生化药物 (Biochemical Drugs)

1、生化药物(biochemicaldrugs)一、性质生化药物是从动物、植物及微生物中分离纯化所得的，以及用化学合成、微生物合成或现代生物技术制得的生化基本物质。生化药物有两个基本特点：其一，它来自生物体，来源复杂，有些化学结构不明确，分子量不是定值，多属高分子物质；其二，它是生物体中的基本生化成分。一、生化药物的种类生化药物按照化学本质的不同，分为以下几类：1.氨基酸及其衍生物类药物包括天然氨基酸、氨基酸混合物和氨基酸衍生物。可由发酵制造，也可由蛋白水解制得。chp(2005)二部收载的有门冬氨酸、色氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、谷氨酸、亮氨酸、精氨酸、胱氨酸、脯氨酸等。2.多肽和蛋白类药物这类药物

2、是人体内的生理活性因子，在生物体内，浓度很低，但活性很强。多肽参与调节生理功能，用于临床的多肽有催产素（9肽）、加压素（9肽）、胰高血糖素（29肽）、降钙素（9肽）等。蛋白质类药物有水蛭素、鱼精蛋白、胰岛素、生长素、催乳素等。3.酶类与辅酶类药物按其功能可分为：助消化酶类、蛋白水解酶类、凝血酶及抗栓酶、抗肿瘤酶类和其它酶类等；还包括部分辅酶类(辅酶q)等。如胃蛋白酶、胰蛋白酶、玻璃酸酶、尿激酶、凝血酶、辅酶q10等。4.糖类药物包括肝素、硫酸软骨素a和c、硫酸角质素、透明质酸等。类肝素(酸性粘多糖)、壳聚多糖、灵芝多糖、黄芪多糖、人参多糖、海藻多糖、螺旋藻粘多糖等。5.脂类药物包括多价不饱和脂

3、肪酸(pufa)、磷脂类、固醇类胆酸类和卟啉类。如亚油酸、卵磷脂、脑磷脂、胆固醇、血红素、胆红素等。6.核酸及其降解产物和衍生物类药物包括核酸类、多聚核苷酸、核苷、核苷酸及其衍生物。例如免疫rna、dna(脱氧核糖核酸)、多聚胞苷酸、巯基聚胞苷酸、atp和camp等。二、鉴别试验鉴别就是利用化学法、物理法及生物学方法来确证生化药物的真伪。通常，需用标准品或对照品在同一条件下进行对照试验。现将常用的鉴别方法简述如下。1.化学反应法通常利用药物与某试剂在一定条件下反应，生成有颜色的产物或沉淀进行鉴别。例如，溶菌酶的鉴别采用呈色法：溶菌酶分子中的四个肽键上的氮原子能与铜离子（cu2）络合，生成有颜色

4、的络合物，肽键越多，产生的颜色越深。胃蛋白酶的鉴别采用沉淀法：胃蛋白酶是具有高效、专一催化活性的特殊蛋白质，易受酸、碱、重金属或有机溶剂等的作用，破坏蛋白质肽链的空间结构，引起蛋白质变性，生成不溶性的沉淀。2.紫外分光光度法三磷酸腺苷二钠的分子中具有共轭系统，能吸收紫外光。本品的0.01moll盐酸水溶液（20gml），在（2571）nm的波长处有最大吸收。a250nma260nm的值应为0.170.27。3酶法尿激酶是专属性较强的蛋白水解酶，根据尿激酶能激活牛纤维蛋白溶酶原，而具有相同作用的链激酶不能激活牛纤维蛋白溶酶原而加以区别，并用直接观察溶解纤维蛋白作用的气泡上升法作为判断指标。4.电

5、泳法肝素的鉴别采用糖凝胶电泳法：肝素是由d-硫酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子间组成的酸性粘多糖，其水溶液带强负电荷，于琼脂凝胶板上，在电场作用下，向正极方向移动，与肝素国家标准品对照，其移动位置应相应，5.生物法利用生物体进行试验来鉴别药物。例如，用家兔惊厥试验来鉴别胰岛素，是通过胰岛素的降血糖作用进行鉴别的，当剂量过大，血糖降低至一定水平（约30），家兔即发生惊厥，迅速静注50葡萄糖注射液，补充血糖，惊厥停止，说明惊厥是胰岛素所致低血糖而引起的。又如，根据肝素钙具有延长血凝时间的特性进行鉴别。应该指出，由于生化药物的结构复杂，仍有一部分生化药物目前还未找到有效的鉴别方法。例如糜蛋白酶、糜胰蛋白

6、酶、胰蛋白酶等。三、杂质检查生化药物分子较大，结构复杂，有时成分并非单一，纯化工艺较难，因此，生化药物的杂质检查就显得非常重要。1一般杂质检查生化药物的一般杂质检查项目包括氯化物、硫酸盐、磷酸盐、铵盐、铁盐、重金属、酸度、溶液的澄清度或溶液的颜色、水分及干燥失重、炽灼残渣等。其检查的原理及方法与化学药物中的一般杂质检查相同，不再赘述。2特殊杂质检查特殊杂质主要是指从生产工艺中引入或原料中带入的杂质。许多生化药物是从生物组织中提取或用微生物发酵法制得，药物中易残存一些杂质或其他成分。例如，胰蛋白酶是从动物膜中提取制得的一种蛋白水解酶，在制备过程中易带入杂质糜蛋白酶，中国药典（1995年版）和us

7、p（23）均规定要检查此酶，根据胰蛋白酶的特性选用n-乙酰-l-酪氨酸乙酯为底物作糜蛋白酶的限度检查。糜蛋白酶的限度为2500个胰蛋白酶单位中不得大于50单位，按每1mg胰蛋白酶为2500个单位和每1mg糜蛋白酶为1000单位，折算成重量，则糜蛋白酶的限度为5（gg）。四、含量测定生化药物的含量测定方法主要有理化法、生化法和生物检定法。理化法适用于化学结构明确的小分子生化药物或经水解变为小分子药物的测定，含量常常用百分含量表示；生化法和生物检定法多用于分子量较大的酶类和蛋白质类药物的含量测定，多用生物效价或酶活力单位表示测定结果。（一） 理化法 理化法包括化学分析法、分光光度法和色谱法以及其他

8、方法，如门冬酰胺采用凯氏定氮法测定含量，甲状腺粉采用氧瓶燃烧法测定含量。1. 滴定分析法 利用氨基酸类药物分子的氨基的碱性，可采用非水溶液滴定法测定含量，如l门冬氨酸、l丙氨酸、色氨酸、苏氨酸、组氨酸。谷氨酸利用羧基的酸性采用中和滴定法测定含量。甘露醇和山梨醇均采用碘量法测定，甘露醇与高碘酸发生定量氧化还原反应，剩余的高碘酸及生成的碘酸再与碘化钾作用，生成游离碘，用硫代硫酸钠液滴定。ch2oh(choh)4ch2oh+5hio42hcho+4hcooh+5hio3+h2o2hio4+14ki+7h2so48i2+7k2so4+8h2o2. 分光光度法生化药物一般采用比色法和uv法测定含量。如硫

9、酸软骨素为大分子酸性粘多糖类药物，其结构中的双糖单位分子中含一分子氨基己糖，采用elson-morgan比色法测定含量。先酸水解供试品，生成氨基己糖，然后在碱性条件下与乙酰丙酮反应，生成色原物质，与对二甲氨基苯甲醛盐酸醇溶液反应产生红色，以盐酸氨基葡萄糖为对照品，于525nm波长处测定吸光度。肌苷、胞磷胆碱钠、细胞色素c等药物采用uv法直接测定，以值计算含量，测定细胞色素c时应注意，还原型细胞色素c 在550nm波长处有最大吸收，峰形异常尖锐，在测定时要求仪器的狭缝应小于1nm，以减少杂散光影响，并应在550 nm 波长附近，每间隔0.5 nm 找出最大吸收波长，否则会给测定带来较大的误差，为

10、23.0。3. hplc法 hplc法适用于高沸点、大分子量、热稳定性差的生物活性物质的分析，常以具有一定ph值的缓冲溶液作为流动相，常温操作，分析环境与生理环境相似，因而具有温和的分析条件与良好的生物兼容性，有利于保持生物大分子的构象和生理活性等特点。hplc法可以用于氨基酸及其衍生物、多肽、蛋白质、糖类、卟啉、核酸及其降解产物的分离与测定。(1) 反相高效液相色谱法（rp-hplc） 可以对氨基酸、肽、蛋白质、多糖进行分析。固定相尽量选择球形全多孔硅胶键合相，分子量较小的药物选用c18烷基硅胶键合相，分子量较大的药物选用c8烷基硅胶键合相。流动相选用乙腈水（或缓冲溶液）、甲醇水（或缓冲溶液

11、）。如复方氨基酸注射液、辅酶q10等一般按外标法以峰面积计算各种氨基酸的含量。例11.三磷酸腺苷二钠的含量测定 三磷酸腺苷二钠（adenosine disodium triphosphate）的含量是通过测定总核苷酸和三磷酸腺苷二钠的重量比来控制的。三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, atp）不稳定性，易降解为二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，adp）至一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，amp），在生产、贮存与销售期过程中，即使总核苷酸的量不变，atp的重量比会随时间的延长而逐步下降，chpatp-2na含量是通过测定总核

12、苷酸的量和atp-2na的重量比来控制的。总核苷酸的量采用紫外分光法度法测定，atp-2na的重量比采用hplc法测定。总核苷酸测定 取供试品加0.1mol/l磷酸盐缓冲液(ph 7.0)使溶解并制成浓度为20g/ml的溶液，在259nm波长处测定吸光度，按c10h14n5na2o13p3吸收系数()为279计算总核苷酸的量。atp-2na重量比测定 色谱柱为hypersil ods(4mm125mm,5m),流动相为0.2mol/l磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钠35.8g，磷酸二氢钾13.6g，加水900ml溶解,用1mol/l氢氧化钠溶液调ph至7.0,加入四丁基溴化铵1.61g,加水至100

13、0ml,摇匀)-甲醇(955);检测波长为259nm；柱温为35；理论板数按atp峰计算不低于3000；出峰次序依次为amp-na,adp-2na与atp-2na，各色谱峰的分离度应符合要求。取供试品溶液（4mg/ml）10l，注入高效液相色谱仪,记录色谱图，计算atp-2na在总核苷酸中的重量比： 式中t1、t2、t3和tx分别为amp-na、adp-2na、atp-2na和其他物质的峰面积； 0.671为amp-na与atp-2na分子量的比值； 0.855为adp-2na与atp-2na分子量的比值。atp-2na含量为：atp-2na含量（）总核苷酸atp-2na重量比。（2）离子交换

14、色谱(ion-exchange chromatography,iec) 该法适用于离子化合物和能够解离的化合物，如氨基酸、多肽、蛋白质和核酸类药物的分析。常用的固定相为以交联共聚的苯乙烯二乙烯苯或亲水性高聚物凝胶为基质的离子交换树脂，流动相多为水溶液，有时可加入少量的有机溶剂，如乙醇、四氢呋喃、乙腈等，以增加某些组分的溶解度，改变分离的选择性。iec具有以下特点： 1)根据相应的离子化程度对蛋白质、多肽进行分离。暴露在外的带电荷的氨基酸残端的数量(如天冬氨酸、赖氨酸)将影响洗脱过程。 2)梯度洗脱法是以盐浓度增大而进行的分离过程。样品液必须和进样前的流动相保持相同的ph和离子强度。为获得良好的

15、重现性，进样前色谱柱必须充分平衡。典型的分离梯度是缓冲液为0.3mol/l1.0mol/l的盐溶液。 3)柱效中等并具有较高质量的活性回收。虽然获得的峰比反相色谱峰更宽，但活性回收更佳。活性蛋白质的回收可通过不同强弱交换类型的选择而优化。对于一些敏感蛋白质，如果回收有问题，弱型离子交换剂可获得更好的活性和质量回收。（3） 分子排阻色谱法 分子排阻色谱法（size-exclusion chromatography,sec）也称凝胶渗透色谱法(gel permeation chromatography,gpc)，利用凝胶的分子筛作用，根据被测组分的分子尺寸而进行分离，可以测定蛋白质多肽类药物的分子

16、量，也可以测定如多糖、多聚核苷酸和胶原蛋白等生物大分子聚合物的分子量和分子量分布。柱填料主要为亲水硅胶、葡聚糖凝胶（sephadex）和聚丙烯酰胺凝胶(sepharose)、微孔聚合物、微孔硅胶等。流动相应对组分具有良好的溶解度，以及较低的粘度。在蛋白质和多肽的分析中，通常选用交联丙烯酸甲酯凝胶或二醇键合硅胶，根据样品的分子量范围，选择色谱柱的级分范围，流动相的选择应与蛋白质样品匹配，一般用0.1moll0.2moll的缓冲溶液，ph为68。由于不同排阻范围的葡聚糖凝胶有一特定的蛋白质分子量范围，在此范围内，分子量的对数和洗脱体积之间成线性关系。因此，用几种已知分子量的蛋白质为标准，进行凝胶层

17、析，以每种蛋白质的洗脱体积对它们的分子量的对数作图，绘制出标准洗脱曲线。未知蛋白质在同样的条件下进行凝胶层析，根据其所用的洗脱体积，从标准洗脱曲线上可求出此未知蛋白质对应的分子量。例12. 莫海林分子量的测定 莫海林是由肝素经化学修饰获得的改构肝素，采用gpc测定其分子量，色谱柱为为多糖专用凝胶柱， 0.2mol/l硫酸钠(稀硫酸调至ph 5.0)为流动相；柱温35；流速0.5 ml/min；示差折光检测器。由于肝素分子量为3 00040 000，莫海林作为改构肝素其分子量也在此范围，故选用上述分子量范围的标准品。标准曲线的绘制中以已知分子量的葡聚糖（dextran）为标样，分别取5个不同分子

18、量的标样，加流动相制成10 mg/ml的溶液作为标准溶液。分别取25l进样，记录色谱图得保留时间tr，计算其回归方程为：logmw=8.880-0.323tr r=0.996 n=5 精密称取莫海林原粉适量，加流动相溶解，制成约10 mg/ml的溶液，滤过，放置过夜。取25l进样，记录色谱图。由回归方程求出莫海林的平均mw为22 788469。 （二）酶分析法在生物药物的分析中，酶分析法主要包括酶活力测定法和酶法分析两种类型。酶活力测定法是一种以酶为分析对象，对生物药物生产过程中所用的酶或酶类药物的含量或酶活力进行测定的方法；酶法分析则是一种以酶为分析工具或分析试剂的分析，主要用酶作试剂测定样

19、品中酶以外的其它物质的含量。二者检测的对象虽有所不同，但原理和方法都是以酶能专一而高效地催化某化学反应为基础，通过对酶反应速度的测定或对生成物等浓度的测定而检测相应物质的含量。1. 酶活力测定法 酶的活性是对酶的催化能力大小的度量。酶的单位（国际单位iu）是指在25下，以最适的底物浓度、最适的缓冲液离子强度以及最适的ph值诸条件下，每分钟能转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性单位。与酶活性有关的另一概念 比活性也很重要，比活性定为每一毫克蛋白质所含的酶单位数（单位数毫克蛋白）。（1） 基本原理 酶是一种具有特殊催化能力的蛋白质类生物催化剂。酶活力是指酶催化一定化学反应的能力，是对酶的催化能力大

20、小的度量。酶活力的测定就是测定酶催化某一化学反应的速度，酶反应的速度愈快所表示的酶活力愈高。对于一个酶催化反应： 式中：e为酶；s为酶底物；es为反应的中间络合物；p为产物。反应的初速度为酶底物浓度的函数：式中：v0为反应的初速度，vmax为最大反应速度，s0底物的初始浓度。vmax与常数k3和酶的浓度e有关：vmaxk3 e，则： 在底物浓度一定条件下，反应的初速度与酶的浓度成正比。在线性范围内测得酶催化反应初速度即可求出酶的浓度，如图1-10-1所示。酶反应的速度可以用单位时间反应底物的减少或产物的增加来表示，测定产物或底物的变化量对时间作图得“酶反应进程曲线”，曲线斜率表示反应速度。大多

21、数酶的反应进程曲线表明，在酶反应的最初阶段里，底物或产物的变化量一般随反应时间而线性地增加，反应速度恒定；但是反应时间延长，这条曲线会逐渐地弯曲下来，斜率发生改变，反应速度下降。其原因是，底物浓度在下降，产物在增加，逆反应从无到有逐渐变得显著起来；同时酸、碱、热等也在慢慢地使酶失效。因此，这种情况下测得的反应速度已是一种表观的、多种因素影响下的综合结果，不能代表酶的真正活性。真正能代表酶催化活性的是反应初始阶段的速度，即反应初速度。（2）酶反应的条件 选择反应条件的基本要求是：所有待测定的酶分子都应该能够正常地发挥它的作用。这就是说，反应系统中除了待测定的酶浓度是影响速度的惟一因素外，其它因素

22、都处于最适于酶发挥催化作用的水平。确定反应条件时应考虑以下因素：底物：为了便于测定，选用的底物（包括人工合成底物）最好在物理化学性质上和产物不同，以便于测定。为了不使酶反应速度受限，反应系统应该使用足够高的底物浓度，判别标准是底物浓度s与km的关系。根据michaelis-menten方程：，如果要求反应速度达到最大速度的99，则其底物的浓度应为：，s99km。大多数酶具有相对的专一性，在可被它作用的各种底物中一般选择km小的作测定的底物。ph：氢离子浓度能对酶反应产生多种影响：它可能改变酶的活性中心的解离状况，升高或降低酶的活性；也可能破坏酶的结构与构象导致酶失效；还可能作用反应系统的其它组

23、成成分影响酶反应，甚至改变可逆反应进行的方向。例如，乳酸脱氢酶反应在ph7时倾向乳酸生成，而ph10时则倾向于丙酮酸形成。因此在进行酶活力测定时要注意选择适宜的反应ph，并将反应维持在这一ph值。酶反应通常借助缓冲系统来控制ph，因而有一个适宜的缓冲离子和离子强度问题。选择缓冲离子应考虑以下几个问题：选择的离子的pk值须接近要调整的ph，因为在这种情况下，缓冲能力最强。缓冲离子不同，即使是同一酶反应所表现出来的活性水平可能各不相同，甚至最适ph也可能发生变化。缓冲离子可能与酶活性的必需成分形成络合物而导致酶活性的抑制。例如，磷酸能与多价阳离子如ca2+等结合，硼酸能与多种有机化合物结合，从而抑

24、制相应的酶活性。缓冲体系常因稀释和温度等变化改变其ph值。温度：酶反应对温度十分敏感，因为温度能直接影响化学反应速度本身，也能影响酶的稳定性，还可能影响酶的构象和酶的催化机制。一般而言，温度变化1，酶反应速度可能相差5左右。因此，实验中温度变动应控制在土0.1以内。酶反应的温度通常选用25、30或37。辅助因子：有些酶需要金属离子，有些酶则需要相应的辅酶物质。为了提高酶在反应系统中的稳定性，有些也需要某些相应的物质。例如，对巯基酶可加入二巯基乙醇、二巯基苏糖醇（dtt）等。空白和对照：每个酶反应通常都应该有适当的空白和对照。空白是指杂质反应和自发反应引起的变化量，它提供的是未知因素的影响。空白

25、值可通过不加酶，或不加底物，或二者都加（但酶需预先经过失效处理）。对照是指用纯酶或标准酶制剂测得的结果，主要作为比较或标定的标准。（3）酶活力的测定方法 酶活力测定按取样及检测的方式可分为取样测定法或连续测定法。1）取样测定法：在酶反应开始后不同的时间，从反应系统中取出一定量的反应液，并用适当的方法停止其反应后，再根据产物和底物在化学性质上的差别，选用适当的检测方法进行定量分析，求得单位时间内酶反应变化量的方法。停止酶反应通常采用添加酶的变性剂或加热使酶失效。常用的变性剂有：5的三氯醋酸、3的高氯酸或其它酸、碱、醇类。三氯醋酸是一种高效专一的蛋白质变性剂和沉淀剂，其缺点是在紫外光区有吸收，而高

26、氯酸没有此缺点，并且用氢氧化钠中和、冷却后，kclo4还可沉淀除去，但它不适于对酸和氧化剂敏感的测定对象。用于停止反应的试剂应根据具体反应灵活掌握，例如，以对硝基酚的衍生物作底物的酶反应可用氢氧化钠或氢氧化钾停止反应，因为碱有利于硝基酚发色。2）连续测定法 是基于底物和产物在物理化学性质上的不同，在反应过程中对反应系统进行直接连续检测的方法。显然从准确性和测定效率看连续法都比较好。（4）检测方法 在酶反应过程中底物减少或产物增加的测定，通常需要根据底物与产物性质上的差别来选用的适当检测方法。常用的检测方法有uv-vis法、荧光分析法、电化学方法、化学反应法、同位素测定法等。uv-vis法：在酶

27、反应过程中，利用产物和底物在可见或紫外光区的吸收光谱特征的差别，选择合适的波长，测定反应过程中的变化情况。该法应用最为广泛，对一些原来反应中不发生光吸收变化的酶，可以通过与第二个酶的偶联，使第一个酶的反应产物变成第二个酶的具有吸光度变化的底物进行测定。例如脱氢酶的辅酶nadh与nadph在338nm与340nm间有最大吸收，而其氧化型则无，在任何脱氢酶反应中，无论是nad或nadp的还原，还是nadh或nadph的氧化，都可以在340nm或其附近的测定吸光度的增减而测定之(图1-10-2)。例13.糜蛋白酶的效价测定 原理 在一定条件下，糜蛋白酶水解底物n-乙酰基l酪氨酸乙酯(atee)，使吸

28、光度值变小，通过测定吸光度的变化来测定水解反应的速率。以吸光度变化率计算活力单位，以atee单位表示效价。 测定法 取0.0012mol/l盐酸溶液0.2ml与底物溶液3.0ml，在250.5，于237nm波长处测定并调节吸光度为0.200。再取供试品溶液0.2ml与底物溶液3.0ml，立即记时并摇匀，每隔30s读取吸光度，共5min，吸光度的变化率应恒定，恒定时间不得少于3min若变化率不能恒定，可用较低浓度另行测定。每30s的吸光度变化率应控制在0.0080.012，以吸光度为纵坐标，时间为横坐标，作图，取在3min内成直线的部分，按下式计算: 式中p为每1 ml 糜蛋白酶的效价，单位；a

29、2为直线上开始的吸光度；a1为直线上终止的吸光度；t为a2至a1读数的时间，分；w为测定液中含供试品的量，mg；0.0075为在上述条件下，吸光度每分钟改变0.0075，即相当于1个 糜蛋白酶单位。2）荧光分析法：如果酶反应的底物与产物之一具有荧光，那么荧光变化的速度可代表酶反应速度。应用此法测定的酶反应有两类：一是脱氢酶等反应，它们的底物本身在酶反应过程中有荧光变化，例如nad（p）h的中性溶液发强的蓝白色荧光（460nm），而nad（p）则无。另一类是利用荧光源底物的酶反应，例如可用荧光素二丁酯测定脂肪酶，荧光素二丁酯不发荧光，但水解后释放荧光素。 荧光素二丁酯 荧光素测定荧光强度的变化即

30、为荧光素产生的速度。荧光分析法测得的酶活性水平通常以单位时间内荧光强度的变化（ft）表示。荧光测定法的主要缺点是，荧光读数与浓度间没有确切的比例关系，而且常因测定条件如温度、散射、仪器等而不同，所以如果要将酶活性以确定的单位表示时，首先要制备校正曲线，根据这曲线再进行定量。荧光分析法的优点是灵敏度极高，它比光吸收测定法还要高23个数量级，因此特别适于酶量或底物量极低时的快速分析。3）旋光度法：利用反应物或产物在反应前后的旋光度变化进行测定，在没有其它更好的方法可用时，可考虑用旋光度测定法。4）电化学方法：可以测定ph的变化；也可以恒定ph，不断加入酸或碱使ph保持恒定，根据所加入的酸或碱的量来

31、度量；或者采用离子选择电极，如用铵离子选择电极可测定尿素被酶水解中产生的铵离子，用氧电极可测定催化反应中消耗的氧。例14. 抑肽酶的测定 在ph8.0，25的条件下，胰蛋白酶使n-苯甲酰基l精氨酸乙酯(baee)水解为n-苯甲酰基l精氨酸，溶液ph值下降，加氢氧化钠后，使溶液的ph值回复到8.0，水解反应继续进行。在胰蛋白酶溶液中加入抑肽酶，使50胰蛋白酶的活性被抑制，剩余的胰蛋白酶与baee进行水解反应，用氢氧化钠滴定释放出的酸，使溶液的ph值始终维持在7.98.1。在一定时间，根据供试品消耗氢氧化钠的量，计算酶活力单位。 式中4000为系数；w为抑肽酶制成每1ml中约含1.67单位时的酶量

32、，mg；n1为对照测定时每秒钟消耗的氢氧化钠滴定液（0.1mol/l）的容积，ml；n2为供试品溶液每秒钟消耗的氢氧化钠滴定液（0.1mol/l）的容积，ml；2为供试品溶液中所加胰蛋白酶的量为对照测定时的2倍；f为氢氧化钠滴定液（0.1mol/l）的校正因子。2. 酶分析法酶分析法是一种以酶为分析工具（或试剂）的分析方法。分析的对象可以是酶的底物、辅酶活化剂甚至酶的抑制剂。在进行这类分析时，先要根据分析对象选择适宜的“工具酶”，然后再通过酶反应的测定，并借助相应的校正曲线来测定它们的浓度或含量。在上述几种检测对象中，除了底物可以采用总变量分析法外，其他都只能用动力学分析法。（1）动力学分析法 通过条件控制，分别使底物、辅酶活化剂或抑制剂的浓度在酶反应中起决定反应速度的主导作用，这时酶反应速度和上述相应因素的浓度间将具有确定的比例关系，这样测定酶反应的速度就可求出它们的浓度。酶分析法采用的条件和酶活力测定法的条件基本相同，但其所用的酶量必须一定被测物以外的其他反应成分均须保证处于恒定和最适。以下分别简述各种物质测定应注意的问题。1）被测物是酶的底物：当底物浓度skm