RNA聚合酶II启动子shRNA表达载体构建的研究进展.

1、位嵋 n字杂志，2010,20(2:47-,48,50 2010CHINESE JOURNAL OF MICROCIRCULATION RNA聚合酶II启动子shRNA表达载体构建的研究进展 周天龙1王会敏2综述周青霞1审校 中周分类号R34文献标识码A 文章编号10051740(201002一 0047 一 03 置蚕虢瑟蔫主戮翳 1RNA聚合酶II启动子调控的RNAi中的效应分子及作 用机制 有两类RNA分子参与 RNAi:小干扰 RNAs(siRNAs和miRNAs。前者主要由 RNA聚合酶III启动子启动表达,而后者为聚合酶11启动子表达调控。 miRNA是一类长约22个碱基的非编码R

2、NAs,它们与信使RNA结合并调控其 翻译或将其降解口 。对模式生物 秀丽新小杆线虫、果蝇的研究结果显示，生物体内 天然存在miRNA基因，在细胞核内转录生成含有几百个或几千个核苷酸的原始 miRNA(Primary miRNA,pri-miRNA。由 RNAseE 家族的 Drosha切割生成 miRNA 前体(Precursor miRNAs,pre-miRNAs,pre-miRNAs 长 70nt,3 端有 2 个核苷酸的突 出。随后，其在Exportin5的协同作用下进入 细胞质，并被Dicer转变为成熟的 miRNA。接着,miRNA 与 RNAi 诱导沉默复合物(RNAi-l nd

3、uced Sile nci ng Comp lex, RISC中的Argonaule-2(其能选择性地组装那些5末端结 作者单位,咸宁学院附属第二医院检验科，邮政编码成宁437100;2广东省中医 院二沙岛分院检验科 本文 2010-01-20 收到.2010 0312 修回,2010-03 24 接受 2010年荒20卷第2舶构疏松的RNA链结合，一旦进行到这一步骤，RISC即会 发挥下调同源mRNAs表达的作用。当miRNA与mRNA完全同源时，其能降解 mRNA,而当其与mRNA不完全同 源时,其会在翻译水平下调基因的表达口 J。在人 类,迄今已经发现了大约470种miRNA,并且还在哺

4、乳动物中对其进 行了许多研究 5 6研究认为每种miRNAs能调控数百种信使RNA,但miRNA的靶基因仍没有 被鉴别出来7。 2miRNA与s诹NA的相似点及不同点 miRNA与RNAi经典途径中的siRNA存在一些相似 点及不同点阳.9.相似 点:(1siRNA和miRNA都由Dicer产生;(2两者都由22个核苷酸组成;(3两者都能与 一些核酸酶一起形成RISC。不同点:(1siRNA通常来源于动物RNAi中或是植物转 录后基因沉默中的长双链 RNA(Long Double-Stranded RNA,dsRNA,而miRNA则是 内源性的；(2siRNA被Dicer处理后形成3末端悬挂两

5、个核苷酸的双 链结构，而 miRNA在通常情况下是单链结构1们(3siRNA被组装为RISC后能降解靶mRNA, 而miRNA常常不降解 靶mRNA,而是在翻译水平下调相应基因的表达11 ” 3细4 胞内主要结构性的含22个核苷酸的RNA是miRNA,而siRNA通常在病毒感染或 dsRNA被人工引入细胞内及转 座子被激活后被诱导产生，因此siRNA主要在抑制转 座子的活动和病毒感染中发挥作用。 3RNA Pol 111启动子驱动的shRNA表达载体的缺点 经化学合成的siRNA被转染到细胞内，能发挥沉默基 因的作用，但因其量少，只 能在细胞内发挥短暂的效应，且由于其合成成本高，在一定程度上限

6、制了其应用。而 shRNA在结构上与内源性miRNA前体相似，其进入细胞后被Dicer处理为21个核 苷酸的siRNA或miRNA而发挥RN加效应。尽管shRNA载体作为一种工具已被 广泛用来分析基 因的功能，但现有的shRNA载体却存在一些缺陷。如每个shRNA 只能表达一个shRNA,所以,抑制多个基因就需要有多个启动子或载体，甚至在相同 载体转染时。多个shRNA也不能达到相似的共表达水平。另外，对引入的shRNA 的 综迹 周天龙.王会敏 检测需共表达一个由RNA Pol II启动子驱动的报告基因，这种情况下，标记基因 的表达并不总是与shRNA的表达相一致。还有,调控RNA Pol

7、III启动子的表达比 调控RNA Pol II启动予的表达更为困难。而含 RNA Pol II启动子的RNAi表达载体 能够克服RNA Pol III启动子的缺陷1。“ 4含RNA Pol II启动子的shRNA表达载 体的构建及应用4.1利用miRNA前体的干袢环结构作为合成 miRNA的骨架 4.1.1用rnir-30前体作为骨架：Ze ng等1钉第一次证实真正 的人类miRNA- mir-30能从不相关的含71个核苷酸的“-30前体而非成熟mir-30的mRNA转录本 上被识别并被切割下来。他们将编码整个71个核苷酸mir-30前体的eDNA序列 在CMV-IE(Cytomegalovi

8、rus Immediate Early启动子的控 制下克隆入细菌载体内 (pCMV-mir-30,然后转染人类293T细胞。收集总 RNA进行Northern blotting以分 析mir-30的存在。转染了 pCMV-mir-30的miRNA产物长22个核苷酸，与报道过 的mir.-30有相同的5末端，并且表达mir-30的miR NA能特异地抑制含互补靶位 点的mRNA的表达。 Lo等” 3 siRNA序列代替miR 30干袢环结构的主干 部分设计合成了能在 RNA Pol II启动子控制下表达的miRNA,用此miRNA能够有效地抑制人类免疫缺 陷病毒一 1 (HIV-1的复制，抑制效

9、率直接与其表达水平相关。他们还 发现载体的拷 贝数与启动子的长度均能影响siRNA抑制HIV-1复制的能力。而且 他们联合应用 RNA Pol II和RNA Pol III启动子分别表达两种不同的siRNAs，结果显示其增强 了 抑制HIV-I复制的效能而且没有影响到细胞的活力。Zhou等” 3巨细胞病毒 (CMV启动子检测了一系列 模拟人类miRNA mir-30结构的发夹结构的变异体，结 果发现采用真正人类miv30结构的发夹在沉默基因方面最有 效。另外，他们又将最 有效的发夹置于另一个人类 RNA Pol II启动子一 UbC的下游，然后将这个重组体与 广泛使用的RNA Pol III启

10、动子驱动的发夹重组体进行比较 结果，RNA Pol II启动子 与RNA Pol III启动子相比，前者能驱动shRNA的合成并能高效介导基因沉默。 4.1.2用mir-155前体作为骨架:Chung等17在非编码RNA BIC的基础上发展 了一种新的RNA Pol II表达载体,命名为SIBR载体。BIC含有miR-155miRNA前 体,他们发 现小鼠BIC基因第三个外显子的小区域的表达能在哺乳动 物细胞产生 miR-155。SIBR载体采用了改良过的 miR-155前体主干及袢环结构，像RNA Pol III 驱动产生的短发夹RNA载体一样,SIBR载体能有效地降低靶mRNA和蛋白表达水

11、 平。此外,SIBR载体能在-个转录本上同时表达两 个不同的miRNAs,并且这两个 miRNAs均能有效的抑制两 种不同的靶mRNA。另外，至少8个串联的miRNA拷贝 能在一个多顺反子的转录本上表达，从而增加对靶RNA的抑制效率。 4.2直接将shRNA置于RNA Pol II启动子的下游 Ling等18将针对Survivin设计的shRNA插入到pEG蕾膏n亨赫 2010年第20卷薏2期FPcI载体（含RNA Pol II启动子GFP cDNA的3末端的 下游，然后用构建好的载体转染 HeLa细胞结果发现RNA Pol II启动子转录出的与 GFP以融合形式结合的shRNA抑制了荧光素酶

12、的活性及Survivin的表达，这表明 shRNA袢环结构外多余的RNA序列（GFP并没有影响shRNA的功能。该作者第 一次证实shRNA能在其非翻译区以融合表达的形式发挥作用。 Lakka等1叼等针对uPAR序列合成了 21个碱基对+5个碱基的袢环+BamH I 位点的核苷酸，在6x SSC缓冲液内退火后连接到pcDNA3载体（含 CMV启动子的 BarnH I位点,相似地，金属白酶一 9（MMP-9序列的22个碱基+5个碱 基的袢环 +EcoR I位点的核苷酸被连接到上述载体的 EcoR l位点,最终构建了同时表达uPAR 和MMP 9siRNA的双 基因表达载体，这个重组体同时抑制了两

13、个基因的表达，且 在体内外实验中抑制了血管样结构的形成，最终显著抑制了 神经胶质瘤细胞的侵袭 及肿瘤的生长。. 5展望 近年来,RNAi技术取得了迅猛发展，已被广泛用于探 索基因功能和多种疾病及 恶性肿瘤的基因治疗。但是有很 多因素会影响RNAi的效率,如在抗病毒治疗时， 些RNA病毒和DNA病毒会产生突变从而逃避 RNAi;某些靶mR NA的结构也会 影响沉默效率；由于哺乳动物体内缺乏内源 性RNA扩增机制,外源性RNAi作用会 随着时间而逐渐减 弱等等。所以，用同时沉默两个或两个以上基因的 RNAi技术能 极大地提高RNAi的效率，从而为疾病的治疗提供更为 有利的工具。但是传统的采 用RA

14、N Pol Ill启动子方式存 在着许多缺点，且同时沉默多个基因有一定困难，采用 RAN Pol II启动子能弥补其缺陷,并能同时转录出多个shRNAs,从而为多基因沉默 开辟了道路。 Lo等15联合应用RAN Pol II和RAN Pol III启动子达 到了沉默两个HIV-1片 段进而增强了抑制病毒复制能力的 目的;Chung等173等利用SIBR载体在一个转 录本上同时表达两个不同的 miRNAs。且这两个miRNAs均能有效抑制两种不同 的靶MRNA;Silva等203用日益增长的RNAi生物化学理论构建了第二代shRNA 表达库，这些构建体模拟了天然 的miRNA前体，因内源性的mi

15、RNA允许在组织特异 的且可被诱导的启动子的控制下构建重组体，故大规模第二代短发夹载体库得以构 建,而且在RNA Pol II启动子控制下构建的 表达载体能有效抑制培养细胞和动物体 内基因的表达。 综上所述，用RAN Pol II启动子代替RAN Pol III启动子进行RNAi,不仅能达到 与RAN Pol III启动子相同的，而目且并且还能克服其缺点，同时沉默多个基因，从而 为疾病治疗提供了更为有效的方法。 本文第一作者简介： 周天尼（1967.男.汉族.本科.主管技师 （下转第50页综迹 50吴国荣,陈国千，王春新.等参考文献 1Le Brie on T,Thervet E,Froiss

16、art M,et a1. PI asma cystatin C is sup erior to 24h creati nine cleara nee and p lasma creati nine for esti-mati on of glomerular filtration rate 3mon ths after kid ney trans plan tatio n.Clin Chem,2000,46(8:12061207. 2邱春光，卢长青.糖尿病微血管病变发生机制研究现状.心血管病学进 展,2007,28(1z 13-14. 3吴国荣，杨小娟，赵琪.等.微量蛋白在诊断原发性高血压病息

17、 者早期肾损伤中的I临床意义.微循环学杂志，2007,17(2:33- 34. 4王文武，涂茹，丛蓉.半胱氨酸蛋白酶抑制剂C在肾脏功能早 期损伤评估中的应 用.微循环学杂志,2006,16(2:40. 5陈军政.2型糖尿病肾病患者血清胱抑紊C的检测及意义.微循环学杂 志,2007,17(3:58-59. (上接第48页参考文献 1Fire A,Xu S。 Montgomery MK。 et a1.Potent and specific genetic interferenee by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 19

18、98。391(6669:806-811. 2Searia V,Harihara n M,P illai B,et a1.Host virus genome in ter acti on s:macro roles for microRNAs.Cell Microbiol,2007,9 (12:2784-2794. 3Lee RC。Ambros V.An extensive class of small RNAs in Cae-norhabditis elega ns.Seie nce,2001.294(5543:862964. 4Mourelatos Z,Dostie J,P aushkin

19、S,et a1.miR NP s;a no vel class of ribonu cle op rote ins containing nu merous microRNAs. Genes Dev,2002,16(6:720728. 5P ogrib ny IP,Tryn dyak VP ,Boyko A,et a1.I nduction of mi croRNAome deregulati on in rat liver by Ion g-term tamoxife n ex p osure.Mutat Res,2007,619(1- 2:30-37. 6Looije nga LH.Gil

20、lia AJ,Sto op H t et a1.Releva nee of microR NAs in no rmal and malig nant devel opmen t,i nclud ing huma n te ticular germ cell tumours .Int J Androl,2007,30(4:304314. 7Fukushima T。Hamada Y,Yamada H,et al.Changes of micro-rna exp ressi on in rat liver treated by acetam inophen or carb on tet rachlo

21、ride- regulati ng role of micro-RNA for RNA exp ressio n.J ToxicoI SCi,2007,32(4:401409. 8郑玉妹，赵朴，赵宏坤.mieroRNA及其应用前景、生物技术通 讯,2007,18(1:119-121. 9Neils on JR,Zhe ng GX,Burge CB,et a1.D yn amic regulati on of miRNA exp ressi on in ordered stages of cellular devel opment. Genes Dev,2007,21(5:578589. 10N

22、yka nen A,Haley B,Zamore P D.AT P requireme nts and small in terferi ng RNA structure in the RNA in terfere nee pathway. Cell,2001,107(3:309- 321. 1l Ham mond SM,Bernstein E,Beach D,et a1.A n RNA directed nuclease mediates pos 卜 transcriptional gene silencing in Drosoph 膏矗n字杂志 2010年弟20卷第2期 ila cells

23、.Nature,2000.404(6775:293- 296. 12Hamilt on AJ.Baulcombe Dc.A sp ecies of small an tise nse RNA in postman scri ptio nal ge ne sile ncing in pla nts.Scie nce,1999, 286(5441:950-952. 13Ze ng Y,Culle n BR.Seque nee requireme nts for micro RNA pr eess ing and fun ctio n in human cells.RNA,2003,9(1:112-

24、 123. 14Ze ng Y。Wag ner EJ.Cullen BR.Both n atural a nd desig ned m cro RNAs can in hibit the exp ressi on of cog nate mRNAs whe n exp ressed in huma n cells.Mol Cell,2002,9(6:13271333. 15Lo HL.Chang T。Yam P,et a1.Inhibition of HIV- Ire plicati on with desig ned miRNAs exp ressed from RNA poly merase II pro moters.Ge ne Ther,2007 14(21:1 503-1512. 16Zhou H.Xia XG,Xu 乙et a1.A n RNA polymerase II co nstruct syn thesizes shor hair pin RNA with a qua ntitative in dicator and mediates highly efficie n