纤维素酶分析研究进展及固定化技术

1、纤维素酶研究进展及固定化技术摘要：纤维素酶是一类能够水解纤维素的3-D-糖苷键生成葡萄糖的多组分酶的总称。传统上将其分为3类：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和伕葡萄糖苷酶。纤维素酶属于糖苷水解酶类，近年来，根据氨基酸序列的同源性以及纤维素 酶结构的相似性，将其分成不同的家族。本文介绍了纤维素酶的研究进展，主要包括纤维 素酶的性质及作用机理，应用与发展趋势，来源及生产技术，分离纯化方法，最后介绍几 种常用的纤维素酶固定化方法。关键词：纤维素酶；研究进展；固定化引言:纤维素是地球上分布最广、蕴藏量最丰富的生物质，也是最廉价的可再生资源。纤维素酶 是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，它们协

2、同作用，分解纤维素产生 寡糖和纤维二糖，最终水解为葡萄糖。自1906年Seilliere在蜗牛的消化液中发现纤维素酶至今已有一百余年了，随着在工业上的广泛应用，特别是在纺织工业、能源工业上的应用， 纤维素酶已成为最近十几年酶工程研究的一个焦点。近年来有关纤维素酶的研究，包括酶 的氨基酸序列、基因的克隆与表达、酶蛋白的空间结构与功能，以及酶蛋白的基因调控等 诸多方面都取得显著进展。到目前为止，登记在Swiss-Protein数据库的纤维素酶的氨基酸序列有649条，基因序列有433条。我国对纤维素酶的研究始于上世纪50年代，迄今已有50多年的历史。在纤维素酶的菌种开发、发酵培养、基因 的克隆与表达

3、、纤维素酶的固定化，以及纤维素酶在纺织、能源等方面的应用都取得较大 进展。1纤维素酶的性质及作用机理纤维素酶分子的大小因来源不同而不尽相同，三大类酶分子量一般在23Kda146Kda之间。多数真菌和少数细菌的纤维素酶都受糖基化，糖基与蛋白之间以共价键结合，或呈可解 离的络合状态。糖基化作用在一定程度上保护酶免受蛋白酶的水解，而纤维素酶正是由于 糖基化，使其所含碳水化合物的比率在不同酶之间发生差异，导致酶的多形式和分子量的 差别。通过比较分析，人们发现许多不同纤维素酶间表现出一定的同源性，且纤维素酶分 子普遍具有类似的结构。由球状的催化结构域（CD、连接桥和纤维素结合结构域 （CBD三部分组成。

4、（1连接桥，可能是保持 CD和CBD之间的距离，也可能有助于不同酶分子间形 成较为稳定的聚集体；（2纤维素结合结构域，它对酶的催化活力是非必需的，但它执行调 节酶对可溶性和非可溶性底物专一性活力的作用，其结合纤维素的作用机理目前尚不十分 清楚；（3催化结构域，它体现酶的催化活性及对特定水溶性底物的特异性。尽管不同来源 纤维素酶的分子量大小差别很大，但它们催化区的大小却基本一致。研究表明，EG和CBH能引起纤维素的分散和脱纤化。纤维素酶通过打乱纤维素的结晶结构，使其变形，深入纤维素分子界面之间，从而使纤维素孔壁、腔壁和微型隙壁的压力增大 ，水分子的介入又使纤维素分子之间的氢键被破坏，产生部分可溶

5、性的微结晶，利于进一 步被降解。1），对纤维素分子的吸附作用：纤维素酶对纤维素的降解，一般首先吸附到纤维素上，但并不是吸附的越好催化效果约好。纤维素酶的吸附不仅与酶本身性质有关， 也与底物的特性密切相关。其吸附能力大小与酶的含糖量和疏水性均有关联。此外，纤维 素酶的吸附机理并未弄清，仍需做进一步研究。2 ），单一纤维素酶的作用机制：纤维素酶的断键机理遵循双置换机制。即作用部分的两个色氨酸参与基质结合，而处在将被裂解 的键及相邻一个非离子化的甘氨酸和一个离子化的谷氨酸残基参与催化作用。这些残基被 非极性化的侧链围绕，以促进质子转移，打断N乙酰粘质酸一 N乙酰氨基葡萄糖酸。谷氨酸位于细菌和真菌CB

6、H、EG和葡萄糖苷酶的催化位点已被人们证实，也有的纤维素酶中 天门冬氨酸、组氨酸和精氨酸位于催化位点参与催化反应。的纤维素酶是当前纤维素酶的主要研究趋 势。3 纤维素酶的来源及生产技术工业生产的纤维素酶主要由真菌产生，如木霉、青霉、曲霉以及腐质霉等。其中最著名的是T.reesei,它产生的纤维素酶具有酶谱全、活力高的特点。自20世纪60年代以来，从野生菌株 T.reeseiQM6a出发进行了大量的筛选育种工作，其中QM9414、RutC30和MCG77能够产生较高的内切型和外切型葡聚糖酶活力，是目前国内外生产酸性纤维素酶的主要菌种。腐质霉是中 性纤维素酶的重要生产菌种；黑曲霉产生的纤维素酶可以

7、用于食品工业；青霉除了产生大 量的纤维素酶外还可产生较高的葡萄糖苷酶，可以弥补木霉产葡萄糖苷酶不足的缺点。细 菌和放线菌等也能够产生纤维素酶，它们产生的纤维素酶往往具有耐碱耐热的特点，如洗涤剂工业用的碱性纤维素酶就是由嗜碱芽胞杆菌产生。细菌产生的纤维素酶除了传统的内 切、外切纤维素酶外，还会分泌一种纤维小体 （cellu-1osome到胞外，纤维小体由多种纤维素酶和半纤维素酶组成，具有较高的水解纤维素的 能力，在纤维废弃物的处理上具有很大的应用潜力。纤维素酶的生产主要有液体和固体发酵两种形式。液体深层发酵（Liquid Submerged Fermen-tation，LSF适于大规模工业生产，

8、是目前国际上的主要生产方式，但发酵成本较高。固体发酵 （Solid-StateFermentation，SSF以农作物秸秆等纤维废弃物为主要原料，工艺简单，成本低廉，节约 水源，目前国内绝大部分纤维素酶生产厂家均采用固体发酵生产纤维素酶。然而固体发酵 法也存在容易杂菌、产品质量不稳定等弊端。通过菌种改造以及发酵工艺的改进，T.reesei生产纤维素酶的能力得到了很大的提高。选择优良的菌种是提高纤维素酶活力的关键，但 还需要有适当的生产方法和培养条件才能充分发挥优良菌种的性能，得到较高的酶产量。 纤维素酶的生产历史比较短、规模比较小、酶活力也比较低，生产工艺需要进一步研究和完善。兀 l=r o3

9、.1 纤维素酶固态发酵固态发酵是指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水不溶性固态基质中，用一种或多种微生物发酵的一个生物反应过程。固态发酵具有许多独特的优势：1），可使微生物保持自然界中的生长存在状态，模拟自然的生长环境，这是许多丝状真菌适宜 采用固态发酵的主要原因之一。 2），产品的后处理过程简单，许多产品可以直接烘干而无需提取，产品宜于贮藏、运输，而且 稳定性好。 3），固态发酵过程中，由于没有废水的产生，因此，没有环境污染问题。4），在需要大量供氧的固态培养时，空气通过固体层的阻力较小，能量消耗小。传统的的 固体培养方法包括薄层的曲盘培养、帘子培养和厚层的通风培养等。生产上常用的

10、是厚层 通风培养，亦称厚层通风曲或箱曲，设备比较简单，易于推广，但容易污染杂菌，温度和 湿度不易控制，大规模生产难于稳定。现代固态发酵是在密闭容器的固态发酵反应器中进 行，采用单一菌株纯种或限定菌株混合发酵，扩大了固态发酵的应用范围，适宜于分离纯 化高附加值产品，但同时增加了操作能耗，设备投资较大，需要无菌处理发酵原料。根据 固态发酵反应器形态可分为 9种类型的固态发酵反应器：转鼓式；木盒式；加盖盘式；垂直 培养盒式；倾斜接种盒式；浅盘式；传送带式；圆柱式；混合型式。而以基质的运动情况则可以分为两类：静态固态发酵反应器，包括浅盘式和塔 柱式反应器；动态固态发酵反应器，包括机械搅拌的简、柱式、转

11、鼓式反应器等。纤维素酶固态发酵过去主要采用传统酿酒制曲工艺技术。纤维素酶固态发酵影响因素主要 有以下几个： 1）基质：用于纤维素酶生产的固态基质主要是含纤维素的麸皮、麦草、农 作物秸秆等，它们当中还存在纤维素酶基因表达的诱导物质。天然植物纤维性物质因含有 木质素，直接生物利用相对困难。汽爆处理的纤维质原料，特别是草类原料，木质素已部 分被降解，是很好的固态产纤维素酶的基质。2）培养基：含水量及空气湿度水是发酵的主要媒介，纤维素酶固态发酵基质含水量与水分活度有关，影响到真菌的生长状态水分含 量还影响到底物的物理状态 营养物质、氧和二氧化碳的扩散等，基质含水量因菌种及原料而异。3）通气：合成纤维素

12、酶的真菌是好氧菌，菌丝生长过密会增加气体流动阻力，也影响水分的蒸发。在培养料 中添加滞留水能力强的基质或增加空气的湿度可避免强制通风引起的水分过分损失。4）温度：固态基质热传导性差，导致热量对流及传热效率低下，加大通风，加快水分的蒸发 可有效地带走发酵产生的热量。 5 ）固体基质粒度：小颗粒能增加比表面积，空气更容易 进入颗粒内部，也增加了容积密度，但颗粒过小使通风变得比较困难。总体而言，目前固态发酵技术相对落后，但因为投资少、生产成本低、工艺简单等原因在 许多发展中国家得到较多的应用。目前固态发酵存在的主要问题是缺乏自动化、成本低的 经济高效固态生物反应器，发酵过程操作粗放、劳动强度大、容易

13、染菌。而目前机械化的 固态生物反应器往往具有自动化程度不高、结构不够合理、使用不够方便、成本相对较高 等缺陷，远未达到经济实用的程度。现代发酵工业的发展方向是高浓度、高黏度发酵液。 而高浓度、高黏度的极限就是固态发酵基质。因此，新型固态发酵是今后的发展方向。3.2 纤维素酶液体深层发酵液体深层发酵使用液态培养基，一般在强化传质和传热的发酵罐中进行。发酵罐形式主要 有通用式搅拌罐和气升式发酵罐。操作方式主要有分批培养、补料分批培养和连续培养等 方式。通用式搅拌罐是最常用的罐型，技术成熟，容易控制；但机械搅拌耗能较高，采用 过快的搅拌速度还会损伤菌丝，影响酶的产量。气升式发酵罐依靠气体带动液体循环

14、，没 有搅拌装置，结构相对简单，设备成本也低一些，但通气量一般大于搅拌罐，并且容易产 生泡沫。就操作方式而言，分批培养最简单，不易染菌，是常用的操作方式。缺点是产酶 时间较短，辅助时间占较大比例，降低了生产效率。补料分批培养具有分批培养容易控制 的优点又延长了产酶时间，是比较理想的操作方式。连续培养生产效率高，生产期长但易 染菌，相对难以控制，工业上应用较少。纤维素酶主要在细胞生长的中后期产生，而在连 续培养中由于细胞一直处于旺盛生长状态，不利于纤维素酶的生产。因此，连续培养生产 纤维素酶主要用于固定化细胞产酶。产生泡沫是纤维素酶液体深层发酵的问题之一，对于气升式发酵罐而言问题更加严重。泡 沫

15、的产生主要有三个原因： 1）泡沫是由培养基中含有的蛋白质引起的；2）这部分蛋白质与纤维素结合时，产生了稳定的泡沫，很难处理；3）在发酵过程中产生的大量可溶性蛋白质，主要是纤维素酶，也是引起泡沫的一个原因。泡沫严重时，出现 ”逃液 ”现象，使 产物流失，并导致染菌，同时大量的泡沫会使酶变性，降低产量。通常的泡沫控制方法是 采用间歇式补加消泡剂来抑制泡沫的产生，但加入消泡剂也有负面影响，不利于氧的溶解 和酶的分离纯化。因此，采用机械装置进行消泡是另一个选择，但这样会增加设备的复杂 性和设备成本。相对于固态发酵，液体深层发酵的主要优点是技术成熟，自动化程度高，培养条件容易控 制，不易染杂菌和设备通用

16、性强。主要缺点： 1）能耗大，不仅搅拌能耗大而且供氧的空 气需要克服很深的液层压力，消耗很大能量； 2）培养基中原料允许浓度低，高的也只有 百分之十几，低的为百分之几，甚至更低，致使产物浓度低，产品分离纯化困难，发酵和 分离设备体积常庞大； 3）机械搅拌对细胞易造成损伤，培养基非牛顿流体力学特性及过 多的固体纤维素引发的氧传质限制直接影响了产酶菌株的生长代谢，对于搅拌式发酵罐而 言，通过调整搅拌转速和通气量可以调节溶氧量，但有文献报道，过高的搅拌对纤维素酶 产率和酶活有负面影响； 法，还原糖的测定采用 3,5一二硝基水杨酸 （DNS 法。以下介绍一些常用的纯化方法：4.1 盐析法 盐析法就是在

17、溶液中加入中性盐使各种蛋白质依次分别沉淀的方法。其原理是根据蛋白质 在溶液中由于表面带电的氨基酸残基与溶剂分子相互作用，所以能保持溶解状态，当加入 盐离子时，蛋白质分子周围所带电荷增加，促进了与溶剂分子的相互作用，使溶解度增加 ，此现象称为盐溶。在盐浓度较低时以这种情形为主。但当盐浓度继续增加达到一限量， 大量盐离子使水浓度相对降低，蛋白质的水化作用减弱，相互凝聚而沉淀下来，称为盐析 。选择一定浓度范围的盐 （如 025%饱和度硫酸铵 使杂质蛋白沉淀而有效成分呈盐溶状态 ，经离心分离得到上清液后，再选择一定浓度范围的盐溶液使有效成分等物质呈盐析状态 而另一部分杂质呈盐溶状态，用离心法收集的沉淀

18、物即为初步纯化的有效成分物质。此法 是蛋白质进行分级沉淀时常用操作步骤，常选用的盐是硫酸铵。4.2 凝胶过滤 凝胶过滤又叫分子筛层析，是利用分子筛效应分离纯化生物大分子和测定其分子量及样品 脱盐的一种色谱方法。凝胶过滤层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致的球 状颗粒。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子物质，而不能排阻某些小分子化合物。 当样品进入色谱柱时，由于被分离物质的分子质量不同，较大的分子不能通过孔道进入凝 胶颗粒的微孔内部，与流动相一起先流出色谱柱；分子质量小的物质可通过部分孔道，更 小的分子可通过任意孔道进入珠体内部。这样小分子向下流动的速度必然比大分子慢，结 果是分子质

19、量大的物质先从柱中流出，分子质量小的则后从柱中流出而达到分离的目的。 凝胶过滤具有设备简单、操作方便、重复性好及样品回收率高等特点所以该方法除了常用 于分离纯化蛋白质、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物质外，还可以测定蛋白质的 分子量、样品浓缩和脱盐等方面。4.3 亲和层析 亲和层析的原理与抗原 -抗体、酶 - 底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力，在亲和层析中是特 异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力。将具有识别能力的载体L 以共价键的方式固化到含有活性基团的基质 M 上，制成亲和吸附剂 M-L,又称为固相载体。当把固相载体装入小层析柱后，将欲分离的样品液通

20、过该柱，此时 样品中对配体有亲和力的物质 S可借静电引力、范德华力等作用吸附到固相载体上，无亲 和力的物质被起始缓冲液洗涤出来，形成了第一个层析峰，然后适当地改变起始缓冲液的pH或增加离子强度等方法，把物质 S从固相载体上解离下来，并形成第二个层析峰，可以将 有效成分与杂质较好地分离开来。使用亲和层析法，不论加入何种样品液，由于柱体积小 、上样量大、洗脱流速快等原因，都只能得到一个层析峰，所以分辨率高。本法广泛应用 于分离纯化蛋白质、核酸、激素等物质。4.4 离子交换层析 离子交换层析是根据物质所带电荷的差别进行分离纯化的方法。离子交换剂以纤维素、葡 聚糖凝胶等不溶性物质为母体，通过醚化或氧化

21、等化学反应，引入阳性或阴性离子的特殊 制剂，可与带相反电荷的化学物质进行交换吸附。对于呈两性离子的蛋白质、酶类等物质与离子交换剂的结合力，取决于它们的物理化学性质和特定pH条件下呈现的离子状态。当pH低于等电点（pl时，被阳离子交换剂吸附；反之被阴离子交换剂吸附。对于呈胶体状态 的大分子物质一般使用选择性好的弱酸性离子交换剂。离子交换层析法是常用的层析方法 之一，广泛应用于多种生化物质的分析、制备、纯化等。4.5 高效液相色谱 （HPLC又称为高速或高压液相色谱，其分离或纯化各种化合物的原理基本上与普通的液相层析相 似。但高效液相色谱具有灵敏、快速、分辨率高及重复性好等特点，不仅适用于很多不易

22、 挥发、难热分解物质 （如蛋白质、氨基酸及其衍生物、核酸、激素、单糖、寡糖等的定性和定量分析，而且也适用于上述物质的制备和分离。特别是近十年来出现了几种与HPLC相近的快速蛋白液相色谱 （FPLC、低压液相色谱（LPLC和中压液相色谱（MPLC，其中FP LC能在惰性环境下，以极快的速度通过成百上千次层析把复杂的混合物分开，如果连续进 样，短时间内能制备出大量的欲纯化物质。4.6 电泳 电泳是带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。当把一个带净电荷 的颗粒放入电场时，就会受到电场力的作用，带电颗粒在电场中向一定方向泳动，速度与 电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒半径和豁

23、度成反比。当颗粒是两性电介质 性质的蛋白质分子时，它在一定 pH溶液中电荷量是独特的。由于不同的蛋白质等电点和分 子量是不同的，因此经泳动后就形成了泳动度不同的区带。利用此性质，可以将混合液中 不同的蛋白质区分开，同时也可以对其纯度进行测定。现在电泳法已成为开展生物化学和分子生物学研究的必不可少的常规工具。5 纤维素酶的固定化纤维素 酶可用于将纤维素转化为可发酵糖，进而生产燃料乙醇。由于天然纤维素酶多为一 次性直接使用，使用成本高，阻碍了该转化过程的工业化。采用纤维素酶的固定化，有利 于酶的回收和再利用，有望解决该酶生产应用的实际问题。固定化酶与游离酶相比，具有 不可比拟的优点，主要表现在：首

24、先，酶与产物易于分开，因而可以回收再利用；其次， 在一定程度上可以改善酶的操作性能和稳定性；第三，可以多次反复使用和连续操作，降 低生产成本；第四，酶不混入产物，可以精简分离工序等。固定化酶的制备方法分为载体 结合法、包埋法、交联法 3种。以下介绍一些常用的纤维素酶固定化方法：5.1 肠溶衣聚合物固定化纤维素酶 该法选用国内固定化酶方面研究较少的 EudragitL- 100为载体，采用物理吸附法，制备出具有可溶-不可溶性质的固定化纤维素酶。肠溶衣聚合物是一类固定化酶效果很好的S-IS载体，S-IS载体是指随着着溶液某个特定条件如pH值、温度的变化，或加入了某种金属离子，其溶解性质会改变的聚合

25、物。这种载体克服了不溶性和可溶性载体存在的缺点，可以在可溶状 态进行水解反应，在不可溶状态下方便回收。Eudragit 是一种包括甲基丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸酯共聚物的肠溶衣聚合物，由于其结构中含有羧基，在水中很容易与碱生成盐而溶 解。Taniguchi等人曾将其用于固定淀粉酶，蛋白酶等种类的酶。目前，国内利用Eudragit作为固定化酶载体的研究未见报道，国外近几年利用其固定化纤维素酶的报道也比较少。根 据纤维素酶水解反应的特点，选择 EudragitL- 100作为固定化酶的载体，采用物理吸附法固定化纤维素酶，研究固定化酶的溶解度性质及 稳定性、最适pH值、最适反应温度、表观 M氏常数、离

26、子强度对酶活力的影响等理化性质。固定化方法：将一定量的酶液加入到 5mLEudragitL-100溶液中，混合均匀，恒温放置一段时间后，边搅拌边滴加1mol / L乙酸，至（pH=4 . 0左右 树脂基本沉淀下来，溶液呈现一种不溶解状态，静置20min，离心（4000g X10min，取出上清液，沉淀用 0. 01mol / L , pH=4 . 0醋酸盐缓冲液冲洗，最后溶解在pH5. 8, 0. 1mol/L醋酸盐缓冲液中，定容至 8mL。由此得到的就是固定化酶溶液。实验结论：固定化酶的溶解度变换条件是：pH5 . 0时，呈可溶性；pH4. 0时，呈不可溶性。固定化酶的稳定性较好，重复利用4

27、次后，酶活力保留值在 65以上。比较了固定化酶和游离酶的最适反应条件和动力学常数的大小。以2%的滤纸为底物（15FPU / g底物，固定化酶水解反应的效果比游离酶好。5.2 利用高分子复合物固定化纤维素酶 高分子复合物具有一些特殊功能，如优良的质量传递性能，对水、电解质的灵敏介电特性 ，对氧和水的选择透过性以及对生物的相容性等特性，为生物酶的固定化技术提供了一种 新型载体。固定化方法：取2ml0.4molPMAA溶液，滴入2ml纤维素酶，搅拌1小时，再滴入0.4mol高聚 物，搅拌 2小时，过滤，抽干，得固定化酶。使用聚丙烯酰胺、聚乙烯胺、聚丙烯酰肼分别和聚甲基丙烯酸复合，这三种高分子复合物固

28、定纤维素酶，制得的三种固定化酶都能使酶获得较大的稳定性，使它们能在较广的pH范围内，较高的温度下发挥较大的作用，并能贮存，反复使用，这为今后固定化酶的工业化生产开辟了广阔的前景。5.3基于聚乙烯醇/ Fe2O3纳M颗粒的纤维素酶固定化聚乙烯醇（PVA是一种富含羟基的水溶性高分子化合物，能与含羟基物质产生物理交联作 用。经过反复冻溶后， PVA 与富含羟基的纤维素酶 （纤维素酶的中间部位含有相对密集的、 带有羟基的丝氨酸和苏氨酸以及多糖可形成柔性连接固定；同时，PVA丰富的羟基对纤维素酶也起着良好的稳定作用。纤维素酶的水解效率常与纤维素酶的吸附和解吸附有关，水 溶性载体固定化纤维素酶在催化时常大

29、量地被牢牢吸附在纤维素残基表面，影响了固定化 酶的效力和重复作用。Fe2O3纳M颗粒具有高表面能等特性，能较好地固定PVA和纤维素酶等高分子物质。同时，如果水溶性载体中含有Fe2O3,纳M颗粒将有可能使固定化酶具有超顺磁性，从而在磁场的作用下与纤维素残基分离。针对上述固体载体使酶效率低下、水 溶性载体又使纤维素酶与纤维素残基难以分离的难题，采用PVA / Fe2O3,磁性纳M颗粒作为固定纤维素酶的载体，通过反复冻融的方法，在形成复合载体的同时利用物理交联作用 将纤维素酶固定，并对固定化酶的特点和固定化效果及一些影响因素进行分析，以期提供 一种固定化纤维素酶的新方法。固定化方法：物理交联固定化纤

30、维素酶取一定量透析平衡的Fe2O3纳M颗粒，加入含质量分数0. 5%PVA的25mg/mL纤维素酶液中，于4 C下搅拌10h，再于-60 C快速冷冻，冰上解冻，反复冻融2次，加入NaC1（终浓度为0. 5mol / L沉降，用磁铁吸附分离后，用超纯水多次冲洗，冷冻干燥，于4C保存。若用于纤维素酶的检测，用 0. 05 mol/L pH=4. 5的柠檬酸钠缓冲液分散溶解。以聚乙烯醇 /Fe2O3磁性纳M颗粒为纤维素酶固定化载体，通过反复冻融的方法成功地实现了纤维素酶 固定化。采用透射电镜、红外光谱仪、振动样品磁强度计对固定化酶复合体进行了表征， 结果显示，固定化酶复合体为大小约1的微凝胶团，内含

31、10nm左右的Fe2O3纳M颗粒。研究影响固定化因素后发现，当pH为6,固定化时间为11h,纤维素酶/ PVA质量比为4, PVA/Fe质量比为50时，固定化纤维素酶效果最好。通过 该方法固定后酶活回收率达 42% ,酶水解效率显著提高,经过 5次反应后的固定化酶相对 酶活力保留50%以上。因此，基于聚乙烯醇/ Fe2O3。纳M颗粒的纤维素酶固定有利于酶 的循环使用并显著提高酶的使用效率,是一种有效固定化纤维素酶的新方法。5.4 壳聚糖固定化纤维素酶 随着固定化酶技术的发展,越来越多的研究者致力于对纤维素酶固定化的研究,但是应用 交联法固定化纤维素酶的报道很少。采用壳聚糖交联法固定化纤维素酶,研究戊二醛浓度 和给酶量对固定化酶活性的影响，以及固定化酶的最适温度、pH值、Km。结果表明，交联法得到的固定化纤维素酶与游离酶相比具有很多优点,对运用于工业生产具有重要意义固定化方法：称取一定量的 40目壳聚糖，加入一定浓度的戊二醛，室温下搅拌3h, 4C冰箱静置过夜,反复水冼并抽滤,然后往交联后壳聚糖中加入一定量的纤维素粗酶液,室温下 搅拌2 h,然后放置4C,冰箱过夜。次日，充分水洗并抽干即得固定化纤维素酶。利用固态发酵法从瑞氏木霉 QM941