新生小鼠精原干细胞诱导分化精子样细胞

1、DOC格式论文，方便您的复制修改删减新生小鼠精原干细胞诱导分化精子样细胞（作者：单位：邮编：）作者：毕聪明，王珅，王军，费东亮，肖银霞【摘要】目的 探讨小鼠精原干细胞体外诱导分化精子样细胞的可行性。方法 以78日龄小鼠睾丸为材料，采用小鼠睾丸支持细胞 作为饲养层，应用维甲酸诱导、成年小鼠睾丸组织液诱导以及低温诱 导精原干细胞分化，应用流式细胞仪分析诱导精子样细胞的染色体倍 性。采用显微注射法将精子样细胞注射到卵母细胞和去核卵母细胞， 观察受精卵的发育状况。结果三种方法诱导精子样细胞比例分别为5.9% 1.6%、0.35%;流式细胞仪分析维甲酸诱导单倍体比率为19.3%;诱导精子样细胞能激活卵母

2、细胞，囊胚发育率20.36%。结论新生小鼠精原干细胞体外可以诱导分化为精子样细胞，并具有激活卵母细胞 的能力。【关键词】精原干细胞分化单倍体小鼠Abstract: Objective To discuss the possibility of SSCs ofNewly-born mice in due ing the differe ntiat ingSperm-like cells.Methods Taking the testis of male mice of 78 days for material and adopti ng the testis of mice , SSCs dif

3、fere ntiat ing wereinduced by using retinoicacid, tissue fluid of adult mice andlow temperature. Flow cytometry was used to analyse the ploidy of chromosome inducing sperm-like cells. Microinjection was used to inject the sperm-like cells into oocytes and enucleate oocytes to observe the development

4、 situation of zygotes. Results The proportions of sperm-like cells induced by the three methods were 5.9%,1.6%,0.35% respectively. The rate of Flow cytometry to an alyse reti noic acid haploid is 19.3% .The sperm-like cells achieved could activate bovine oocytes by sperm injecti on(ICSI), and thedev

5、elopme ntrate ofblastosphere was 20.36%. Con clusi ons SSCs of n ewly -born mice can be induced and differentiated into sperm-like cells and are also capable of activati ng oocytes.Key words:SSCs; differe ntiat ing; haploid; mice在生精过程中，原始生殖细胞在胚胎期迁移到生殖嵴，经有丝分 裂，迅速增殖形成精原干细胞(spermatogoial stem cells ， S

6、SCs)， 然后进一步形成精原细胞。吴应积等1利用曲细精管体外共培养 法长期培养精原干细胞自分化为精子样细胞，另外应用外源基因修饰 的雄性生殖细胞系或青春期的精原干细胞也可分化出精子样细胞2-5，通过体内移植使无内源性精子的动物产生精子。但在体外研究SSCs诱导精子的很少，某些雄性性原细胞可以直接分化成精原细胞:6,这提示具有一少部分雄性性原细胞维持在干细胞状态。本实验 通过体外诱导新生小鼠SSCs分化为精子样细胞，探讨不同诱导方法 的诱导效率；采用显微注射法将精子样细胞注射到卵母细胞和去核卵 母细胞，探讨其体外重构胚的发育能力，为SSCs体外分化研究打下基础。1材料与方法1.1动物与材料1.

7、1.1实验动物 清洁级78日龄雄性昆明乳鼠(辽宁医学院实 验动物中心提供)。1.1.2 材料 碘化丙锭(propidium iodide ， PI )维甲酸(retinoic acid，RA)、EGF(epidermal growth factor)、二氢睾酮(dihydrotestosterone )、促卵泡生成素(folliclestimulatinghormone)均为SIGMA公司产品。1.1.3培养液的配制A基础培养液 DMEM+10%BS培养液+6 mM谷氨酰胺+0.5 mM 丙酮酸钠+0.1%非必需氨基酸+10 n g/mL EGF+10 ng/mL类胰岛素样生 长因子+500

8、ng/mL促卵泡生成素+133 mIU人生长激素+ 5 mg/mL胰 岛素+5 mg/mL转铁蛋白+5 mM维生素 A+ 0.1 mM视黄醛+ 0.1 mM睾 酮+0.1 mM二氢睾酮+0.01%核苷+0.5%青霉素。B条件培养液 基础培养液+30%成年小鼠睾丸组织浸提液。1.2方法1.2.1 SSCs的获取采用组合酶消化法分离SSCs采用支持细胞和SSCs共培养 的方法培养，接种密度为1.0 X 105/mL,每周换液体2次。1.2.2 SSCs的诱导A. RA诱导 原代培养用基础培养液，添加 10-5 mol/L RA处 理48 h，培养4 d，更换为基础培养液，37 C培养，定时观察细胞

9、 生长状况，显微镜观察照相。B. 条件培养液诱导原代培养用基础培养液培养，3 d换上 条件培养液（50%细胞基础培养液+50%睾丸组织浸提液培养液）， 37 C培养，每23 d半量换液1次，定时观察细胞生长状况，显 微镜观察照相。C. 低温培养诱导 原代培养用基础培养液培养，37.8 C培养 3 d，然后34.8 C继续培养，每23 d半量换液1次，定时观察细 胞生长状况，显微镜观察照相。123新生小鼠SSCs向精子样细胞诱导分化检测A. 流式细胞仪分选诱导细胞及 DNA倍性分析根据细胞核DNA含量，利用在碘化丙啶(PI)染色区分RA诱导体系中的细胞群7, 8。B. 卵母细胞胞浆内授精(int

10、racytoplasmic sperminjection , ICSI)试验用浓度为0.2%的透明质酸酶消化卵丘，去 卵丘后选择有第一极体的成熟卵母细胞进行 ICSI。对照组用支持细 胞作供体细胞重构核移植胚胎和孤雌激活胚胎，显微镜下观察受精卵 的发育状况。C. RT-PCF分析利用RT-PCR佥测新分化的悬浮细胞PRM-2TP1、TP2这三个单倍体的特异性标志基因，引物设计见表 1。PCRT 增采用 94.8 C 3 min，94.8 C 1 min，57、58、59.8 C (TP2,PRM-2,TP1) 1 min，72.8 C 1 min。用精子作阳性对照，成纤维细 胞作阴性对照。表1

11、 RT-PCR引物靶基因(略)2结果2.1不同诱导方法结果采用三种方法诱导新生小鼠SSCs向单倍体分化，结果在不同时间内均能出现类似精子样细胞和形态较大的圆形细胞，体外诱导培养的新生小鼠SSCs可以形成具有尾巴的精子样结构细胞，不同 方法诱导产生具有尾巴样结构的细胞的时间和比例有一定差异（表 2）。表2不同方法诱导新生小鼠SSCs形成精子样细胞比例（略）表中不同肩标代表不同处理间经方差分析比较差异显著（PV0.05）2.2诱导精子样细胞培养特性2.2.1 RA诱导SSCs与支持细胞共培养，接种后 23 h支持细 胞开始贴壁，12 h完全贴壁并伸出短伪足，SSCs 24 h后贴于支持细 胞表面，

12、但不牢固，轻轻吹打有 SSCs游离出来，SSCs开始细胞呈圆 形或椭圆形，RA诱导后培养至4 d，许多具有单突起的细胞贴于细胞 层上或悬浮于培养液中，形态与具有尾巴的精子细胞相似，其细胞体 形态椭圆形、三角形、圆形和梭形。圆形细胞体较小，尾巴较短，这 种形状的细胞相对较少（图1A）;椭圆圆形细胞具有单鞭毛或另一端 有突起细胞体较大，尾巴细长（图1B）,而梭形细胞多出现双突起（图 1C），培养7 d，精子样细胞和圆形细胞增多（图1D）。2.2.2条件培养液诱导 原代培养用基础培养液培养，支持细胞 能迅速贴壁，SSCs贴附于支持细胞表面，4 d后形成克隆突起明显的 克隆，加入条件培养液后 3 d，

13、在SSCs集落周围，出现圆形或椭圆 形的细胞，细胞较SSCs大,部分细胞悬浮，游离的精子很少（图1巳， 贴壁的圆形细胞摇动培养皿或轻轻吹打即脱离支持细胞。圆形的细胞 较多，但具有精子样形态的细胞很少。223低温培养诱导 用基础培养液37.8 C培养3 d , 有克隆产生，转为34.8 C继续培养6 d后在集落周围有少量散在 的圆形细胞，个别细胞有鞭毛（图1F）。2.3流式细胞仪分拣精子样细胞收集上述诱导产生的悬浮细胞，以未定向诱导细胞作为对照，处理用PI荧光染料染色，流式细胞仪分拣见图 2。细胞进行流式细胞仪分析显示，诱导细胞明显的3类细胞群，在DNA直方图出现了明显三个峰中，包括单倍体细胞峰

14、、二倍体 细胞峰和四倍体细胞峰，也可见细胞染色体碎片形成其他小峰。 而对 照组小鼠成纤维细胞出现2个细胞类群，对照显示出现的2峰为二倍 体细胞峰和四倍体细胞峰，对照精子组出现一个细胞峰位单倍体峰， 因此认为所收集的悬浮细胞中含有单倍体细胞，约占所有悬浮细胞（检测细胞）总数的19.3%。2.4卵母细胞体外显微授精试验将具有精子样结构的细胞，注入成熟培养 24 h未被激获的 小鼠卵母细胞的胞质中，对照组注射支持细胞和孤雌胚胎，胚胎发育 情况结果如表3。表3小鼠卵母细胞体外显微授精胚胎发育结果（略）表中一列中不同肩标表示经方差分析差异显著（P0.05）表3显示，诱导精子样细胞可以使小鼠卵母细胞卵裂并

15、进一 步发育为囊胚，其卵裂率、8/16细胞胚比率高于支持细胞重构胚的 卵裂率（P0.05），诱导精子样细胞ICSI形成囊胚的能力高于支持细 胞核移植重构胚和孤雌激活胚（P0.05），图3。2.5 RT-PCR 分析经过RT-PCF分析，诱导的精子样细胞表达 PRM-2（282bp）、TP1（ 175bp）、TP2（ 152bp）这三个单倍体的特异性标志基因，见图4。3讨论SSCs来源于原始生殖细胞，来源于胚胎的生殖干细胞可以 在体外，经RA诱导形成SSCs体内移植后，形成的SSCs可在无内 源精原干细胞的曲细精管种克隆增殖，直接参与精子发生的减数分裂 过程。已有研究证实维甲酸在分化精原细胞中起

16、着一定作用，精原细胞和支持细胞均有RA的核受体，还不清楚RA的促分化作用是直接的 还是经由支持细胞间接执行的。本试验用RA诱导SSCs生成精子样细 胞，并且用成年小鼠睾丸组织液作为条件培养液同样获得了精子样细胞，成年小鼠睾丸内复杂的促进精子生成的成分可能在体外诱导精子 样细胞方面发挥了重要作用。另外，我们低温培养法也使SSCs生成精子样细胞，因为精子的生成在睾丸内，睾丸的温度接近35 C,所以模拟精子生成的温度能促进 SSCs生成精子样细胞。流式细胞仪分析细胞的DNA含量，是通过检测插入DNA双螺 旋结构碱基对的核酸荧光染料被激发后的荧光强度得以实现。与正常小鼠成纤维细胞位置一致的 DNA单峰

17、为DNAX倍体。偏移预期正常二 倍体位置5 %的峰应疑为异倍体9。流式细胞仪用于睾丸细胞的分 拣，即2倍体细胞类群和4倍体细胞类群10，而减数分裂过程中， 睾丸生精上皮细胞，还含有单倍体细胞。通过流式细胞仪分拣，可以 对检测的细胞中是否含有单倍体细胞进行鉴定。本实验利用流式细胞 仪测定了体外诱导小鼠SSCs生成精子样细胞的DNA含量，结果表明 所获得的诱导细胞含有单倍体细胞，约占检测细胞的19.3%。体外显微受精试验，将获得的精子样细胞注入成熟卵母细胞 胞浆中，观察卵裂状况，可以证明精子生物学活性11，本实验检 测了 SSCs体外诱导精子样细胞在体外受精胚胎的发育能力，诱导精 子样细胞激活卵母

18、细胞成功率为 71.25%,囊胚发育率为20.36。实验 证明小鼠SSCs在体外可以诱导分化为精子样细胞，并且可以激活卵 母细胞体外发育到囊胚。（此文图1 4见附页6）（略）【参考文献】:1吴应积，罗奋华，薛晓先,等.绒山羊曲细精管生殖细胞的长期培养和精子发生过程的观察J.内蒙古大学学报(自然科学版),2005,36(4) :411 416.2 Izadyar F, Krista den Ouden, Laura B. Creemers. Proliferatio n and Differe ntiati onof Bovine Type ASpermatogonia During Long-

19、Term Culture J . Biology of Reproductio n,2003,68: 272-281.3 Feng L X, Chen Y, Dettin L, et al. Generation and in vitro differentiation of a spermatogonialcell line:J .Scienee, 2002, 297:392-395.4 Hofmann M C, Hess RA, Goldberg E, et al. Immortalized germ cells undergo meiosis in vitro J . Proc Natl Acad Sci USA,1994, 91: 5533-5537.5 Lee DR, Kaproth MT, Parks JE. In vitro production of haploid germ cells from fresh or froze n-thawed testicular cells of neonatal bulls J .Biol Reprod, 2001, 65(3):873-878.6 张学明,文兴豪，赖良学，等.性未成熟小鼠生殖细胞DOC格式论文，方便您的复制修改删减的发育J.中国兽医,2000, 20(3) : 273-279.7 Tsuda M, Sas