基因建造工程的基本操作程序

1、基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 善假于物也善假于物也 基因建造工程的基本操作程序 提提 盒盒 刀刀 剪剪 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 基因建造工程的基本操作程序 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的 设计，通过体外设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，重组和转基因等技术， 赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人 们需要的新的生物类型和生物产品。们需要的新的生物类型和生物产品。 基因建造工程的基本操作程序 目的基因主要是指目的基因主要是指_编码蛋白质的基因编码蛋白质的基

2、因 供体生物细胞供体生物细胞 取出取出DNADNA 用限制酶剪用限制酶剪 去多余部分去多余部分 目的基因目的基因 从自然界中已有的物种中分离出来从自然界中已有的物种中分离出来 ,也可以人工合成也可以人工合成 基因建造工程的基本操作程序 A AC CU UG GG GA AU UC C U U mRNAmRNA tRNAtRNAU UG GA CA CC CU AU AG GA A 苏氨酸苏氨酸甘氨酸甘氨酸丝氨酸丝氨酸 转录转录翻译翻译 蛋白质蛋白质 密码子密码子ACU GGA UCUACU GGA UCU DNADNA A AC CT TG GG GA AT TC C T T T TG GA

3、AC CC CT TA AG GA A 肽键肽键 肽键肽键 基因建造工程的基本操作程序 补：原核细胞的基因结构补：原核细胞的基因结构 非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区 编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点 启动子启动子终止子终止子 RNA RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，聚合酶能够识别调控序列中的结合位点， 并与其结合。并与其结合。 转录开始后，转录开始后，RNARNA聚合酶沿聚合酶沿DNADNA分子移动，并分子移动，并 以以DNADNA分子的一条链为模板合成分子的一条链为模板合成RNARNA。 转录完毕后，转录完毕后，

4、RNARNA链释放出来，紧接着链释放出来，紧接着RNARNA聚聚 合酶也从合酶也从DNADNA模板链上脱落下来。模板链上脱落下来。基因建造工程的基本操作程序 不能转录为信使不能转录为信使RNARNA，不能，不能 编码蛋白质。编码蛋白质。 ：能转录相应的信使：能转录相应的信使RNARNA，能，能 编码蛋白质编码蛋白质 编码区编码区 非编码区非编码区 原核原核 细胞细胞 的的 基因基因 结构结构 有调控遗传信息表达的核有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中，苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上最重要的是位于编码区上 游的游的RNARNA聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。 启动子启动子

5、 基因建造工程的基本操作程序 补：真核细胞的基因结构补：真核细胞的基因结构 编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区 与与RNARNA聚合酶聚合酶 结合位点结合位点 内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内不能够编码蛋白质的序列叫做内 含子含子 启动子启动子 终止子终止子 编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子： 外显子：外显子： 基因建造工程的基本操作程序 真核真核 细胞细胞 的的 基因基因 结构结构 编码区编码区 非编码区非编码区 外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列 内含

6、子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列 ：有调控作用的核苷酸序列，：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的包括位于编码区上游的RNARNA 聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。 非编码序列：非编码序列： 包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子 基因建造工程的基本操作程序 基因的种类: （1）编码蛋白质的基因）编码蛋白质的基因 （2）没有转译产物的基因：如）没有转译产物的基因：如rRNA基因基因 和和tRNA基因。基因。 目的基因主要是指目的基因主要是指_编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因 补：原核细胞的基因结构补：原核细胞的基因结构 非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码

7、区 编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点 启动子启动子终止子终止子 基因建造工程的基本操作程序 1.什么是基因文库？（什么是基因文库？（p9） 2.怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？ 种类：种类： 基因组文库：基因组文库： 部分基因文库部分基因文库(cDNAcDNA文库文库) )： 2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 3 3）人工合成）人工合成 含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因 含有一种生物的含有一种生物的部分部分基因基因 基因建造工程的基本操作程序 ( (

8、一一) )从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多 DNA片断，导入到受体菌的群体中，各片断，导入到受体菌的群体中，各 个受体菌分别含有这种生物的不同基因，个受体菌分别含有这种生物的不同基因， 称为基因文库。称为基因文库。 基因文库基因文库 基因组文库基因组文库 部分基因文库部分基因文库 （如（如:cDNA文库）文库） 1.1.基因文库基因文库 基因建造工程的基本操作程序 供体细胞中的供体细胞中的DNADNA 许多许多DNADNA片段片段 载体载体 限制酶限制酶 分别与载体连分别与载体连 接，载入接，载入 受体菌受体菌 导入导入

9、 鸟枪法（散弹射击法）鸟枪法（散弹射击法） 基因组文库的构建方法基因组文库的构建方法 将某种生物体内的将某种生物体内的DNADNA 全部提取出来，选用全部提取出来，选用 适当的限制酶，将适当的限制酶，将DNADNA 切成一定范围大小的切成一定范围大小的 DNADNA片段，然后将这些片段，然后将这些 片段分别与载体连接片段分别与载体连接 起来，导入受体菌的起来，导入受体菌的 群体中储存，每个受群体中储存，每个受 体菌都含有了一段不体菌都含有了一段不 同的同的DNADNA片段。这个群片段。这个群 体包含了这种生物的体包含了这种生物的 所有基因。所有基因。 基因文库的构建基因文库的构建 基因建造工程

10、的基本操作程序 通过对受体菌的培养而储存基因通过对受体菌的培养而储存基因 鸟枪法（散弹射击法）鸟枪法（散弹射击法） 将某种生物体内的将某种生物体内的DNADNA 全部提取出来，选用全部提取出来，选用 适当的限制酶，将适当的限制酶，将DNADNA 切成一定范围大小的切成一定范围大小的 DNADNA片段，然后将这些片段，然后将这些 片段分别与载体连接片段分别与载体连接 起来，导入受体菌的起来，导入受体菌的 群体中储存，每个受群体中储存，每个受 体菌都含有了一段不体菌都含有了一段不 同的同的DNADNA片段。这个群片段。这个群 体包含了这种生物的体包含了这种生物的 所有基因。所有基因。 基因建造工程

11、的基本操作程序 mRNAmRNA 单链单链DNADNA 反转录酶反转录酶 DNADNA聚合酶聚合酶 双链双链DNA DNA （cDNA） 与载体连接与载体连接 导入受体菌群导入受体菌群 该生物该生物 cDNA文库文库 用某种生物发育的某个时用某种生物发育的某个时 期的期的mRNAmRNA反转录产生的多反转录产生的多 种互补种互补DNADNA（也叫（也叫cDNAcDNA） 片段，与载体连接后储存片段，与载体连接后储存 在一个受体菌群中，这个在一个受体菌群中，这个 受体菌群体叫做这种生物受体菌群体叫做这种生物 cDNAcDNA文库。文库。 （2 2）构建）构建部分基因文库部分基因文库 -cDNAc

12、DNA文库文库 基因建造工程的基本操作程序 提取某生物提取某生物 全部全部DNA 用适当用适当 限制酶切割限制酶切割 许许 多多 DNA片段片段 与载体连接与载体连接 导入受体菌群导入受体菌群 该生物基该生物基 因组文库因组文库 （每个受体菌含有一段不同的（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）片段） mRNA 逆转录酶逆转录酶 杂交双链杂交双链 核酸酶核酸酶H 单链单链DNA DNA聚合酶聚合酶 双链双链DNA 与载体连接与载体连接 导入受体菌群导入受体菌群 该生物该生物 cDNA文库文库 基因建造工程的基本操作程序 基因组基因组 文库与文库与 部分基部分基 因文库因文库 的关系的关系 基因建

13、造工程的基本操作程序 基因组文库和部分基因文库 基因建造工程的基本操作程序 1.什么是基因文库？（什么是基因文库？（p9） 2.怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？ 种类：种类： 基因组文库：基因组文库： 部分基因文库部分基因文库(cDNAcDNA文库文库) )： 2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 3 3）人工合成）人工合成 含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因 含有一种生物的含有一种生物的部分部分基因基因 根据基因的有关信息：如基因表达的产物等。（根据基因的有关信息：如基因表达的产物等。（p9） 基因建造工程的

14、基本操作程序 （3）如何从基因文库中得到所需要的基因？如何从基因文库中得到所需要的基因？ 依据：目的基因的有关信息。依据：目的基因的有关信息。 如：根据基因的核苷酸序列如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因基因在染色体上的位置在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNA 基因表达产物蛋白质基因表达产物蛋白质 等特性。等特性。 基因建造工程的基本操作程序 P9P9寻根问底寻根问底 （1 1）为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内）为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内 提取不行吗？提取不行吗？ 构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟构建基因

15、文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟 一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以 通过通过PCR方式从含有该基因的生物的方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获中，直接获 得，也可以通过反转录，用得，也可以通过反转录，用PCR方式从方式从mRNA中获得，中获得， 不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的 序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想 从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物 与

16、另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种 生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同， 或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构 建基因文库。建基因文库。 基因建造工程的基本操作程序 PCR是聚合酶链式反应是聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction）,它它 是利用是利用DNA 双链复制的原理，将双链复制的原理，将 基因的核苷酸序列不断的加以复基因的核苷酸序列不断的加以复 制，使其数量呈指数方式增加。制，使其数量呈指数方

17、式增加。 因为整个过程是在体外进行，所因为整个过程是在体外进行，所 以又叫做体外以又叫做体外DNA扩增技术。扩增技术。 基因建造工程的基本操作程序 DNA复制条件复制条件 模板模板DNA 酶酶解旋酶和解旋酶和 DNA聚合酶等聚合酶等 能量能量ATP 原料原料4种游离的种游离的 脱氧核苷酸脱氧核苷酸 基因建造工程的基本操作程序 解链方向解链方向 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 引物：一小段单链引物：一小段单链DNADNA或或RNARNA，一般，一般20203030 个碱基，能与个碱基，能与DNADNA母链的一段碱基序列互母链的一段碱基序列互 补配对。补配对。 基因建造工程的基本操作程序

18、PCR扩增仪扩增仪 DNA双链复制的基本原理双链复制的基本原理 一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列(引物引物) 原料原料四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸 引物：一小段单链引物：一小段单链DNA或或RNA,一对一对 酶酶-热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶） 模板模板-DNA-DNA的两条链的两条链 温度控制和缓冲液温度控制和缓冲液 能量能量ATP 基因建造工程的基本操作程序 p 双链双链DNADNA是在高温条件下是在高温条件下 解链为单链解链为单链DNADNA的，因此整的，因此整 个过程不需要解旋酶。个过程不需要解旋酶。 a a、DNADNA受热变性（

19、受热变性（90-9690-96）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_ b b、冷却（、冷却（复性复性55-6555-65）：系统温度降低，引物与）：系统温度降低，引物与DNADNA模板结模板结 合，形成局部合，形成局部_。 c c、加热（、加热（70-7570-75）：在热稳定）：在热稳定DNADNA聚合酶聚合酶（TaqTaq酶）的作用酶）的作用 下，从引物的下，从引物的55端端33端延伸，合成与模板互补的端延伸，合成与模板互补的_。 氢键氢键单链单链DNADNA 双链双链 DNADNA链链 Taq聚合酶是一种耐热的聚合酶是一种耐热的DNA聚合聚

20、合 酶酶,由于发现于水生栖热菌由于发现于水生栖热菌 (Thermus aquaticus)内内,故命名为故命名为 Taq聚合酶聚合酶(Taq polymerase),也也 称为称为TaqDNA聚合酶聚合酶,简称简称Taq酶酶 结果：结果：使目的基因的片段在短时间使目的基因的片段在短时间 内成百万倍地扩增内成百万倍地扩增基因建造工程的基本操作程序 高温变性高温变性 （9095） 低温低温冷却冷却 （5560） 中温延伸中温延伸 （7075） 多次多次 重复重复 基因建造工程的基本操作程序 1.什么是基因文库？（什么是基因文库？（p9） 2.怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？怎样从基因文库中

21、得到我们所需的目的基因？ 种类：种类： 基因组文库：基因组文库： 部分基因文库部分基因文库(cDNAcDNA文库文库) )： 2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 3 3）人工合成）人工合成 含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因 含有一种生物的含有一种生物的部分部分基因基因 根据基因的有关信息：如基因表达的产物等。（根据基因的有关信息：如基因表达的产物等。（p9） 基因建造工程的基本操作程序 DNA合成仪合成仪 推推 测测 推推 测测 合合 成成 基因建造工程的基本操作程序 基因工程的 基本操作流程 基因建造工程的基本操作程序 基因建造工程的基本操作程序 基因

22、建造工程的基本操作程序 分析 推测 推测 基因建造工程的基本操作程序 1.1.用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。 2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。 3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒） 限制酶限制酶 黏性末端黏性末端 同一种限制酶同一种限制酶 的黏性末端的黏性末端 切口切口 DNADNA连接酶连接酶 相同相同 核心核心 基因建造工程的基本操作程序 质粒质粒D

23、NADNA分子分子 一个切口一个切口 两个黏性末端两个黏性末端 两个切口两个切口 获得目的基因获得目的基因 DNA DNA 连接酶连接酶 重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒） 同一种同一种 限制酶限制酶 基因建造工程的基本操作程序 质粒质粒 目的基因目的基因 限制酶限制酶 DNA连接酶连接酶 重组重组DNA 基因建造工程的基本操作程序 为什么要为什么要基因构建基因构建 表达载体？表达载体？目的目的 1 1 为了使目的基为了使目的基 因在受体细胞中因在受体细胞中 稳定存在，并且稳定存在，并且 可以遗传给下一可以遗传给下一 代，代， 2 2 使目的基因能使目的基因能 表达和发挥作用

24、。表达和发挥作用。 基因建造工程的基本操作程序 1、基因表达载体的组成、基因表达载体的组成 目的基因目的基因 启动子启动子 终止子终止子 标记基因等标记基因等 核心核心 启动子启动子 RNARNA聚合酶识别和结合聚合酶识别和结合 的一段特殊结构的的一段特殊结构的DNADNA片段，位片段，位 于基因的首端，于基因的首端，RNARNA聚合酶与之聚合酶与之 识别和结合才能驱动基因转录识别和结合才能驱动基因转录 出出mRNAmRNA，进而获得需要的蛋白，进而获得需要的蛋白 质。质。 基因建造工程的基本操作程序 1、基因表达载体的组成、基因表达载体的组成 目的基因目的基因 启动子启动子 终止子终止子 标

25、记基因等标记基因等 核心核心 终止子终止子 一段特殊结构的一段特殊结构的 DNADNA片段，位于基因的尾端，片段，位于基因的尾端， 作用是使转录在所需要的地作用是使转录在所需要的地 方停止。方停止。 基因建造工程的基本操作程序 1、基因表达载体的组成、基因表达载体的组成 目的基因目的基因 启动子启动子 终止子终止子 标记基因等标记基因等 核心核心 标记基因标记基因鉴别和筛选鉴别和筛选 含目的基因的受体细胞含目的基因的受体细胞。 基因建造工程的基本操作程序 1、基因表达载体的组成、基因表达载体的组成 目的基因目的基因 启动子启动子 终止子终止子 标记基因等标记基因等 思考：思考：作为基因工程表达

26、载体，只需含有作为基因工程表达载体，只需含有 目的基因就可以完成任务吗？为什么？目的基因就可以完成任务吗？为什么？ 核心核心 基因建造工程的基本操作程序 不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用， 还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。 必须构建上述元件的主要理由是：必须构建上述元件的主要理由是： （1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因 的启动子才能比较有利于基因的表达；的启动子才能比较有利于基因的表达；

27、（2） 通过通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码文库获得的目的基因没有启动子，只将编码 序列导入受体生物中无法转录；序列导入受体生物中无法转录； （3）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部 位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因 与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。 （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其 他调控元件，如增强子等；他调控元

28、件，如增强子等； 目的基因主要是指目的基因主要是指_编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因 基因建造工程的基本操作程序 P11P11寻根问底：将目的基寻根问底：将目的基 因直接导入受体细胞不因直接导入受体细胞不 是更简便吗？如果这么是更简便吗？如果这么 做，结果会怎样？做，结果会怎样？ 有人采用总有人采用总DNA注射法注射法 进行遗传转化，即将一进行遗传转化，即将一 个生物中的总个生物中的总DNA提取提取 出来，通过注射或花粉出来，通过注射或花粉 管通道法导入受体植物，管通道法导入受体植物， 没有进行表达载体的构没有进行表达载体的构 建，这种方法针对性差，建，这种方法针对性差， 完全靠运气，也无法确

29、完全靠运气，也无法确 定什么基因导入了受体定什么基因导入了受体 植物。此法目前争议颇植物。此法目前争议颇 多，严格来讲不算基因多，严格来讲不算基因 工程。工程。 基因建造工程的基本操作程序 目的：目的： 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代. 同时使目的基因能够表达和发挥作用。同时使目的基因能够表达和发挥作用。 a、目的基因、目的基因 b、启动子、启动子 c、终止子、终止子 d、标记基因、标记基因 核心核心 基因建造工程的基本操作程序 构建表达载体的目的构建表达载体的目的 为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，为了使目的基因在受

30、体细胞中稳定存在， 并且可以遗传给下一代，并且可以遗传给下一代， 同时使目的基因能表达和发挥作用。同时使目的基因能表达和发挥作用。 基因建造工程的基本操作程序 “目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细胞” 含有目的基因的表达载体只有进入受体细含有目的基因的表达载体只有进入受体细 胞，并且维持稳定和表达，才能实现一种胞，并且维持稳定和表达，才能实现一种 生物的基因在另一种生物中的转化。生物的基因在另一种生物中的转化。 基因建造工程的基本操作程序 ( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 转化转化 : : 方法方法 将目的基因导入将目的基因导入 植物细胞植物细胞 将目的基因导入

31、将目的基因导入 动物细胞动物细胞 将目的基因导入将目的基因导入 微生物细胞微生物细胞 农杆菌转化法农杆菌转化法 基因枪法基因枪法 花粉管通道法花粉管通道法 显微注射法显微注射法 感受态细胞感受态细胞 目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程 受体细胞受体细胞 稳定稳定表达表达 基因建造工程的基本操作程序 农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植 物，当植物受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大物，当植物受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大 量的酚类化合物，吸引农杆菌移向细胞。这时农量的酚类化合物，吸引农杆

32、菌移向细胞。这时农 杆菌中的杆菌中的Ti质粒上的质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，可转移至受体细胞， 并整合到受体细胞的染色体的并整合到受体细胞的染色体的DNA上。上。 基因建造工程的基本操作程序 农杆菌转化法农杆菌转化法 基因建造工程的基本操作程序 P15 2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目 的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦， 从理论上说，你应该如何做？从理论上说，你应该如何做

33、？ 农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。农杆菌具有趋化性，农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。农杆菌具有趋化性， 即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引农杆菌向受即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引农杆菌向受 伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基 乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常 不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌 侵染的原因。酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农

34、杆菌的趋侵染的原因。酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋 化物，又可以作为农杆菌中化物，又可以作为农杆菌中TiTi质粒上质粒上VirVir区（毒性区）基因的诱区（毒性区）基因的诱 导物，使导物，使VirVir区基因活化，导致区基因活化，导致T-DNAT-DNA的加工和转移，从而侵染的加工和转移，从而侵染 植物细胞。植物细胞。 如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注 意两点：要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌意两点：要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌 菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一

35、般菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般 为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢 （趋化性）和激活农杆菌的（趋化性）和激活农杆菌的VirVir区（诱导）的基因，使区（诱导）的基因，使T-DNAT-DNA转转 移并插入到染色体移并插入到染色体DNADNA上。上。 基因建造工程的基本操作程序 3 基因建造工程的基本操作程序 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力， 将包裹在金属颗粒表面的表达载体将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目打入受

36、体细胞中，使目 的基因与其整合并表达的方法。单子叶，成本高。的基因与其整合并表达的方法。单子叶，成本高。 基因建造工程的基本操作程序 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。 花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合 前，剪去柱头，然后，滴加前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基（含目的基因），使目的基 因借助花粉管通道进入受体细胞。因借助花粉管通道进入受体细胞。 花粉管通道法花粉管通道法 基因建造工程的基本操作程序 ( (三三) )将目的基因导入受体

37、细胞将目的基因导入受体细胞 转化转化 : : 方法方法 将目的基因导入将目的基因导入 植物细胞植物细胞 将目的基因导入将目的基因导入 动物细胞动物细胞 将目的基因导入将目的基因导入 微生物细胞微生物细胞 农杆菌转化法农杆菌转化法 基因枪法基因枪法 花粉管通道法花粉管通道法 显微注射法显微注射法 感受态细胞感受态细胞 目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程 受体细胞受体细胞 稳定稳定表达表达 基因建造工程的基本操作程序 显微注射技术显微注射技术 显微注射技术是转基因动物中最多采用的方法，也是最显微注射技术是转基因动物中最多采用的方法，也是

38、最 为有效的一种方法。为有效的一种方法。 提纯含目的基因的表达载体提纯含目的基因的表达载体从动物提内取出卵从动物提内取出卵 采用显微注射仪进行显微注射采用显微注射仪进行显微注射再将注射了目的基因再将注射了目的基因 的受精卵移植到动物子宫内。的受精卵移植到动物子宫内。 基因建造工程的基本操作程序 基因建造工程的基本操作程序 显微注射技术显微注射技术 含目的基因含目的基因 的表达载体的表达载体 动动 物物 的的 受受 精精 卵卵 含目的基因含目的基因 的受精卵的受精卵 早早 期期 胚胚 胎胎 雌性动物输雌性动物输 卵管或子宫卵管或子宫 转基因转基因 动动 物物 显微显微 注射注射 分裂分裂 分化分

39、化 移移 植植 发发 育育 基因建造工程的基本操作程序 为什么将目的基因导入动物细胞常用的受体为什么将目的基因导入动物细胞常用的受体 细胞是受精卵？细胞是受精卵？ 1 1越早分化的细胞具有的全能性越强，受精越早分化的细胞具有的全能性越强，受精 卵相对于早期胚胎细胞更具有分化为完整卵相对于早期胚胎细胞更具有分化为完整 个体的潜力。个体的潜力。 2.2.受精卵体积大，操作起来比较容易。受精卵体积大，操作起来比较容易。 3.3.受精卵所含的营养物质多，有利于胚胎受精卵所含的营养物质多，有利于胚胎 的发育。的发育。 基因建造工程的基本操作程序 ( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细

40、胞 转化转化 : : 方法方法 将目的基因导入将目的基因导入 植物细胞植物细胞 将目的基因导入将目的基因导入 动物细胞动物细胞 将目的基因导入将目的基因导入 微生物细胞微生物细胞 农杆菌转化法农杆菌转化法 基因枪法基因枪法 花粉管通道法花粉管通道法 显微注射法显微注射法 感受态细胞感受态细胞 目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程 受体细胞受体细胞 稳定稳定表达表达 基因建造工程的基本操作程序 2. 2. 优点优点 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少。繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少。 个体微小，代谢旺盛，繁殖速度快，获得目的个体

41、微小，代谢旺盛，繁殖速度快，获得目的 基因产物多。基因产物多。 3. 3. 常用受体细胞：常用受体细胞：大肠杆菌（大肠杆菌（E.coliE.coli） 1. 1. 过程过程 CaCa2+ 2+ 处理法 处理法 感受态细胞：用感受态细胞：用Ca2+处理细胞后，细胞处于一种能吸收周围环处理细胞后，细胞处于一种能吸收周围环 境中境中DNA分子的生理状态。分子的生理状态。 将感受态细胞与溶有基因表达的载体的缓冲液混合，并提供适将感受态细胞与溶有基因表达的载体的缓冲液混合，并提供适 宜的温度就能使目的基因进入细胞了。宜的温度就能使目的基因进入细胞了。 过程：用过程：用Ca2+处理细胞处理细胞成为感受态细

42、胞成为感受态细胞表达载体与感表达载体与感 受态细胞混合受态细胞混合 一定温度条件感受态细胞吸收一定温度条件感受态细胞吸收DNA分子，这分子，这 样目的基因进入细胞了。样目的基因进入细胞了。 基因建造工程的基本操作程序 细胞细胞 类型类型 常用常用 方法方法 受体受体 细胞细胞 转化过程转化过程 植物细植物细 胞胞 农杆菌转化农杆菌转化 法法 体细胞体细胞 将目的基因插入将目的基因插入Ti质粒的质粒的 TDNA上上转入农杆菌转入农杆菌导入导入 植物细胞植物细胞整合到受体细胞的整合到受体细胞的 DNA上上 动物细动物细 胞胞 显微注射技显微注射技 术术 受精卵受精卵 将含有目的基因的表达载体提将含

43、有目的基因的表达载体提 纯纯取卵取卵获得受精卵获得受精卵显微显微 注射注射早期胚胎培养早期胚胎培养胚胎移胚胎移 植植发育成为具有新性状的动发育成为具有新性状的动 物物 微生物微生物 细胞细胞 Ca2+ 处理处理 增大细胞壁增大细胞壁 通透性通透性 原核细原核细 胞或酵胞或酵 母菌母菌 用用Ca 处理细胞处理细胞感受态细胞感受态细胞 重组表达载体重组表达载体DNA分子与感受分子与感受 态细胞混合态细胞混合感受态细胞吸收感受态细胞吸收 基因建造工程的基本操作程序 基因建造工程的基本操作程序 ( (四四) )目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定 目的基因是否真正插入受体细胞的目的基因是否真正插入

44、受体细胞的DNA中，中， 是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表 达，只有通过检测、鉴定才能得知。达，只有通过检测、鉴定才能得知。 基因建造工程的基本操作程序 检测检测 方法方法: :DNADNA分子杂交分子杂交 四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功 检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入了目上是否插入了目 的基因。的基因。 这是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关这是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关 键键 基因建造工程的基本操作程序 1 1将转基因生物的基因组将转基因生物的基因组DNADNA

45、提取出来，提取出来， 2 2将含有目的基因的将含有目的基因的DNADNA片段上用放射性同位素做上标记制作探针，片段上用放射性同位素做上标记制作探针， （为了保证目的基因通过碱基互补配对来检测，探针必须是单链）（为了保证目的基因通过碱基互补配对来检测，探针必须是单链） 3 3再将探针与基因组再将探针与基因组DNADNA杂交，若结果显示出杂交，若结果显示出DNADNA杂交带，就表明目杂交带，就表明目 的基因已经插入染色体的基因已经插入染色体DNADNA。 基因建造工程的基本操作程序 检测检测 检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因能否检测目的基因能否 发挥功能

46、作用的第一步发挥功能作用的第一步 方法方法: :分分 子子 杂杂 交技术交技术 四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功 这里的分子杂交是标记的目的基因探针与这里的分子杂交是标记的目的基因探针与 从转基因生物中提取出来的从转基因生物中提取出来的mRNAmRNA杂交，若杂交，若 结果显示出有杂交带，则表明目的基因转结果显示出有杂交带，则表明目的基因转 录出了录出了mRNAmRNA。 基因建造工程的基本操作程序 检测检测 检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法方法: : 抗原抗体杂交抗原抗体杂交 四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴

47、定 具体过程：从转基因生物中提取出蛋白质具体过程：从转基因生物中提取出蛋白质 （抗原），用相应的抗体进行抗原抗体杂交，（抗原），用相应的抗体进行抗原抗体杂交， 若有杂交带出现则表明目的基因已经形成蛋若有杂交带出现则表明目的基因已经形成蛋 白质产物。白质产物。 将目的基因表达出的蛋白质注射动物进行免疫，将目的基因表达出的蛋白质注射动物进行免疫， 产生相应的抗体，并提取，产生相应的抗体，并提取， 从转基因生物中提取蛋白质（也就是抗原）。从转基因生物中提取蛋白质（也就是抗原）。 基因建造工程的基本操作程序 检测检测 鉴定鉴定 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 四、目的基因

48、的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功 除了分子检测外，与时还需要进行个体除了分子检测外，与时还需要进行个体 生物学水平的鉴定。生物学水平的鉴定。 如何了解抗虫棉是否具有抗虫特性呢？如何了解抗虫棉是否具有抗虫特性呢？ 可让虫食用棉花，观察其存活情况。可让虫食用棉花，观察其存活情况。 一个抗虫或抗病基因导入植物细胞后，一个抗虫或抗病基因导入植物细胞后， 是否赋予了植物抗虫或抗病特性，需要是否赋予了植物抗虫或抗病特性，需要 作抗虫或抗病特性的接种实验，以确定作抗虫或抗病特性的接种实验，以确定 是否具有抗性以及抗性的程度。是否具有抗性以及抗性的程度。 有的基因工程产品需要与天然

49、产品的功有的基因工程产品需要与天然产品的功 能进行活性比较，已确定转基因产品的能进行活性比较，已确定转基因产品的 功能活性是否与天然产品相同。功能活性是否与天然产品相同。 基因建造工程的基本操作程序 基因建造工程的基本操作程序 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 基因建造工程的基本操作程序 3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前 面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程 序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白， 可以用大肠杆菌吗？可以用大肠杆菌吗？

50、 有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链 是在内质网和高尔基体上加工完成的，内质网和是在内质网和高尔基体上加工完成的，内质网和 高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存 在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种 糖蛋白是不可能的。糖蛋白是不可能的。 P15思考与探究： 基因建造工程的基本操作程序 P15思考与探究： 珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分，珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分， 当它的成分异常时，动物可能患某种疾病，当它的成分异常时，动物可能患某种疾病

51、， 如镰刀型细胞贫血症，假如让你用基因工如镰刀型细胞贫血症，假如让你用基因工 程的方法使大肠杆菌生产出鼠的程的方法使大肠杆菌生产出鼠的珠蛋白，珠蛋白， 想一想，应该如何设计？想一想，应该如何设计？ 基因建造工程的基本操作程序 基本操作如下：基本操作如下： （1 1）从小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（珠蛋白基因的编码序列（cDNAcDNA）。）。 （2 2）将）将cDNAcDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另 外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。 （3 3）将表达载体导入无四环素抗性

52、的大肠杆菌中，然后）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后 在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未 进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死 掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白珠蛋白 基因已进入其中。基因已进入其中。 （4 4）培养进入了）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体， 破碎后从中提取破碎后从中提取-珠蛋白。珠蛋白。 基因建造工程的基本操作程序 提提 盒盒 刀刀 剪剪

53、基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 小结小结 基因建造工程的基本操作程序 一、目的基因的获取一、目的基因的获取 2 2、获取目的基因的常用方法有哪些、获取目的基因的常用方法有哪些? ? （1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取 （3 3）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增 （2 2）人工合成）人工合成 1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_ 编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因 小结小结 基因建造工程的基本操作程序 ( (一一) )从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多 DNA片断，导入到受体菌的群体中，各

54、片断，导入到受体菌的群体中，各 个受体菌分别含有这种生物的不同基因，个受体菌分别含有这种生物的不同基因， 称为基因文库。称为基因文库。 基因文库基因文库 基因组文库基因组文库 部分基因文库部分基因文库 （如（如:cDNA文库）文库） 1.1.基因文库基因文库 小结小结 基因建造工程的基本操作程序 （3）如何从基因文库中得到所需要的基因？如何从基因文库中得到所需要的基因？ 依据：目的基因的有关信息。依据：目的基因的有关信息。 如：根据基因的核苷酸序列如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因基因在染色体上的位置在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNA 基因表达产物蛋白质基

55、因表达产物蛋白质 等特性。等特性。 小结小结 基因建造工程的基本操作程序 PCR是聚合酶链式反应是聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction）,它它 是利用是利用DNA 双链复制的原理，将双链复制的原理，将 基因的核苷酸序列不断的加以复基因的核苷酸序列不断的加以复 制，使其数量呈指数方式增加。制，使其数量呈指数方式增加。 因为整个过程是在体外进行，所因为整个过程是在体外进行，所 以又叫做体外以又叫做体外DNA扩增技术。扩增技术。 小结小结 基因建造工程的基本操作程序 PCR扩增仪扩增仪 DNA双链复制的基本原理双链复制的基本原理 一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目

56、的基因的核苷酸序列(引物引物) 原料原料四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸 引物：一小段单链引物：一小段单链DNA或或RNA,一对一对 酶酶-热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶） 模板模板-DNA-DNA的两条链的两条链 温度控制和缓冲液温度控制和缓冲液 能量能量ATP 2 2n n 小结小结 基因建造工程的基本操作程序 a a、DNADNA受热变性（受热变性（90-9690-96）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_ b b、冷却（、冷却（复性复性55-6555-65）：系统温度降低，引物与）：系统温度降低，引物与DNADNA

57、模板结模板结 合，形成局部合，形成局部_。 c c、加热（、加热（70-7570-75）：在热稳定）：在热稳定DNADNA聚合酶聚合酶（TaqTaq酶）的作用酶）的作用 下，从引物的下，从引物的55端端33端延伸，合成与模板互补的端延伸，合成与模板互补的_。 氢键氢键单链单链DNADNA 双链双链 DNADNA链链 小结小结 基因建造工程的基本操作程序 DNA合成仪合成仪 推推 测测 推推 测测 合合 成成 基因建造工程的基本操作程序 目的：目的： 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代. 同时使目的基因能够表达和发挥作用。同时

58、使目的基因能够表达和发挥作用。 a、目的基因、目的基因 b、启动子、启动子 c、终止子、终止子 d、标记基因、标记基因 核心核心 小结小结 基因建造工程的基本操作程序 ( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 转化转化 : : 方法方法 将目的基因导入将目的基因导入 植物细胞植物细胞 将目的基因导入将目的基因导入 动物细胞动物细胞 将目的基因导入将目的基因导入 微生物细胞微生物细胞 农杆菌转化法农杆菌转化法 基因枪法基因枪法 花粉管通道法花粉管通道法 显微注射法显微注射法 Ca2+ 处理法处理法 感受态细胞感受态细胞 目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程 受体细胞受体细胞 稳定稳定表达表达 小结 基因建造工程的基本操作程序 农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植 物，当植物受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大物，当植物受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大 量的酚类化合物，吸引农杆菌移向细胞。这时农量的酚类化合物，吸引农杆菌移向细胞。这时农 杆菌中的杆菌中的Ti质粒上的质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，可转移至受体细胞， 并整合到受体细胞的染色体的并整合到受体细胞的染色体的DNA上。上。 小结 基因建造工程的基本操作程序 农杆