微生物的实验室培养实验

1、到目前为止，到目前为止， 几十项几十项Nobel生理学和医学奖，化学奖生理学和医学奖，化学奖 都与微生物学有关都与微生物学有关 微生物的实验室培养实验 微生物的类群微生物的类群 原生生物：原生生物： 原核生物原核生物: 真菌真菌: 病毒病毒: 如酵母菌如酵母菌 单细胞的动植物单细胞的动植物 如草履虫、单细胞藻类等如草履虫、单细胞藻类等 无细胞结构无细胞结构 真核细胞真核细胞 细菌、蓝藻细菌、蓝藻原核细胞原核细胞 微生物的实验室培养实验 课题1 微生物的实验室培养 1.提供营养和条件 2.防止污染 微生物的实验室培养实验 一一. .培养基：培养基：微生物生存的环境和营养物质微生物生存的环境和营养

2、物质 1.1.基本成分：基本成分： 思考：微生物“吃”什么？ 碳源、氮源、水、无机盐碳源、氮源、水、无机盐 碳源碳源 无机碳源：无机碳源： 有机碳源：有机碳源： COCO2 2、COCO3 32 2- -、HCOHCO3 3- - 牛肉膏、蛋白胨等牛肉膏、蛋白胨等 自养微生物自养微生物 异养微生物异养微生物 氮源氮源 无机氮源：无机氮源： 有机氮源：有机氮源： N N2 2、NHNH4 4 、 、NONO3 3- -（为硝化细菌提供 （为硝化细菌提供N N源和能源）源和能源） 牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等 注：含注：含CHONCHON的有机物是异养型微生物的碳源

3、、氮源、能源的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源 2.2.特殊成分：特殊成分： 生长因子：核苷酸、碱基、维生素等生长因子：核苷酸、碱基、维生素等 微生物的实验室培养实验 一一. .培养基：培养基：微生物生存的环境和营养物质微生物生存的环境和营养物质 1.1.基本成分：基本成分：碳源、氮源、水、无机盐碳源、氮源、水、无机盐 2.2.特殊营养：特殊营养：维生素、碱基等（生长因子）维生素、碱基等（生长因子） （牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有） 3.pH3.pH、氧气的需求：、氧气的需求： 4.4.种类：种类： 固体培养基固体培养基 液体培养基液体培养基 有无有无 凝

4、固剂琼脂凝固剂琼脂 分离分离 鉴定鉴定 工业工业 生产生产 化学成分：化学成分： 物理性质：物理性质： 天然培养基天然培养基 合成培养基合成培养基 微生物的实验室培养实验 牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基 是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。 1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方 H2O 定容至定容至1000ml Nacl 5g 蛋白胨蛋白胨 10g 牛肉膏牛肉膏 5g 琼脂琼脂20.0g 分析营养构成？分析营养构成？ 微生物的实验室培养实验 5. 5. 配制原则配制原则 目的明确：目的明确： 营养全面、浓度

5、适宜、比例恰当营养全面、浓度适宜、比例恰当 适宜的适宜的pHpH值：值： 有机碳源有机碳源异养型：异养型： 根据微生物的种类、培养目的选择原料根据微生物的种类、培养目的选择原料 自养型：自养型： 不加碳源不加碳源 加入缓冲剂加入缓冲剂 细菌偏碱（细菌偏碱（7-87-8），真菌偏酸（），真菌偏酸（5-65-6） （COCO2 2碳源）碳源） 生产生产科研科研 微生物的实验室培养实验 耐高温需保持干燥的耐高温需保持干燥的 物品，物品，160170 12小时小时 接种环、接种针等接种环、接种针等 金属用具金属用具 7075、30min 80、15min 100、56min 消毒消毒灭菌灭菌 定义定义

6、 方法方法 较为温和理化方法，较为温和理化方法， 杀死部分有害菌体杀死部分有害菌体 （不包括芽孢、孢子）（不包括芽孢、孢子） 强烈的理化方法，强烈的理化方法， 杀死所有微生物杀死所有微生物 （包括芽孢、孢子）（包括芽孢、孢子） 煮沸消毒法煮沸消毒法 巴氏消毒法巴氏消毒法 化学药剂化学药剂 紫外线紫外线 灼烧灭菌灼烧灭菌 干热灭菌干热灭菌 酒精、氯气、石炭酸等酒精、氯气、石炭酸等 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌 培养基，培养基， 100KPa、 121、1530min 二二. .无菌技术：无菌技术：防止外来杂菌的污染防止外来杂菌的污染 1.1.消毒与灭菌：消毒与灭菌： 微生物的实验室培养实验 高压蒸汽

7、灭菌锅的使用步骤：高压蒸汽灭菌锅的使用步骤： 1、加水：使用前加人适量的水、加水：使用前加人适量的水 2、装锅：待灭菌的物品放在灭菌锅内，盖好锅盖，旋紧固、装锅：待灭菌的物品放在灭菌锅内，盖好锅盖，旋紧固 定螺栓，打开排气阀。定螺栓，打开排气阀。 3、加热排气：目的排尽其中的冷空气，关闭排气阀。、加热排气：目的排尽其中的冷空气，关闭排气阀。 4、保温保压：、保温保压：100KPa、121、20-30min.20-30min. 5 5、出锅：压力表为、出锅：压力表为0 0时，温度时，温度6060打开排气阀，开盖取出物品。打开排气阀，开盖取出物品。 微生物的实验室培养实验 请你判断以下材料或用具是

8、否需要消毒或请你判断以下材料或用具是否需要消毒或 灭菌。如果需要，请选择合适的方法。灭菌。如果需要，请选择合适的方法。 （1 1） 培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿 （2 2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3 3） 实验操作者的双手实验操作者的双手 微生物的实验室培养实验 2.2.无菌范围：无菌范围：实验操作空间消毒实验操作空间消毒 操作者的手、衣着消毒操作者的手、衣着消毒 实验用具灭菌实验用具灭菌 实验操作过程实验操作过程 二二. .无菌技术：无菌技术：防止外来杂菌的污染防止外来杂菌的污染 1.1.消毒与灭菌：消毒与灭菌： 酒精灯旁操作酒精灯旁操作 超

9、净工作台超净工作台 微生物的实验室培养实验 有些细菌在一定的条件下，细胞里面有些细菌在一定的条件下，细胞里面 形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。 芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温 等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如， 有的细菌的芽孢，煮沸有的细菌的芽孢，煮沸3 3小时以后才死小时以后才死 亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。 当环境适宜（如温度、水分适宜）的当环境适宜（如温度、水分适宜）的 时候，芽孢又可以萌发，形成一个细时候，芽孢又可以萌发，形成一个细 菌菌 细菌、原

10、生动物、真菌和植细菌、原生动物、真菌和植 物等产生的一种有繁殖作用物等产生的一种有繁殖作用 的生殖细胞。能直接发育成的生殖细胞。能直接发育成 新个体。新个体。 微生物的实验室培养实验 单个单个 或少数菌体或少数菌体 2.2.特征：特征：大小、形状、光泽度、大小、形状、光泽度、 颜色、透明度等。颜色、透明度等。 3.3.功能：功能： 1.1.定义：定义： 菌落菌落 鉴定菌种的重要依据鉴定菌种的重要依据 固体培养基上固体培养基上 大量繁殖大量繁殖 子细胞群体子细胞群体 微生物的实验室培养实验 1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方 H2O 定容至定容至1000ml

11、 Nacl 5g 蛋白胨蛋白胨 10g 牛肉膏牛肉膏 5g 琼脂琼脂20.0g 三三. .大肠杆菌的纯化培养：大肠杆菌的纯化培养： 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 1.1.计算：计算：培养基用量培养基用量 依配方计算各成分的用量依配方计算各成分的用量 2.2.称量：称量： 3.3.溶化：溶化： 牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏黏稠，用称量纸称取 牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖 牛肉膏、称量纸牛肉膏、称量纸 、少量水加热溶解、少量水加热溶解 取纸取纸 蛋白胨、蛋白胨、NaClNaCl琼脂琼脂 补水定容补水定容 4.4.调调pHpH、分装、包扎

12、：、分装、包扎： 5.5.灭菌：灭菌： 6.6.搁置斜面或倒平板：搁置斜面或倒平板： 培养基、培养皿培养基、培养皿 分散成单个细胞分散成单个细胞, ,形成单个菌落形成单个菌落 微生物的实验室培养实验 温度冷却至温度冷却至50左右将试管枕在左右将试管枕在1cm1cm的木条上，斜面长度的木条上，斜面长度 不超过试管总长的不超过试管总长的1/21/2 微生物的实验室培养实验 约约50 防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染 灼烧灭菌，灼烧灭菌， 防止瓶口的微生物污染培养基防止瓶口的微生物污染培养基 微生物的实验室培养实验 1. 1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌

13、后，需要冷却到50 50 左右左右 时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养 基的温度？基的温度？ 答：答：可以用手触摸盛有培养基的锥形可以用手触摸盛有培养基的锥形 瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手 时，就可以进行倒平板了。时，就可以进行倒平板了。 2.2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微 生物污染培养基。生物污染培养基。 微生物的实验室培养实验 3.3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒

14、置？ 4.4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅 在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来 培养微生物吗？为什么？培养微生物吗？为什么？ 答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固 后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置， 既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以 防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之答：空气中的微生

15、物可能在皿盖与皿底之 间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板 培养微生物。培养微生物。 微生物的实验室培养实验 二二. .斜面接种和斜面接种和培养培养大肠杆菌：大肠杆菌： 1、斜面接种大肠杆菌的目的：、斜面接种大肠杆菌的目的： 菌种转移、扩大培养、保存纯净菌种等菌种转移、扩大培养、保存纯净菌种等 2、步骤：、步骤： a、点燃酒精灯、点燃酒精灯 b、灭菌接种环、灭菌接种环 c、试管管口过火、试管管口过火 d、挑取菌种、挑取菌种 e、接种划线、接种划线 -S型曲线型曲线 f、试管口和接种环过火灭菌、试管口和接种环过火灭菌 g、培养大肠杆菌、培养大肠杆菌-恒

16、温箱（恒温箱（37）培养）培养24h24h 微生物的实验室培养实验 三三. .大肠杆菌的纯化培养：大肠杆菌的纯化培养： 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 纯化大肠杆菌：纯化大肠杆菌： 平板划线法：平板划线法： 菌种菌种 划划3 3个平板个平板 1 1个不划线个不划线 1.1.纯化大肠杆菌的方法：纯化大肠杆菌的方法：平板划线法平板划线法和稀释涂布平板法和稀释涂布平板法 接种环接种环 防止划破培养基防止划破培养基 （重复实验）（重复实验） （空白对照）（空白对照） 微生物的实验室培养实验 平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表 面连续划

17、线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到 培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由 一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。 微生物的实验室培养实验 1 1、为什么在操作的第一步以及每次划线之、为什么在操作的第一步以及每次划线之 前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然 需要灼烧接种环吗？为什么？需要灼烧接种环吗？为什么？ 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上 可能存在的微生物污染培养

18、物可能存在的微生物污染培养物 杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时，杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时， 菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划 线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐 减少，以便得到菌落。减少，以便得到菌落。 及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染 环境和感染操作者。环境和感染操作者。 微生物的实验室培养实验 2.2.在灼烧接种环之后，为什么要等其在灼烧接种环之后，为什么要等其 冷却后再进行划线？冷却后再进行划线？ 答：以免接种环温度太高，杀死菌

19、种。答：以免接种环温度太高，杀死菌种。 3.3.在作第二次以及其后的划线操作时，在作第二次以及其后的划线操作时， 为什么总是从上一次划线的末端开始划线为什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 答：划线后，线条末端细菌的数目比线答：划线后，线条末端细菌的数目比线 条起始处要少，每次从上一次划线的末端开条起始处要少，每次从上一次划线的末端开 始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而 逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来 的菌落。的菌落。 微生物的实验室培养实验 6 6支试管，分别加入支试管，分别加入9ml9ml无菌水无菌水

20、1ml 101 1ml 102 1ml 103 1ml 104 1ml 105 1ml 106 稀释涂布平板法：稀释涂布平板法： a.a.梯度稀释菌液：梯度稀释菌液： 菌液菌液 微量微量 移移 液器液器 微生物的实验室培养实验 浸浸 稀释涂布平板法：稀释涂布平板法： a.a.梯度稀释菌液：梯度稀释菌液： b.b.涂布平板：涂布平板： 不超过不超过0.1ml0.1ml 各梯度分别涂布各梯度分别涂布3个平板个平板 1 1个不涂布作空白对照个不涂布作空白对照 滴滴 灼灼 涂涂 稀稀 释释 10103 3 倍倍 稀稀 释释 10104 4 倍倍 稀稀 释释 10105 5 倍倍 微生物的实验室培养实验

21、 稀释涂布法是将菌液进行一系列梯度稀释，稀释涂布法是将菌液进行一系列梯度稀释， 然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培 养基的表面，进行培养。养基的表面，进行培养。 微生物的实验室培养实验 涂布平板的所有操作都应在火焰附近涂布平板的所有操作都应在火焰附近 进行。结合平板划线与系列稀释的无菌进行。结合平板划线与系列稀释的无菌 操作要求，想一想，第操作要求，想一想，第2 2步应如何进行无步应如何进行无 菌操作？菌操作？ 应从操作的各个细节保证应从操作的各个细节保证“无菌无菌”。 例如：酒精灯与培养皿的距离要合适、例如：酒精灯与培养皿的距离要合适、 吸管头不要接触任何其他物体、吸管头不要接触任何其他物体、 吸管要在酒精灯火焰周围等等。吸管要在酒精灯火焰周围等等。 微生物的实验室培养实验 优点优点缺点缺点 平板划线平板划线 分离法分离法 可以观察菌落特征，可以观察菌落特征， 对混合菌进行分离对混合菌进行分离 不能计数不能计数 稀释涂布稀释涂布 平板法平板法 可以计数，可以观察可以计数，可以观察 菌落特征菌落特征 吸收量较少、较麻烦，吸收量较少、较麻烦， 平板不干燥效果不好，平板不干燥效果不好， 容易蔓延容易蔓延 3平板划线法和稀释涂布平板法的比较平板划线法和稀释涂布平板法的比较 微生物的实验室培养实验 平板划线法：平板划线法： 二二.