乳酸菌的分离与纯化

1、乳酸菌的分离与纯化及土豆（大豆）发酵1乳酸菌的种类、形态、生理生化特征乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总 称。大多数不运动，少数以周毛运动。菌体常排列成链。在其发酵产物中只有乳 酸的称为同型乳酸发酵，而产物中除乳酸外还有较多乙酸、 乙醇、CO2等物质的 称为异型乳酸发酵。 有微好氧菌和专性厌氧菌。 根据细胞形态为球状或杆状， 可 分为两大类，即乳酸链球菌族（Streptococceae ）和乳酸杆菌（Lactobacilleae ）。乳酸链球菌族， 菌体球状， 通常成对或成链， 在固体培养基上菌落较小， 生长缓慢。多数为同型发酵，如链球菌属（ Streptoco

2、ccus ），是与人类关系密 切的重要菌群， 有些菌是人和温血动物的致病菌； 有些是人体的正常菌群存在于 口腔和肠道；有些是乳制品及植物发酵食品中的常用菌，常在食品工业中使用， 如乳链球菌（ Slactis ）。少数为异型发酵，如肠膜状明串珠菌（ Leuconostocmesenteroides ）是制药工业上生产右旋糖酐 （即代血浆） 的重要 菌种，但也是制糖工业的一种害菌，常使糖汁发粘稠而无法加工。乳酸杆菌族， 菌体杆状，单个或成链，有时成丝状、产生假分枝。在BCG牛乳培养基琼脂平板上，乳酸菌菌落大约1-3 mm，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生

3、 CaCO3 的溶解圈。乳酸菌革兰氏染色呈阳性，涂片镜检细胞杆状或链球状。2. 实验材料2.1 试验设备天平1个、牛角匙、电炉1个、pH试纸（1套）、100ml量筒（2个）、 漏 斗、漏斗架（ 1 套）、 玻璃棒（ 2 根）、棉塞、 培养基（ 15 个）、 无菌移液 管（3支）、 牛皮纸（5张）、 线绳、标签、500mL锥形瓶3个、 250mL 锥形瓶2个、试管20只、 500mL烧杯2个、250mL烧杯2个、 100mL烧 杯2个、 酒精灯2个、石棉网1个、接种针（环）2个。2.2实验仪器50L的高压蒸汽灭菌锅、恒压干热灭菌箱 、超镜台、光学显微镜、75%酒精和 脱脂棉、恒温培养箱、冰箱。2

4、.3实验药品新鲜酸奶（1瓶）、40g脱脂奶粉或全脂奶粉、20g蔗糖、5ml1.6%溴甲酚绿乙醇溶液（1.6g固体溴甲酚绿和98.4g 100%乙醇）、5g酵母膏、5g琼脂、结晶 紫染液、 卢戈氏碘液（1克碘，2克碘化钾，300毫升水）、 95%乙醇、石 炭酸复红染液（8g碱性复红溶、5g苯酚）。溴甲酚绿:3, 3, 5, 5-四溴间甲酚磺酰酞 Bromocresol green; -Sultone注：一、石碳酸复红染液配制方法：1、碱性复红乙醇染色储备液：a 、碱性复红染色储备液：8g碱性复红溶于95%酉精溶液100ml。b 、5%石碳酸水溶液：5g苯酚溶于100ml蒸馏水中。2、染色液：10

5、mla液与90mlb液充分混合。生理盐水：称取9g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到 1000毫升二、草酸铵结晶紫染液的配制：溶液A溶液B结晶紫2克草酸铵0.8克95%酉精20毫升蒸馏水80毫升1. 将A、B溶液混合，用滤纸过滤后即可使用。2. 结晶紫滴一滴即可，不需多用，以避免污染桌面及手指。3. 试验方法及操作过程3. 0菌悬液的配制取1洁净三角瓶，盛以225ml生理盐水；7只洁净试管，各盛9ml的生理盐水； 加塞包扎于在103kPa 121C高压蒸汽灭菌20Min，得到无菌生理盐水。将酸奶样品搅拌均匀，用无菌移液管吸取样品 25ml加入盛有225ml无菌生理盐 水的三角瓶中，在旋涡均匀器

6、上充分振摇，使样品均匀分散，即为10-1的样品稀释液；将7只装9ml生理盐水的无菌试管，依次标记 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7,再用无菌移液管吸10-1的菌悬液1ml放入依次装有9ml无菌水的试管中， 稀释混匀便得到10-2稀释液，如此重复依次制得10-310-7的稀释液。3.1 BCG牛乳培养基配方及灭菌(A) 液：脱脂奶粉10克，水50ml，加入1.6%溴甲酚绿乙醇溶液1ml，80C灭 菌 20min。(B) 液：酵母膏1克，水50克，琼脂2克，pH6.8, 121 C灭菌20.min。按照配方正确称取所需药品放于烧杯中，在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅 匀，加

7、热溶解，用1N NaOH或 1N HCl调pH,用pH试纸对照，加琼脂溶化，加热过程要不断搅拌，可适当补水。琼脂完全溶解后倒入250mL的锥形瓶中，用纱 布包扎好（注意不要污染纱布） ，再用牛皮纸包扎， 贴上标签 （必须用铅笔写） ， 注明何种培养基。在高压锅中，在 1kg/cm2 压力下维持 30min。3.2倒BCG培养基平板的方法将灭好菌的A液和B液趁热充分混合，点燃酒精灯对周围的空气进行灭菌， 并在酒精灯的附近用左手握着平板用拇指和小拇指打开一个小缝， 趁热将培养液 倒如平板内， 倒入的量能使培养基刚要覆盖平板底部， 倒好后把平板平放到实验 台，轻轻晃动是培养基形成一个平面， 等培养基

8、冷却凝固后倒放并贴上标签。 （注 意：整个实验要在酒精灯附近做，以保证培养基不染菌）3.2.1倒平板把灭菌的CaC03加入融化了的培养基中，于自来水中迅速冷却培养基至 46C 左右（手感觉到有点烫 ,但能长时间握住 ）,边冷却边摇晃使 CaCO3 混匀,但不得产 生气泡。取无菌平板 9 个，编号标明 10-5、10-6、 10-7各三套；将经高温消毒的培养基冷却到50C左右，按无菌操作法倒 9只平板，每皿约15ml ;平置使培养基均匀分布在皿底，待凝固。3.22 分离方法用三支 1ml 无菌移液管分别吸取 10-5、10-6和 10-7的稀释菌悬液各 1ml， 对号接种于与之对应的3个无菌平板

9、中，每个平皿放0.1ml;尽快用无菌玻璃涂 棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于试验台上20 Min ;然后倒置于40C恒温箱中培养 48 小时。如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步 定为乳酸菌。3.3 脱脂乳试管的配制与灭菌直接选用脱脂乳液或按脱脂奶粉10克与蔗糖5克，水95克（蔗糖与水的比 例在1: 10的范围内）的比例配制，装量以试管的 1/3为宜，115C灭菌15min。选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40C培养8-24小时，若牛乳出现 凝固，无气泡呈酸性者进一步判断为乳酸菌。3.4镜检取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴生理盐水，无菌操作法取少量菌体 涂片；结晶紫初染一碘液媒染一乙醇脱色一番红复染，干燥后用油镜观察，菌体 被染成蓝紫色的是乳酸菌；其中乳酸杆菌呈杆状，成单杆、双杆或长丝状。乳酸 杆菌成球状，成对或短链或长链状。4. 发酵过程4、1样品：水，土豆，大豆，培养的乳酸菌样品，报纸，绳子若干4.2实验仪器：榨汁机，移液管50L的高压蒸汽灭菌锅，酒精灯、恒温 箱2支试管4、3实验步骤：1.清洗大豆或土豆和4个250ml三角锥瓶、2支试管并灭菌2.预先把大豆在水中浸泡2小时，（或土豆切成小块）3.将上述样品至于榨汁机中榨成匀浆， 倒三角锥瓶（各2瓶，试管