代谢工程课件[稻谷书店]

1、第三章 微生物的代谢调节和代谢工程 n 第一节 微生物代谢的自我调节 n 第二节 代谢调控 n 第三节 次级代谢产物的主要调控机制 n 第四节 代谢工程 1高级教学 【教学目的与要求教学目的与要求】掌握微生物自身代谢 和次级代谢的机理、有关概念及代谢调 控，了解代谢工程设计的方向。 【教学重点与难点教学重点与难点】微生物自身代谢和次 级代谢的机理、有关概念及代谢调控。 2高级教学 n微生物的生长繁殖和新陈代谢 n代谢类型： 主要依赖两种代谢途径： 分解代谢 合成代谢 3高级教学 n分解代谢:指复杂的有机物分子通过分解代谢 酶系的催化，产生简单分子、腺苷三磷酸 （ATP）形式的能量和还原力（或称

2、还原当量， 一般用H来表示）的作用。 微生物通过分解代谢从环境中吸收的各种碳源、 氮源等物质降解，为生命活动提供能源和小分 子中间体。 包括：中心途径如TCA、EMP、HMP及外围途径 （指碳源、氮源通过分解进入中心途径） 4高级教学 合成代谢 n与分解代谢正好相反，指在合成代谢酶系的催 化下，由简单小分子、ATP形式的能量和H形 式的还原力一起合成复杂的大分子的过程。或 利用分解代谢的能量和中间体合成氨基酸、核 酸等单体物质及蛋白质、多糖等多聚物。 n分解代谢与合成代谢是互相关联、互相制约， 是生命活动的基础。 n正常微生物的小分子物质的合成和降解是自身 调节。 5高级教学 研究微生物代谢调

3、节的意义 n十分重要，在工业上可通过对微生物的 代谢途径加以控制来满足生产的需要。 n如：谷氨酸发酵菌种： 6高级教学 微生物的代谢产物可分为： 1.初级代谢产物 定义：微生物通过代谢活动所产生的、自身生 长和繁殖所必需的物质。 举例：氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素 等。 特征： 不同的微生物初级代谢产物基本相同； 初级代谢产物合成过程是连续不断的， 与菌体的生长呈平行关系。 7高级教学 次级代谢产物 定义：微生物生长到一定阶段才产生的化学结构 十分复杂、对该微生物无明显生理功能，或 并非是微生物生长和繁殖所必需的物质。 举例：抗生物、毒素、激素、色素等。 特征： 不同的微生物次级代谢产物

4、不同； 次级代谢产物的通常在菌体的生长后期合成，发酵分 两个阶段进行，即营养增殖期和生产期。 在多数情况下，增加前体是有效的 8高级教学 两种代谢产物的不同： n1、次级代谢通常在生长后期合成。不是微生 物生长所必需的，不参与微生物的生长和繁殖。 n2、次级代谢对环境条件的变化很敏感，其产 物的合成往往会因环境条件的变化而停止。 n3、不同微生物的次级代谢产物有很大区别。 基于菌种的特异性 n4、催化次级代谢产物合成的某些酶专一性不 强。 9高级教学 第一节 微生物代谢的自我调节 微生物有着一整套可塑性极强和极精确的代谢 调节系统，以保证上千种酶能正确无误、有条 不紊地进行极其复杂的新陈代谢反

5、应。 10高级教学 n微生物细胞的代谢调节方式很多，例如可调节 营养物质透过细胞膜而进入细胞的能力，通过 酶的定位以限制它与相应底物的接近，以及调 节代谢流等。 n其中以调节代谢流的方式最为重要，它包括两 个方面，一是“粗调”，即调节酶的合成量， 二是“细调”，即调节现成酶分子的催化活力， 两者往往密切配合和协调，以达到最佳调节效 果。 11高级教学 微生物自我调节部位 n1养分的吸收和排泄 细胞膜 n2限制基质与酶的接近 n3控制通量： 调节现有酶量和改变酶分子的活性 n都涉及到酶促反应的调节 包括酶活性的调节和和酶合成的调节 12高级教学 一、酶活性的调节 酶活性的调节： 指在酶分子水平上

6、的一种代谢调节， 它是通过改变现成的酶分子活性来调节新 陈代谢的速率。 酶活性的抑制 激活 是微生物代谢中存在的两种矛盾的过程。 13高级教学 n酶活性的激活系指在分解代谢途径中，后面的 反应可被较前面的中间产物所促进。 n酶活性的抑制主要是反馈抑制，它主要表现在 某代谢途径的末端产物（即终产物）过量时， 这个产物可反过来直接抑制该途径中第一个酶 的活性，促使整个反应过程减慢或停止，从而 避免了末端产物的过多累积。 14高级教学 图：大肠杆菌代谢过程的抑制剂和激活剂 15高级教学 （一）酶活性的激活（一）酶活性的激活 n常见的酶活性的激活是前体激活，多发 生在分支代谢途径，即代谢途径中的后 面

7、的反应可被较前面的一种代谢中间产 物所促进。 如：粗糙脉胞酶的异柠檬酸脱氢酶的活 性受到柠檬酸的激活。 16高级教学 （二）酶活性的抑制（二）酶活性的抑制 n酶活性的抑制包括： 竞争性抑制 反馈抑制 反馈抑制：指反应途径中某些中间产物或末端产物 对该途径中前面反应的影响。 凡是反映加速地称为正反馈； 凡是反应减速的称为负反馈。 末端产物的反馈抑制普遍存在于合成途径中。 反馈抑制：直链式 分支代谢途径：两种以上的末端产物 17高级教学 反馈抑制的类型反馈抑制的类型 n1直线式代谢途径中的反馈抑制 18高级教学 2分支代谢途径中的反馈抑制。 反馈抑制的情况较为复杂。 为避免在一个分支上的产物过多时

8、不致 同时影响另一分支上产物的供应，微生 物已发展出多种调节方式。 19高级教学 n（1）同功酶调节 n同功酶是指能催化相同的生化反应，但酶 蛋白分子结构有差异的一类酶，它们虽同 存于一个个体或同一组织中，但在生理、 免疫和理化特性上却存在着差别。 n同功酶的主要功能在于其代谢调节。 20高级教学 n在一个分支代谢途径中，如果在分支点以前的 一个较早的反应是由几个同功酶所催化时，则 分支代谢的几个最终产物往往分别对这几个同 功酶发生抑制作用。 如：大肠杆菌天冬氨族氨基酸合成途径中，有三个同 工酶天冬氨酸激酶 分别受赖氨酸、苏氨酸、硫 氨酸反馈调节 21高级教学 n（2）协同反馈抑制： n指分支

9、代谢途径中的几个末端产物同时过量时才 能抑制共同途径中的第一个酶的一种反馈调节方 式。 n如：谷氨酸棒杆菌合成天冬氨族氨基酸时，天冬 氨酸激酶受赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制。 22高级教学 n（3）累积反馈抑制： 催化分支合成途径第一 步反应的酶有几种末端产物抑制物，但每一种 如过量，按一定百分率单独抑制共同途径中的 第一个酶活性，总的抑制效果是累加的，各末 端产物所起的抑制作用互不影响，只影响这个 酶促反应的速率。 n两种末端产物同时存在时，可以起着比一种末 端产物大得多的反馈抑制作用。 23高级教学 n（4）增效反馈抑制：代谢途径中任何一 种末端产物过量时，仅部分抑制共同途 径中的第一个酶

10、活性，但两个末端产物 同时过量时，其抑制作用可超过各产物 存在的抑制能力的总和。如6-氨基嘌呤 核苷酸和6-酮基嘌呤核苷酸合成途径。 24高级教学 n（5）顺序反馈抑制：每个分支末端产物 抑制分支后的第一个酶，产生部分抑制 作用。通过逐步有顺序的方式达到的调 节。 n如枯草芽孢杆菌的芳香族氨基酸合成途 径和球型红假单胞菌的苏氨酸合成途径。 25高级教学 n当E过多时，可抑制CD，这时由于C的浓度过大 而促使反应向F、G方向进行，结果又造成了另一 末端产物G浓度的增高。由于G过多就抑制了CF， 结果造成C的浓度进一步增高。C过多又对AB间 的酶发生抑制，从而达到了反馈抑制的效果。这 种通过逐步有

11、顺序的方式达到的调节，称为顺序 反馈抑制。 26高级教学 二、酶合成的调节（酶量）二、酶合成的调节（酶量） n酶合成的调节是一种通过调节酶的合成量进而酶合成的调节是一种通过调节酶的合成量进而 调节微生物的代谢速率。调节微生物的代谢速率。 这是一种在基因水平上（在原核生物中主要在这是一种在基因水平上（在原核生物中主要在 转录水平上）的代谢调节。转录水平上）的代谢调节。 有诱导调节和阻遏调节。有诱导调节和阻遏调节。 根据酶的生成是否与环境中所存在的 该酶底物或其有关物的关系，可把酶划分 成组成酶和诱导酶两类。 27高级教学 n有些酶的合成不依赖于环境中物质的存在（如有些酶的合成不依赖于环境中物质的

12、存在（如 糖酵解途径中的各种酶），称为组合酶。糖酵解途径中的各种酶），称为组合酶。 n另一些酶只有在它们催化的底物（或底物的结另一些酶只有在它们催化的底物（或底物的结 构类似物）存在时才能合成，此种酶称为诱导构类似物）存在时才能合成，此种酶称为诱导 酶。酶。 n凡能促进酶生物合成的现象，称为诱导。凡能促进酶生物合成的现象，称为诱导。 n能阻碍酶生物合成的现象，则称为阻遏。能阻碍酶生物合成的现象，则称为阻遏。 28高级教学 n与上述调节酶活性的反馈抑制等相比，调节酶 的合成（即产酶量）而实现代谢调节的方式是 一类较间接而缓慢的调节方式。 n其优点则是通过阻止酶的过量合成，有利于节 约生物合成的原

13、料和能量。 n在正常代谢途径中，酶活性调节和酶合成调节 两者是同时存在且密切配合、协调进行的。 29高级教学 （一）酶合成调节的类型（一）酶合成调节的类型 n1诱导 n诱导酶：另一些酶只有在它们催化的底物（或底另一些酶只有在它们催化的底物（或底 物的结构类似物）存在时才能合成，此种酶称为物的结构类似物）存在时才能合成，此种酶称为 诱导酶。诱导酶。 n诱导酶是细胞为适应外来底物或其结构类似 物而临时合成的一类酶。 30高级教学 n能促进诱导酶产生的物质称为诱导物， 它可以是该酶的底物，也可以是难以代 谢的底物类似物或是底物的前体物质。 n外源诱导物：外源加入的。 n内源诱导物：菌体代谢途径的某些

14、中间 产物也能诱导该途径的某些酶系的合成， 这些中间产物称为内源诱导物。 31高级教学 32高级教学 酶的诱导合成类型酶的诱导合成类型 n同时诱导同时诱导:当诱导物加入后，微生物能同时或几 乎同时诱导几种酶的合成，它主要存在于短的代 谢途径中。例如，将乳糖加入到Ecoli培养基 中后，即可同时诱导出-半乳糖苷透性酶、- 半乳糖苷酶和半乳糖苷转乙酰酶的合成； n顺序诱导顺序诱导:先合成能分解底物的酶，再依次合成 分解各中间代谢物的酶，以达到对较复杂代谢途 径的分段调节。 33高级教学 n2阻遏 在微生物的代谢过程中，当代谢途径中某 末端产物过量时，除用反馈抑制的方式来 抑制该途径中关键酶的活性以

15、减少末端产 物的生成外， 通过阻遏作用来阻碍代谢途径中包括关通过阻遏作用来阻碍代谢途径中包括关 键酶在内的一系列酶的生物合成，从而更键酶在内的一系列酶的生物合成，从而更 彻底地控制代谢和减少末端产物的合成。彻底地控制代谢和减少末端产物的合成。 34高级教学 n反馈阻遏：指代谢的终产物达到一定浓 度时，反馈阻遏该代谢途径的一种或几 种酶的生物合成。 n阻遏作用有利于生物体节省有限的养料 和能量。 n阻遏的类型主要有两种: 末端代谢产物阻遏 分解代谢产物阻遏。 35高级教学 （1 1）末端产物阻遏）末端产物阻遏 定义：指由某代谢途径末端产物的过量累积而引起 的阻遏。 n对直线式反应途径 ，末端产物

16、阻遏的情况较为简 单，即产物作用于代谢途径中的各种酶，使之合 成受阻遏。 36高级教学 n对分支代谢途径来说，情况就较复杂。 每种末端产物仅专一地阻遏合成它的那条分支 途径的酶。 n多价阻遏多价阻遏：有两种或两种以上的末端产物的分 支代谢途径中，当分支代谢途径中的几种末端 产物同时过量就反馈阻遏其分支点以前的共同 途径的“公共酶”的合成，仅一种产物过量无 阻遏作用。 n末端产物阻遏在代谢调节中有着重要的作用， 它可保证细胞内各种物质维持适当的浓度。 37高级教学 38高级教学 （2）分解代谢产物阻遏）分解代谢产物阻遏 定义：指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源） 或其分解产物存在时，被菌体迅

17、速利用的那种分解 底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。 n分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的碳源 本身直接作用的结果，而是通过碳源（或氮源等） 在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏 作用。 n因此，分解代谢物的阻遏作用，就是指代谢反应链 中，某些中间代谢物或末端代谢物的过量累积而阻 遏代谢途径中一些酶合成的现象。 39高级教学 两种调节的对比 酶合成的调节酶合成的调节酶活性的调节酶活性的调节 不同点不同点 调节对象调节对象 通过酶量的变化通过酶量的变化 控制代谢速率控制代谢速率 控制酶活性，不涉控制酶活性，不涉 及酶量变化及酶量变化 调节效果调节效果相对缓慢相对缓慢快速、精

18、细快速、精细 调节机制调节机制 基因水平调节，基因水平调节， 调节控制酶合成调节控制酶合成 酶分子水平调节，酶分子水平调节， 调节酶活性调节酶活性 相同相同 点点 细胞内两种方式同时存在，密切配合，高效、准细胞内两种方式同时存在，密切配合，高效、准 确控制代谢的正常进行。确控制代谢的正常进行。 40高级教学 三、能荷的调节三、能荷的调节 n能荷指细胞中ATP、ADP、AMP系统中可供利用的 高能磷酸键的量度。 n能荷调节（或称腺苷酸调节）：指细胞通过改 变ATP、ADP、AMP三者的比例来调节其代谢活动。 n细胞内3种腺苷酸含量不同，细胞的能荷状态不 同。能荷状态用“能荷”表示 1 2 能 荷

19、100% ATPADP ATPADPAMP 41高级教学 n当细胞内全部为ATP，能荷为100% n当细胞内全部为ADP，能荷为50% nATP可以认为是糖分解代谢的末端产物， 当ATP过量就对糖分解代谢产生反馈抑制， 当ATP降解为ADP，能量释放于其他的生 化反应，反馈抑制被解除。 1 2 能 荷100% ATPADP ATPADPAMP 42高级教学 R R曲线合成系统，如磷酸果糖激曲线合成系统，如磷酸果糖激 酶、柠檬酸合成酶等。酶、柠檬酸合成酶等。 U U曲线消耗曲线消耗ATPATP的酶系，柠檬酸的酶系，柠檬酸 裂解酶、磷酸核糖焦磷酸合裂解酶、磷酸核糖焦磷酸合 成酶成酶(PRPP)(P

20、RPP)等。等。 当能荷当能荷0.750.75，合成受到抑制，合成受到抑制， 酶活性急速下降，消耗酶活性急速下降，消耗ATPATP的的 酶活性急速上升。两系统在酶活性急速上升。两系统在 0.850.85处交叉，酶系达到平衡。处交叉，酶系达到平衡。 这种现象存在于许多生长状态这种现象存在于许多生长状态 的细胞中。细胞通过调节腺的细胞中。细胞通过调节腺 苷酸的比例，来协调分解代苷酸的比例，来协调分解代 谢与合成代谢的代谢速率。谢与合成代谢的代谢速率。 43高级教学 第二节 代谢调控 n微生物在正常生长条件下，可以通过自我调节使机 体内的代谢途径与代谢类型互相协调与平衡，通常 不会过量积累初级代谢产

21、物。在某种条件下，过量 积累的中间代谢产物也能够被诱导酶转化为次级代 谢产物。但在人为条件的控制下，可以使微生物过 量产生各种初级代谢产物和次级代谢产物。 n初级代谢产物控制比较简单。它的形成一般只需要 营养条件即可生成。 通过改变发酵工艺条件如pH、 温度、培养基组成和微生物遗传特性等，达到改变 菌体内的代谢平衡，过量产生所需要产物的目的。 44高级教学 n可通过发酵条件控制 n改变细胞的渗透性 n改变菌种的遗传特性 45高级教学 一、发酵条件的控制 n1 各种发酵条件对微生物代谢的影响 n同一种微生物在同样的培养基中进行培养时， 只要控制不同的发酵条件。就可能获得不同的 代谢产物。 n如：

22、啤酒酵母在中性和酸性条件下培养，可将 葡萄糖氧化生成乙醇和二氧化碳；当在培养基 中加入亚硫酸氢钠或在碱性条件下培养时，则 并不产生乙醇，而是产生甘油。 46高级教学 47高级教学 n控制不同的发酵条件，实际上是影响微 生物自身的代谢调节系统，而改变其代 谢方向，使之按人们所需要的方向进行， 进而达到获得高浓度积累所需要产物获得高浓度积累所需要产物的 目标。 48高级教学 2 使用诱导物 n许多与蛋白质、糖类或其他物质降解有关的酶 类都是诱导酶，在发酵过程中加入相应的底物 作为诱导物，可以有效地增加这些酶的产量。 n如：在木霉发酵生产纤维素酶中，加入槐糖可 以诱导纤维素酶的产生；木糖可以诱导半纤

23、维 素酶的生成。青霉素酰化酶可用苯乙酸为诱导 物。乙内酰胺酶发酵时，可以底物类似物为诱 导物增加酶的产量。 49高级教学 3 添加生物合成的前体 仅参与色氨酸的最后阶段的合成，如果在发酵中加入邻氨 基苯甲酸，虽然色氨酸对第一个酶的反馈抑制仍然存在， 但对由邻氨基苯甲酸合成色氨酸并无影响，使色氨酸的合 成可以不断进行，从而大幅度提高了发酵产量。 色氨酸生物合成途径色氨酸生物合成途径 50高级教学 4 培养基成分和浓度的控制 n培养基即要保证微生物机体生长需要，又要利于 代谢产物的合成，须考虑其的组成和浓度，尽量 避免培养基使用不当引起的分解代谢阻遏。 n在发酵培养基中通常采用适量的速效和迟效碳源

24、、 氮源的配比，来满足机体生长的需要和避免速效 碳、氮源可能引起的分解代谢阻遏。 例如，用甘油代替果糖作为碳源培养嗜热脂肪酵母， 可以使淀粉酶的产量提高25倍以上； 用甘露糖代替乳糖作为培养荧光假单胞菌的碳源， 使纤维素酶产量提高1500倍以上。 51高级教学 改变细胞透性 n在发酵过程中，可以控制使用那些影响细胞膜通 透性的物质作为培养基的成分，有利于代谢产物 分泌出来，避免了末端产物的反馈调节。 n例如，利用棒状杆菌的-酮戊二酸脱氢酶缺失突 变株，在葡萄糖培养基中发酵生产谷氨酸，当谷 氨酸浓度达到50mg/g(干细胞)时，由于反馈调节 作用，谷氨酸的合成便终止。若将细胞中的谷氨 酸释放出细

25、胞，而使胞内谷氨酸浓度降低，就可 以解除反馈抑制，使谷氨酸继续合成。 52高级教学 改变细胞的通透性的方法： 1、限制培养基中生物素浓度在15mg/L，控制细胞 膜中脂质的合成； 2、加入青霉素，抑制细胞壁肽聚糖合成中肽链的交 联； 3、还可加入表面活性剂如吐温80或阳离子表面活性 剂，将脂类从细胞壁中溶解出来，使细胞壁疏松， 通透性增加； 4、控制MnMn2+、ZnZn2+的浓度，干扰细胞膜或细胞壁的形 成。 另外，还可以通过诱变育种的方法，筛选细胞透 性突变株。 53高级教学 n同样增加细胞壁或细胞膜的通透性，对 某些胞外酶的分泌也有一定作用。如在 里氏木霉发酵过程中加入吐温80，可提 高

26、纤维素酶的产量。 54高级教学 改变菌种的遗传特性 反馈调节是微生物防止合成代谢产物 过量产生的重要机制，解除反馈调节作用 可以保证高水平积累各种代谢产物，除上 所述外，改变微生物的遗传特性，即改变 酶的活性或酶的合成系统，使之对反馈调 节不敏感，也能够达到过量生产代谢产物 的目的。 55高级教学 筛选抗反馈调节突变株筛选抗反馈调节突变株： 通过诱变育种的方法获得。包括营养缺 陷型突变株、抗反馈调节突变株、组成型 突变株、抗性突变株等的应用。 例如，在分支合成途径中，利用黄色 短杆菌抗-氨基-羟戊酸(苏氨酸的一种结 构类似物)的突变株发酵生产苏氨酸，由于 该菌株的同型丝氨酸脱氢酶对苏氨酸的反

27、馈抑制不敏感，可以使发酵液中苏氨酸的 浓度高达14g/L。 56高级教学 57高级教学 n在分支合成途径 中可以利用营养 缺陷型突变株生 产其中的一个末 端产物。 n选择高丝氨酸脱 氢酶营养缺陷型。 大量生产赖氨酸。 58高级教学 n在直链式合成途径中，不能利用营养缺陷型突 变株生产该途径中的末端产物，但可以利用这 种菌株生产中间产物。例如，利用谷氨酸棒状 杆菌营养缺陷型(转氨甲酰酶缺陷)可以大量积 累鸟氨酸。 n分支合成途径中，也可以利用双重营养缺陷型 生产某种代谢产物。例如利用谷氨酸棒状杆菌 的苏氨酸、甲硫氨酸双重营养缺陷型进行发酵， 可以过量合成赖氨酸，赖氨酸浓度可达50g/L。 A B

28、 C D E 59高级教学 n除了利用抗反馈调节突变株和营养缺陷型菌株 生产外，还可以利用既是抗反馈调节突变株， 又是营养缺陷型菌株的双重突变株进行氨基酸 发酵。 n例如，利用甲硫氨酸营养缺陷型和抗-氨基- 羟戊酸的黄色短杆菌过量合成苏氨酸； n利用酪氨酸营养缺陷型和抗对氨基苯丙氨酸的 谷氨酸棒杆菌高水平积累苯丙氨酸。 60高级教学 人工控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸？ 营养缺陷 61高级教学 第三节次级代谢产物的主要调控机制 n次级代谢是存在于某些生物如植物和某 些微生物中一类特殊的代谢类型，次级 代谢产物与人类的生活和健康长寿有着 密切的关系，因此对其的研究受到了广 泛地重视。研究最多

29、、最著名的是抗生 素，其他包括生长刺激素、生物碱、维 生素、色素、毒素等。 62高级教学 一、次级代谢的调节类型 n因为次级代谢产物的种类在不同的微生 物中非常不同，所以次级代谢途径远比 初级代谢复杂，其代谢调节类型的多样 亦可想而知。已知抗生素等次级代谢产 物生物合成的调控类型包括诱导调节、 碳分解产物调节、氮分解产物调节、磷 酸盐调节、反馈调节、生长速度调节等。 63高级教学 酶合成的诱导调节 n在次级代谢途径中，某些酶也是诱导酶，在底 物或底物的结构类似物存在时才会产生。 例如，卡那霉素-乙酰转移酶是在6-氨基葡萄糖- 2-脱氧链霉胺（底物）的诱导下才能合成。 参与展开青霉的棒曲霉素合成

30、的酶是被生物合成 中的中间产物6-氨基水杨酸、龙胆酰醇和龙胆 酰醛顺序诱导合成。 64高级教学 反馈调节 反馈调节在次级代谢产物的生物合成中有 着重要的作用，包括 n次级代谢产物的自身反馈调节、 n分解代谢产物调节、 n初级代谢产物的反馈调节。 65高级教学 1、次级代谢产物的自身反馈抑制 和反馈阻遏 n在多种次级代谢产物的发酵中，如青霉 素、链霉素、卡那霉素、氯霉素、嘌呤 霉素、霉酚酸、杀真菌素、麦角碱等的 生物合成途径中，都发现了末端产物的 反馈调节作用。 66高级教学 n例如：嘌呤霉素合成途径中，嘌呤霉素可以反馈 抑制其生物合成途径中催化最后一步反应的酶甲 基转移酶的活性； n卡那霉素合

31、成途径中，卡那霉素能够反馈抑制其 合成途径中催化最后一步反应的酶N-乙酰卡那霉 素转移酶的活性； n麦角碱合成途径中，麦角碱能抑制合成途径中的 二甲基丙烯色氨酸合成酶和裸麦素碱环化酶的 活性； n氯霉素合成途径中，氯霉素能反馈阻遏其合成途 径中第一个酶芳香胺合成酶的活性，但不影 响产生菌体内其他芳香化酶的活性。 67高级教学 n抗生素生产菌的生产能力与自身抑制所 需抗生素浓度呈正相关性，生产能力越 高的菌株，反馈抑制所需抗生素浓度也 越高。 n如产黄青霉Q176的生产能力为420g/ml， 受到抑制的浓度为2mg/ml ； n产黄青霉菌株RL1951的生产能力为 125g/ml，受到抑制的浓度

32、为 200g/ml 。 68高级教学 2分解代谢产物调节 定义：指易被菌体迅速利用的碳源和氮源 及其分解产物对其他代谢途径的酶类的 调节作用。 69高级教学 n在许多抗生素发酵中，都发现了葡萄糖的抑制 作用，如青霉素、盐霉素、春日霉素、吲哚霉 素、放线菌素、卡那霉素、新霉素、杆菌肽等。 次级代谢产物的生物合成，一般是在葡萄糖等 速效碳源耗至一定浓度才开始。除了葡萄糖外， 凡能促进产生菌生长速度的碳源，对次级代谢 产物生物合成都表现出抑制作用。次级代谢产 物的合成速率与产生菌的生长速率呈相反关系。 n例如，在放线菌素生物合成中的氧化酚嗯嗪合 成酶，受葡萄糖的阻遏。短杆菌肽合成中，葡 萄糖分解生成

33、的乙酸和丙酸，在低pH条件下对 短杆菌肽的合成产生阻遏作用。 70高级教学 n氮分解代谢产物调节也存在于次级代谢中。 n例如，以铵盐作为链霉素产生菌的唯一氮源时， 可以抑制链霉素的合成； n在利用烟曲霉生产三羟甲苯中，无机氮源有利 于菌体生长，但不利于三羟甲苯的合成； n氮分解代谢产物的阻遏作用也存在于头孢霉素 生物合成中。 71高级教学 3初级代谢产物的调节 某些初级代谢产物可以调节次级代谢产物的合成， 有两种情况： 1初级代谢产物和次级代谢产物的合成有一条共同的 合成途径，当初级代谢产物积累时，反馈抑制了 某一步反应的进行，而最终抑制了次级代谢产物 的合成。 2初级代谢产物直接参与次级代谢

34、产物的生物合成， 即初级代谢产物是次级代谢产物的生物合成的前 体，当此种初级代谢产物因为积累，反馈抑制了 它自身的合成时，必然也同时影响了次级代谢产 物的合成。 72高级教学 如：青霉素合成中， 赖氨酸的过量抑制 了同型(高异)柠檬酸 的合成，进而抑制 了-氨基己二酸的 形成，这样即抑制 了赖氨酸的合成， 也抑制了青霉素的 合成，因为赖氨酸 与青霉素的合成有 一段共同的合成途 径 73高级教学 (三)磷酸盐的调节 n在抗生素等多种次级代谢产物合成中， 高浓度磷酸盐表现出较强的抑制作用， 称为磷酸盐调节。磷是微生物生长繁殖 的必需元素，浓度为0.3300mmol/L时， 能支持微生物细胞的生长，

35、但当浓度超 过10mmol/L时，就能抑制许多抗生素的 生物合成。因此，磷酸盐是一些次级代 谢的限制因素。 74高级教学 n微生物合成的次级代谢产物途径的不同， 磷酸盐表现的调节机制也不同 。 75高级教学 1、磷酸盐能促进初级代谢，抑制菌体 的次级代谢 在微生物的代谢中，磷酸盐除影响糖代谢、细胞 呼吸及细胞内ATP水平外，还控制着产生菌的 DNA、RNA、蛋白质和次级代谢产物的合成。 如：向正在合成杀假丝菌素的灰色链霉菌培养液中 添加5mmol的磷酸盐，产生菌对氧的需要量显著 增加，抗生素的合成立即停止，同时细胞内的 RNA、DNA和蛋白质的合成速率恢复到菌体生长 时期的速率。当磷酸盐被耗尽

36、时，菌体的呼吸强 度，DNA、RNA和蛋白质的合成速率又降至抗生 素合成期的状态，抗生素重新开始合成。 76高级教学 2过量磷酸盐抑制次级代谢产物前体 的生物合成 n在链霉素合成中，肌醇是合成链霉胍的 前体(链霉胍是组成链霉素的亚单位)，是 由葡萄糖衍生来的。过量的磷酸盐能引 起菌体内焦磷酸浓度增高，焦磷酸是催 化6-磷酸葡萄糖向1-磷酸肌醇转化的6- 磷酸葡萄糖环化醛缩酶的竞争性抑制剂。 因此，培养液中磷酸盐浓度高时就抑制 肌醇的形成，则必然影响链霉素产量。 77高级教学 3磷酸盐阻抑次级代谢中的磷酸酯酶 在链霉素等的生物合成途径的最后一个 中间体，是无生物活性的磷酸化产物链霉素 磷酸酯。此

37、酯在磷酸酯酶的作用下生成相应 的链霉素和磷酸。另外在链霉素生物合成中 有三步是在磷酸酯酶作用下的去磷酸反应。 上述的磷酸酯酶受到无机磷酸盐的调节。所 以在链霉素等氨基糖苷类抗生素的发酵生产 时，要很好控制发酵培养基中的磷酸盐浓度。 78高级教学 (四)ATP的调节作用 n在研究四环素的生物合成过程中发现，产 生菌体内的ATP水平调节着四环素的合成。 79高级教学 n丙二酰CoA是四环 素合成的前体。 在菌体生长旺盛 期，乙酰CoA羧 化酶活性高，而 磷酸烯醇丙酮酸 羧化酶和羧基转 移酶的活力很低， 在四环素合成期 与其相反。 菌体生长时期，过量的无机磷和 ATP对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶抑制 作用

38、沿左侧途径进行， 合成时期沿绿色途径进行。 80高级教学 (五)产生菌生长速率的调节 在丰富培养基中进行的分批发酵动力 学研究表明，大多数发酵过程都分为生 长期和生产期。在生长期次级代谢产物 合成酶受到阻抑作用，次级代谢产物不 被合成。主要是一些抗生素合成酶受到 抑制或阻遏。 81高级教学 82高级教学 用恒化器培养法研究短杆菌肽S合成酶的合成 时发现，调节短杆菌肽S合成酶合成的是菌体的 生长速率。当稀释率高时(0.450.5/h)，合成 的酶量很少，降低稀释率，酶量就增加。限制不 同营养成分，出现最高酶活的稀释率是不同的。 限碳源时，酶的比活最高。由此提出调节次级代 谢产物生物合成的因子是菌

39、体的比生长速率，而 不是某种营养物质，在青霉素、四环素等的发酵 生产过程中，控制菌体的比生长速率，能提高发 酵水平，可能与调节菌体比生长速率有关。 83高级教学 次级代谢调节： 1酶合成的诱导调节 2反馈调节：次级代谢产物自身， 分解代谢产物的调节 初级代谢产物的调节 3磷酸盐的调节：促进初级代谢，抑制次级代谢； 过量抑制次级代谢的前体； 阻抑次级代谢的磷酸酯酶。 4ATP调节 5产生菌生长速率的调节 84高级教学 第四节 代谢工程 n代谢工程系指利用基因工程技术，定向 地对细胞代谢途径进行修饰、改造，以 改变微生物的代谢特性，并与微生物基 因调控、代谢调控及生化工程相结合， 构建新的代谢途径，生产新的代谢产物 的工程技术领域。 n在代谢工程设计中，主要有改变代谢流、 扩展代谢途径和构建新的代谢途径三种. 85高级教学 一、改变代谢途径 n改变代谢途径是指改变分支代谢途径的 流向，阻断其他代谢产物的合成，以达 到提高目标产物的目的。 n改变代谢途径有各种方法，如加速限速 反应、改变分支代谢途径流向、构建代 谢旁路、改