细胞凋亡与角膜移植免疫反应关系的初步研究资料

1、细胞凋亡与角膜移植免疫反应关系的初步研究作者：杨朝忠，张 军，华 山，吴艳蕊，祝东升，马路生【摘要】 目的研究细胞凋亡信号分子Fas和细胞凋亡因子FasL在新鲜及深低温保存后角膜的表达情况、角膜细胞凋亡情况及其与角膜移植免疫排斥反 应的关系。 方法 （1）对 35 例角膜移植手术（ 25例新鲜角膜、 10 例冷冻保 存）剩余组织应用免疫组织化学 SABC法分别进行Fas和FasL蛋白染色。（2） 应用 Tunel 法对上述标本进行细胞凋亡的研究。（ 3）观察 35 例部分穿透性角 膜移植免疫排斥反应发生发展情况。结果 （1）角膜细胞Fas蛋白及FasL蛋白均为细胞质和（或）细胞膜着色。角膜上皮

2、细胞、基质细胞及内皮细胞 Fas 蛋白均呈阳性表达。角膜上皮细胞及内皮细胞FasL蛋白均呈阳性表达，而角膜基质细胞则无FasL蛋白表达。新鲜角膜和冷冻保存后角膜的 Fas、FasL蛋白阳 性表达量经统计学分析差异无显著性。（ 2）凋亡的角膜细胞均为细胞核着色。 25例新鲜角膜平均每高倍视野可见凋亡细胞（ 1 .788 0.62 1 ）个，经冷冻保存 后的角膜（ 10例）每高倍视野可见凋亡细胞平均为（ 8.1642.126）个，经统 计学处理Pv 0.05，差异有显著性。（3）角膜移植免疫排斥反应发生与角膜的 新鲜程度有关，新鲜角膜部分穿透性角膜移植术后612个月的免疫排斥反应发生率为12%（3

3、/25 ），深低温保存角膜移植后612个月的免疫排斥反应发 生率为10% （1/10），二者差异无显著性（P 0.05）。结论（1）新鲜和深低温保存后的角膜均可见Fas、FasL蛋白的表达。其中Fas在角膜上皮、基质 和内皮细胞均表达，FasL在角膜上皮、内皮细胞表达，而基质细胞不表达。（ 2）新鲜角膜可见极少量凋亡细胞，角膜经深低温冷冻保存后，凋亡细胞数量 显著增加。降温 -复温损伤可能与细胞凋亡有关。（ 3）角膜移植免疫排斥反应 发生与角膜的新鲜程度有一定关系，深低温保存后角膜的抗原性可能降低，不 易引起免疫排斥反应的发生。【关键词】Fas蛋白；FasL蛋白；凋亡；角膜移植免疫排斥【 Ab

4、stract 】 Objective To investigate the relationship between expression of Fas/FasL and apoptotic cells in normal cornea and deep cryopreservative with cornea graft rejection in human.Methods SABC immunohistochemistry method was applied to study the expression of Fas/FasL in paraffin-embeded sections

5、of 35 cornea.The tunel(TdT mediated biotin dUTP nick-end labeling， TUNEL)technique was used to study whether apoptosis would happy in both normal cornea and deep cryopreservative in human. Results In all positive cells ， Fas/FasL were kytoplasm and cell membrane was stained.The positive expression o

6、f Fas protein was detected in 35/55 cornea ， so was Fasl protein.Fas protein is expressed in cornealepithelial，keratocyte and endothelial cells.FasL ligand protein wasdetected in corneal epithelial and endothelial， neither waskeratocyte cells.The number of apoptotic cells was significantly higher af

7、ter cryopreservation(8.164 2.126) than noncryopreservation(1.788 0.621) ( Pv 0.05).The rate of cornea graft rejection was12%(nomal cornea) and 10%(cryopreservative cornea). Conclusion Fas protein and FasL ligand protein expressed in all cornea were not related to cryopreservation.The freeze-thaw tra

8、uma was maybe related to cryopreservation-induced cell apoptosis.It may reduce the rate of cornea graft rejection.【Key words 】 Fas protein ；FasL protein ；apoptosis ；cornea graft rejection角膜病是常见的致盲眼病，居致盲眼病的第二位。角膜移植手术是治疗 角膜盲的重要手段。角膜材料的质量是影响角膜移植手术成功与否的主要因 素。在保存过程中角膜细胞特别是角膜内皮细胞常受损，其可能的机制为死亡 和细胞凋亡。 Fas/F

9、asL 是与细胞凋亡密切相关的一对基因。 FasL 在角膜的广泛 分布对维持角膜的免疫赦免地位和角膜移植的高成功率有重大意义。目前，角 膜 Fas/FasL 及细胞凋亡与角膜移植免疫排斥反应关系的研究尚少。本文就细胞 凋亡与角膜移植免疫排斥反应关系的初步研究结果报告如下。1 对象与方法1.1 研究对象35例（35眼）角膜移植患者系20002002年随即就诊，为单纯性角膜白斑，植片为 77.75mm部分穿透性角膜移植，男23例（23 眼），女 12例（12 眼）；角膜为本院眼库提供， 25例新鲜角膜， 10例为深低温 冷冻保存角膜。手术时将剩余角膜用 4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，5ym切 片

10、。冷冻保存法采用简易二步法深低温保存 1，冷冻时间 1 周10个月， 平均冷冻时间为（ 5.123.47）个月。1.2 试剂及主要器械Fas、FasL蛋白染色及Tunel法细胞凋亡试剂（武汉博士德公司分装的即用型试剂盒）；深低温保存角膜试剂有二甲基亚 枫（DMSO，20%人血白蛋白，液氮，QL-H型生物降温仪。1.3 实验方法1.3.1 Fas、FasL蛋白免疫组织化学检测方法采用即用型SABC法。阳性对照组：Fas、FasL试剂盒中自带阳性对照片作为阳性对照组；阴性 对照组：用PBS代替一抗作为阴性对照组。1.3.2 细胞凋亡检测 采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的 DNA缺 口 生物素-dUT

11、P标记法2（ TdT mediated biotin dUTP nick-end labeling，TUNEL原位标记。1.4 实验结果判断1.4.1 Fas 、FasL 判断 以细胞膜和（或）细胞质有清晰棕黄色颗 粒着色为阳性染色细胞，细胞膜或细胞质无清晰棕黄色颗粒或无着色为阴性。1.4.2 凋亡细胞判断 以细胞核呈棕黄色着色为阳性染色细胞，胞 核无棕黄色着色为阴性细胞。每张切片随机取 6 个视野（高倍镜下）记数，取 平均值为该片凋亡细胞数。1.5 统计学方法 根据资料性质，分别采用完全随机设计资料的方 差分析和t检验。Pv 0.05为差异有显著性。本实验所有统计均用 SPSS统计软 件包进

12、行统计分析。2 结果2.1 角膜细胞Fas蛋白及FasL蛋白全为细胞质和（或）细胞膜着色 35例角膜上皮细胞、基质细胞及内皮细胞 Fas蛋白均呈阳性表达。角膜 上皮细胞及内皮细胞FasL蛋白均呈阳性表达，而角膜基质细胞则无FasL蛋白表达。新鲜角膜和冷冻保存后角膜的 Fas、FasL蛋白阳性表达量经统计学分析 差异无显著性。2.2 细胞凋亡检测结果2.2.1 凋亡细胞特征 发生凋亡的细胞皱缩，核的改变最明显，典 型的染色质断裂、分离、浓缩形成密集颗粒，聚集于核被膜下呈新月形或帽 状。继续发展可出现凋亡小体，其特点是具备完整的膜状结构，胞膜表面微绒 毛消失，内容物除了胞质以外，主要含有降解的染色

13、质片段。本实验采用 Tunel方法检测，DAB乍为显色底物，显微镜下观察，细胞核含有棕黄色颗粒的 细胞即为阳性细胞。2.2.2 深低温保存与角膜细胞凋亡的关系 本实验结果发现，所有 阴性对照组均未见 Tunel 阳性细胞；阳性对照组可见大量 Tunel 阳性细胞。新 鲜角膜仅在上皮层偶发现少许凋亡细胞，经冷冻保存后，凋亡细胞显著增加， 上皮、基质和内皮细胞层均可见到凋亡细胞。见表 1。表 1 新鲜角膜及冷冻保存后凋亡细胞情况（ xs）由表 1 可见，深低温冷冻保存后角膜的凋亡细胞数量明显较新鲜角膜增 加，二者差异有显著性（Pv 0.05），冷冻-复温损伤与细胞凋亡可能有关。2.3 角膜移植免疫

14、排斥反应发生与角膜的新鲜程度有关 新鲜角膜部分穿透性角膜移植术后612个月的免疫排斥反应发生率为12%（3/25 ）, 深低温保存角膜移植后612个月的免疫排斥反应发生率为10% （1/10 ），二 者差异无显著性（P 0.05 ）。3 讨论角膜的高度透明性是实现视觉器官正常生理功能的重要条件之一，而解 剖形态完整和生理功能正常的角膜内皮层对于保持角膜的半脱水状态、正常厚 度及透明性起着关键性作用。当各种原因致角膜内皮细胞降至其生理界限值以 下时，就会产生功能失代偿，导致角膜水肿进而混浊。据报道角膜盲占全球盲 目的 1/33，穿透性角膜移植手术是其复明的主要治疗方法。眼库的设立使 这些患者行角

15、膜移植手术的可能性大大增加，但是供体角膜来源的短缺及术后 免疫排斥反应的发生直接影响着角膜移植手术的开展和成败4。故提高眼库保存技术和保存质量尤为重要。目前，眼库常用的角膜保存方法有短期（湿 房）、中期及长期（深低温）保存法 5。其中深低温保存法保存角膜时间最 长，可为无眼库地区提供角膜。但一些因素，如供体角膜离体时间、降温和复 温的速率、保存液的组分等均可影响角膜保存质量、导致角膜细胞尤其角膜内 皮细胞损失，其可能的机制一为死亡，二为细胞凋亡。凋亡是一种基因介导的生理过程 6，在多细胞生物体的胚胎发育分 化、组织塑型、组织自稳的维持和调节、组织受损后细胞再生及肿瘤回退过程 中都起着重要的作用 7， 8。分子生物学研究发现有大量的基因与细胞死亡 和抗细胞死亡有关。在这些基因中有 Ced-3（IL- 1B转换酶样半胱氨酸蛋白 酶） 、 p5 3 （一种肿瘤抑制因子 ）、bc1-2 （一种细胞凋亡抑制基因） 、 bax（bc1- 2家庭成员之一）。Fas和FasL也在其中，二者构成了一条独特的细胞凋亡通 路，参与了多种疾病的病理生理过程，具有潜在的临床应用价值，已成为凋亡 研究领域的新热点。Fas是新近发现的细胞凋亡的信号分子9, 10, Fas基