条。耐药基因分析发现多种抗生素耐药基因, 包括 - 内酰胺类(blaCMY-42,blaCTX-M-14 和 blaOXA-30) 、氨基糖苷类 (aac(3)-a,aadA5,strA,strB和 aac(6 )-Ib-cr)、喹诺酮类 (aac(6 )-Ib-cr)、大环内酯类 (erm(B) 和 mph(A) 、氯霉素类 (catB3 和 cmlA1) 、磺胺类 (sul1和 sul2) 、甲氧苄啶类 (dfrA17) 和四环素类 (tet(B)的耐药基因。blaCMY-42为国内少见的基因亚型 , 位于一个截短的ISEcp1 元件下方 , 其下游则为编码外膜脂蛋白的blc 基因和消毒剂耐药基因sugE。质粒分析发现大肠埃希菌 HX43携带 IncI1,Col,IncFIA,IncFIB,和 IncFII五种质粒类型 ,MLST分析发现该菌株属 ST3835。结论本院 - 内酰胺耐药的肠杆菌科细菌主要为大肠埃