牛磺酸抗骨关节炎的作用及机制研究

1、牛磺酸抗骨关节炎的作用及机制研究研究背景 : 骨关节炎 (OA)是一种慢性退行性疾病 , 发生于中老年人。肿胀, 畸形和关节功能障碍影响了世界上的许多患者, 并且是人类残疾和丧失能力的主要原因之一。随着人类寿命逐渐延长以及生活方式的改变, 骨关节炎患者人口数量日益增长 , 全球 65 岁以上人群有超过一半为膝关节炎患者, 到 2020 年 , 据估计骨关节炎成为世界上第四大常见疾病。我国中老年人症状性膝骨关节炎的患病率为8.8%,每 10 万人口中由于膝骨关节炎所导致的 “伤残损失生命年” 约为 968 人年 , 在所有疾病中排名第 10 位。在给患者带来巨大身心痛苦的同时 , 也引发社会产生

2、沉重经济负担。这种疾病特点是逐渐加重的关节的损伤和退化 , 以关节软骨的破坏为主要表现。软骨细胞是关节软骨中的唯一细胞 , 软骨细胞可以产生并维持主要由胶原蛋白和蛋白多糖组成的关节软骨基质 , 负责维持人和动物的软骨和关节健康。大量研究表明 , 细胞凋亡导致的软骨细胞损失增加是骨关节炎的一个主要特征。随着骨关节炎患者的病情逐渐发展 , 软骨细胞出现大量死亡 , 并且软骨细胞凋亡是关节软骨中细胞逐渐减少的主要原因。 所有这些变化导致关节软骨不可逆转的进行性退化。内质网应激 (Endoplasmic Reticulum Stress,ERS)是一种亚细胞病理过程 ,是由于内质网功能发生了紊乱。 它

3、反映了内质网中未折叠或错误折叠的蛋白质的负载与内质网的蛋白处理能力之间的不平衡。ERS参与许多疾病的病理过程, 最近的研究表明 , 随着 OA的进展 , 内质网应激贯穿于诸多引起软骨细胞凋亡的信号传导通路之中。牛磺酸是含硫的游离氨基酸。近年来 , 已发现它具有广泛的生物学效应, 例如免疫调节和抗脂质过氧化损伤。牛磺酸是一种内源性抗氧化剂, 对心肌细胞 , 神经细胞 , 平滑肌细胞和肿瘤细胞等细胞的凋亡有重要作用, 对细胞有一定的保护作用。然而 , 没有研究检查牛磺酸对人软骨细胞的保护作用。因此 , 我们假设牛磺酸治疗可以通过减轻内质网应激, 减少软骨细胞凋亡 , 保护软骨细胞 , 从而起到保护

4、关节软骨和减缓骨关节炎的发展的作用。研究目的 :1. 探讨牛磺酸对大鼠骨关节炎模型的治疗作用, 并探讨其相关机制。 2. 探讨牛磺酸对人骨关节炎软骨细胞内质网应激的影响, 探讨其对骨关节炎影响的机制。研究方法 : 第一部分 :1. 通过前交叉韧带切除术和内侧半月板切除术建立大鼠骨关节炎模型。 2. 采用尾静脉注射的方法给予不同浓度(100 mg/kg;200mg/kg;400 mg/kg) 的牛磺酸处理。3. 在手术前和手术后每两周评估骨关节炎发展情况及牛磺酸作用影响。4.应用双通道重量传感器测量大鼠后肢的体重分配, 测定关节负重疼痛引起的大鼠后肢负重姿态变化。5. 应用 Von Frey F

5、ilaments 刺激大鼠后肢收缩反应 , 测定继发性机械性异位疼痛程度。 6. 测量膝关节的宽度以反映膝关节的肿胀程度。7. 在第 14 周, 进行膝关节软骨的组织病理学分析 , 观察软骨损伤及骨关节炎发展情况。 8. 通过蛋白质印迹技术评估 MMP-3和 CHOP的蛋白质表达水平。第二部分 :1. 取样骨关节炎软骨组织。 提取软骨组织 RNA,通过 qRT-PCR定量软骨中型胶原 (collagen ) 和内质网应激及细胞凋亡标志物 (GRP78、GADD153和 Caspase-12) 的 mRNA表达水平。2. 通过蛋白质印迹技术测定软骨组织蛋白 , 检测软骨中的型胶原 ( 胶原蛋白

6、) 和内质网应激、细胞凋亡标志物 (GRP78、GADD153和 Caspase-12) 的蛋白表达水平。 3. 培养关节软骨细胞 ,H202 和牛磺酸梯度实验 , 通过细胞计数试剂盒CCK-8 评估软骨细胞的细胞活力, 确定诱导内质网应激和牛磺酸治疗的培养条件。4. 分三组培养软骨细胞 : 空白对照组 ; 0.3mMH2O2处理诱发 ERstress 组 25mM牛磺酸预培养后 0.3mMH2O2处理组。 5. 细胞计数试剂盒 CCK-8评估软骨细胞的细胞活力 ,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞技术检测细胞凋亡。6. 通过蛋白质印迹技术评估软骨细胞中型胶原蛋白、 内质网应激和凋

7、亡标志物 (GRP78、GADD153和 Caspase-12) 的蛋白质表达水平。研究结果 : 第一部分 :1.大鼠骨关节炎模型建立前交叉韧带切断术(anterior cruciate ligamenttransaction,ACLT)加内侧半月板切除术 (medialmeniscus resection,MMx) 可迅速诱发大鼠骨关节炎。手术建模后的疾病进程更快且更为连贯, 很好的模拟了骨关节炎发病的力学及生物学特性。 2. 牛磺酸治疗可以减轻大鼠骨关节炎模型的症状在继发性异位疼痛评估测试中 , 与 OA组相比 , 牛磺酸治疗组的缩爪潜伏期显著增加。在使用牛磺酸治疗6 周后 ,OA+1 X

8、 牛磺酸组 (1.25 0.12 g,p<0.05)、OA+2X牛磺酸组 (1.6 0.1 g,p<0.01)与 OA组相比缩爪潜伏期显著增加。OA+0.5 X 牛磺酸组手术后第8 周的疼痛感开始显着缓解。较高剂量的牛磺酸具有更快的抗继发性机械性异位疼痛作用。牛磺酸治疗对骨关节炎大鼠的继发性机械性异位疼痛的缓解作用呈现出剂量和时间的依赖性。假手术大鼠在手术前后的重量分布没有显著变化。骨关节炎模型组手术后第二周 , 后肢重量分布差异显著增加。治疗 4 周后 ,OA+2牛磺酸组的后肢体重分布差异显着减少。较高剂量的牛磺酸治疗更加快速的降低后肢重量分布的差异。骨关节炎大鼠导致膝关节显著肿

9、胀。相反, 假手术并未导致大鼠膝关节明显肿胀。用牛磺酸处理 8 周后 , 大鼠膝关节的肿胀显着减少。 治疗后的第 14 周 ,OA+1X牛磺酸组 (23 1.5 g) 和 OA+2X牛磺酸组 (21 1.6 g) 的后肢重量分布差异无明显区别。因此 , 牛磺酸注射液在治疗骨关节炎大鼠中具有显着的抗肿胀活性。第14周进行大鼠膝关节组织病理切片观察软骨基质损失和软骨退化并进行OARSI评分。在假手术组中 , 软骨表面光滑 , 软骨细胞均匀分布。 ACLT加 MMx手术模型组导致严重的软骨细胞死亡和严重的软骨退化。牛磺酸治疗组软骨退变的面积和深度显着减少。第14 周进行 Western blot检测

10、 OA组中 MMP-3和 CHOP的蛋白质水平显示出显着的上升趋势。牛磺酸治疗组的 MMP-3和 CHOP的蛋白表达显著降低 , 同时 , 牛磺酸治疗对骨关节炎软骨中 MMP-3和 CHOP的蛋白表达的影响呈现剂量相关性。第二部分:1.随骨关节炎的进展软骨细胞内质网应激及细胞凋亡加强随着骨关节炎的进展, 软骨细胞死亡 , 软骨基质减少。型胶原 mRNA和蛋白表达水平降低 , 而内质网应激和凋亡标志物(GRP78,GADD153,Caspase-12)的 mRNA和蛋白表达显着增加。 2. 牛磺酸抑制软骨细胞中 H202诱导的内质网应激H202诱导软骨细胞内质网应激, 通过细胞技术试剂盒 CCK

11、-8梯度实验 ,0.3mM的 H202处理软骨细胞 4 小时导致显著的细胞毒性,有约 60%的软骨细胞保持存活。0.4 、0.5 、1 和 2 mMH202处理 4 小时后 , 软骨细胞的存活率分别降低至42%、33%、23%和 11%,0.3 mMH202是不产生显著细胞毒性的最高剂量, 使用 0.3 mMH2O2进行实验。梯度实验后选择25mM牛磺酸剂量用于实验。与对照组相比 , 牛磺酸处理后软骨细胞内质网应激和凋亡标志物GRP78,GADD153和 Caspase-12 的表达显著下降。 3. 牛磺酸在体外保护软骨细胞并减少软骨细胞凋亡H202在体外培养的软骨细胞中诱导内质网应激, 从而

12、启动ERS介导的软骨细胞凋亡。通过 CCK-8测定和膜联蛋白 V-FITC/PI 双染流式细胞仪检测细胞凋亡发现,牛磺酸处理后软骨细胞凋亡呈现出显著下降。结论及意义 :1. 本研究发现 , 大鼠骨关节炎模型术后与对照组比较, 表现出继发性机械性异位疼痛, 姿态改变导致后肢负重变化 , 关节明显肿胀。给于不同剂量牛磺酸尾静脉注射治疗后, 骨关节炎大鼠模型继发性机械性异位疼痛缓解 , 减轻了骨关节炎导致的后肢负重异常, 骨关节肿胀减轻。牛磺酸给药治疗表现出与剂量和时间的相关性。2. 随着骨关节炎严重程度的增加 , 软骨细胞凋亡增加 , 软骨内质网应激标记物 GRP78增加。它反映了软骨细胞内质网应激的增强 , 细胞凋亡标志物 GADD153和 Caspase-12 也增加。结果表明 , 软骨细胞内质网应激可促进软骨细胞凋亡和骨关节炎的进展。3.本研究发现 , 牛磺酸注射对骨关节炎大鼠有治疗作用, 牛磺酸可通过抑制凋亡因子 CHOP的表达减少软骨细胞凋亡, 抑制 MMP-3减少型胶原丢失及软骨破坏, 缓解骨关节炎症状。4. 本研究首次对体外培养软骨细胞采用牛磺酸处理 , 首