第五章抗药性

1、2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性1 第五章第五章 害虫对杀虫药剂的抗性害虫对杀虫药剂的抗性 Insecticide resistance of pest insects 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性2 据报道：据报道： l有病虫草鼠有病虫草鼠70000种，种，10%造成造成 危害危害 l采收前病虫草害损失大于采收前病虫草害损失大于40 l采收后病虫害损失达采收后病虫害损失达20 (Ethics,2000，J. Agri. v Two AChE genes (Ace1 and Ace2) recently found in at least 17 arthropod sp

2、ecies; v Limited information on functions of each AChE. Zhu et al., unpublished 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性32 Azinphos-Methyl Resistance in Colorado Potato Beetle: v Resistance level in azinphos-methyl resistant strain (AZ-R) compared with a susceptible strain (SS): - 136-fold v Genetic basis of resistanc

3、e: - Incompletely recessive; - At least 2 contributing factors v Two major resistance mechanisms: - Altered AChE; - Enhanced O-demethylase activity ( kpn/colobtl.jpg) (Photo by C. S. Gorsuch) (Argentine et al. 1994) 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性33 Summary of Purification of AChE from CPB SDS-PAGE of Purifie

4、d AChE A: Molecular weight markers B: Untreated AChE C: Dithiothreitol treated AChE (Zhu and Clark 1994, 1995) Affinity ligand: 3-(carboxyphenyl) ethyldimethyl ammonium. (Zhu and Clark 1994) 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性34 (Zhu and Clark 1995) 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性35 (Zhu and Clark 1995) Kinetic Comparisons

5、 of AChE Purified from the SS and AZ-R Strains with Four Substrates ATC: Acetylthiocholine A MTC: Acetyl-( -methyl) thiocholine PTC: Propionylthiocholine BTC: S-butyrylthiocholine 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性36 (Zhu and Clark 1995) 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性37 (Zhu et al. 1996) 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性38 50 m mM A

6、zinphosmethyl-oxon * * * * * * O O O O (Zhu et al. 1996) 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性39 (Zhu et al. 1996) 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性40 Serine/glycine mutation A: Autoradiogram B: Relative Location of Ser/Gly Mutation (Zhu et al. 1996) 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性41 (Zhu et al. 1996) 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性42 (Zhu et al.

7、 1996) 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性43 “, rAChEs elicited structureactivity relationships reminiscent of those previously reported for the native forms of AChEs 8 in which the less bulky substrates and inhibitors (ATC, azinphosmethyl oxon, and DDVP) interacted more efficiently with the native AChE from the

8、SS strain and the more bulky substrates and inhibitors (BTC, paraoxon, and DFP) interacted more efficiently with the native AChE from the AZ-R strain.” 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性44 2. 2.神经敏感度降低神经敏感度降低 神经敏感度降低的可能机制：神经敏感度降低的可能机制： A 抗性昆虫中可能没有杀虫剂的结合部位抗性昆虫中可能没有杀虫剂的结合部位 B 可结合，但不影响神经系统的功能可结合，但不影响神经系统的功能 C 可结合，也

9、影响神经系统的功能，但作用有限可结合，也影响神经系统的功能，但作用有限 例：例：Kdr 因子与因子与Super-Kdr因子因子 环戊二烯和六六六的抗性环戊二烯和六六六的抗性 一一）靶标敏感度降低 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性45 二）穿透性降低 三）解毒代谢增强 目前认为，解毒代谢的增强主要有以下目前认为，解毒代谢的增强主要有以下 两个途径：两个途径： 1. 酶的结构发生改变，更适合于降解杀虫酶的结构发生改变，更适合于降解杀虫 剂质变剂质变 2. 在调节基因的作用下，解毒酶系的量增加在调节基因的作用下，解毒酶系的量增加 量变量变 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性46 杀

10、虫剂杀虫剂 从不同地区采集试虫，分离获得从不同地区采集试虫，分离获得5个抗性棉蚜株系。其中从安阳和北个抗性棉蚜株系。其中从安阳和北 京试虫中分离的株系抗性最高，南京和莱阳次之，泰山的最低。京试虫中分离的株系抗性最高，南京和莱阳次之，泰山的最低。 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性47 (molL-1) 不同品系棉蚜乙酰胆碱酯酶的不敏感性与其抗性具有显著不同品系棉蚜乙酰胆碱酯酶的不敏感性与其抗性具有显著 的相关关系。说明的相关关系。说明是棉蚜对有机磷和氨基甲是棉蚜对有机磷和氨基甲 酸酯类杀虫剂抗性的重要机制酸酯类杀虫剂抗性的重要机制 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性48 Str

11、ainInsecticide/synergistLC50(mg/ml)Synergistic folds SS -cyhalothrin0.379(0.020-2.024) 10-31.49 SS -cyhalothrinPBO0.254(0.018-1.824) 10-31 NILsRR -cyhalothrin12.950(6.554-24.474)21.43 NILsRR -cyhalothrinPBO0.604(0.094-4.524)1 多功能氧化酶活性升高是甜菜夜蛾对多功能氧化酶活性升高是甜菜夜蛾对菊酯抗菊酯抗 性的主要原因之一，酯酶活性的升高也有一定的作用性的主要原因之一，酯酶活

12、性的升高也有一定的作用 Strain EsteraseGlutathione-S-transferaseP450 Activity (mol/min/mg Pr) Ratio Activity (OD/min/mg Pr) Ratio Content (nmol/mg Pr) Ratio SS0.07200.0111.00a0.04560.005561a0.0630.061a NILsRR0.10420.0171.48b0.04370.008830.958a0.1600.092.54b 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性49 吡虫啉筛选过程中褐飞虱的抗性发展吡虫啉筛选过程中褐飞虱的抗性

13、发展 利用吡虫啉对褐飞虱进行了室内抗性筛选。如图所示，利用吡虫啉对褐飞虱进行了室内抗性筛选。如图所示，33代后，抗性达代后，抗性达 到并维持在到并维持在250倍左右。说明褐飞虱具有对吡虫啉产生高水平抗性的潜倍左右。说明褐飞虱具有对吡虫啉产生高水平抗性的潜 能。能。 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性50 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 PT2T4T6T8T10 T12 T14 T16 T18 T20 T22 T24 T26 T28 T30 T32 T34 Generation Activity(pmolmin-1mg-1) O-demethylase N-

14、demethylase 筛选过程中筛选过程中P450单加氧酶活力变化单加氧酶活力变化 25代以前代以前MFO酶活力升高与抗性增长高度相关，酶活力升高与抗性增长高度相关，25代以后无相关性代以后无相关性 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性51 棉蚜不同品系对溴氰菊酯的敏感度棉蚜不同品系对溴氰菊酯的敏感度 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性52 底物底物 羧酸酯酶活性羧酸酯酶活性 （mol mg-1 min-1 protein） 相对比相对比 值值 抗性品系抗性品系敏感品系敏感品系 -NA4.040.1*1.100.023.67 -NA1.700.02*0.840.0042.02

15、2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性53 图图5- 6 两个溴氰菊酯品系与敏感品系两个溴氰菊酯品系与敏感品系mRNA相对表达量比较相对表达量比较 6.28倍倍 6.61倍倍 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性54 底物底物 羧酸酯酶代谢活力羧酸酯酶代谢活力(pmol/min/mg) 氧化乐果氧化乐果 抗性品系抗性品系 氧化乐果氧化乐果 敏感品系敏感品系 代谢活代谢活 力比力比 溴氰菊酯溴氰菊酯 抗性品系抗性品系 溴氰菊酯溴氰菊酯 敏感品系敏感品系 代谢活代谢活 力比力比 溴底物溴底物100.73.40.22.947.60. 4 6.20. 21.23 氯底物氯底物40.22.40

16、. 11.679.30. 9 5.20.41.79 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性55 诊断剂诊断剂 量法量法 五、害虫抗药性监测五、害虫抗药性监测 1 生物测定法生物测定法 点滴法点滴法 浸渍法浸渍法 药膜法药膜法 喷雾法喷雾法 2 生物化学法生物化学法 3 分子生物学法分子生物学法 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性56 诊断剂量法诊断剂量法 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性57 生物测定的基本原则：生物测定的基本原则： 1方法的标准化方法的标准化 2试虫的一致性试虫的一致性 3环境条件的一致性环境条件的一致性 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性58

17、2生物化学法 u乙酰胆碱酯酶（乙酰胆碱酯酶（AChEAChE）区分浓度法区分浓度法 区分浓度：能够抑制敏感德国小蠊乙酰胆碱酯酶正常区分浓度：能够抑制敏感德国小蠊乙酰胆碱酯酶正常 活性活性90%的杀虫药剂的浓度。的杀虫药剂的浓度。 用该浓度的药剂处理待测用该浓度的药剂处理待测 害虫害虫AChE一定时间后，测残存酶活性：一定时间后，测残存酶活性： n AChE存活（存活（ 药剂处理组药剂处理组 无药剂对照组）无药剂对照组） 100 n判别标准：判别标准： AChE存活率大于存活率大于20为不敏感的为不敏感的AChE。 如果是单头测定，具有不敏感如果是单头测定，具有不敏感AChE的个体为对有机磷的个

18、体为对有机磷 或氨基甲酸酯类药剂具有抗性的个体，抗性个体在种群或氨基甲酸酯类药剂具有抗性的个体，抗性个体在种群 中的比例达到中的比例达到10时为抗性种群。时为抗性种群。 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性59 2生物化学法 u 羧酸酯酶（羧酸酯酶（CarECarE）活性测定）活性测定 u 多功能氧化酶（多功能氧化酶（MFO）活性测定）活性测定 u 谷胱甘肽谷胱甘肽S-转移酶（转移酶（GSTs）活性测定）活性测定 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性60 3分子生物学法 n3.13.1 随机扩增多态随机扩增多态 性（性（RAPDRAPD） n3.2 3.2 扩增片段长度扩增片段长度

19、 多态性（多态性（AFLPAFLP） MRRSS 随机引物随机引物 随机引物随机引物 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性61 例证 M M 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性62 M S1 S2 S3 S-1 S-2 S-3 R1 R2 R-1 M 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性63 1200 800 500 200 1200 800 500 200 小菜蛾对阿维菌素抗性的RAPD标记 小菜蛾对阿维菌素抗性的SCAR标记 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性64 SCAR标记 nSCAR标记，即Sequence Characterized Amplified

20、Region，序列特征化扩增区域 。 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性65 3分子生物学法 3.33.3点突变检测法点突变检测法 A) PCRREN法法(PCR/Restriction Endonuclease, PCR/REN ) B) PASA法（法（PCR Amplication of Specific Alleles, PASA） C) PCR-单链构型多态性分析（单链构型多态性分析（Single-Stranded Conformational polymorphism Analysis, SSCP） 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性66 A) PCRREN法法 (

21、PCR/Restriction Endonuclease, PCR/REN ) MSSRS 引物引物1 引物引物2 RR Hae II R S 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性67 例证 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性68 B) PASA法（法（PCR Amplication of Specific Allales, PASA） MRRSS 引物引物1 5 S引物引物 RS S R G T 3C 3A 5 R引物引物 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性69 例证 小菜蛾对高效氯氰菊酯抗性基因的小菜蛾对高效氯氰菊酯抗性基因的PASA检测检测 2021-4-29第五章

22、抗药性第五章抗药性70 C) PCR-单链构型多态性分析（单链构型多态性分析（Single- Stranded Conformational polymorphism Analysis, SSCP） MRRSS 引物引物1 引物引物2 S R RS 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性71 例证 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性72 例证 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性73 六、害虫抗药性治理六、害虫抗药性治理 n害虫抗药性治理的三种策略害虫抗药性治理的三种策略 n1 1 适度治理适度治理management by moderation n2 2 饱和治理饱和治理m

23、anagement by saturation n3 3 多向进攻治理多向进攻治理management by multiple attack 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性74 1 适度治理 低剂量用药，以保留一定比例的敏感低剂量用药，以保留一定比例的敏感 基因型；基因型； 减少施药次数；减少施药次数； 用残效期短的化合物；用残效期短的化合物； 局部施药，保持一定的庇护区；局部施药，保持一定的庇护区； 提高施药害虫的种群阈限等。提高施药害虫的种群阈限等。 2021-4-29第五章抗药性第五章抗药性75 2 2 饱和治理饱和治理 高剂量施药，表达出功能上隐性的抗性基因高剂量施药，表达出功能上隐性的抗性基因