实验8植物组织中可溶性糖含量的测定

1、实验方案一、实验目的通过实验，掌握测定萝卜品质的方法（一） 萝卜外部形态的测定1、实验材料取鲜样3个/小区直尺、蒸馏水、笔、记录本、吸水纸2、实验方法用自来水将各组萝卜洗净后， 再用蒸馏水洗涤， 擦干表面水分 每 个小区取 3个重复，用电子天平称量每株的鲜重，用直尺测量植株 的茎长、茎粗、叶长，取平均值作为指标值实验 （二） 植物体内可溶性糖含量的测定（蒽酮法）一、实验目的 了解蒽酮法测定可溶性糖含量的原理； 掌握分光光度计的使用二、实验原理 糖类物质是构成植物体的重要组成成分之一，也是新陈代谢的主要 原料和贮存物质。不同载培条件，不同成熟度都可以影响水果、蔬菜中 糖类的含量。因此对水果、蔬菜

2、中可溶性糖的测定，可以了解和鉴定水 果、蔬菜品质的高低。蒽酮比色定糖法是一个快速而方便的定糖方法，在 强酸性 条件下， 蒽酮可以与游离的或多糖中存在的己糖、戊糖及己糖醛酸（还原性和非 还原性）作用生成 蓝绿色 的糖醛衍生物，其颜色的深浅与糖的含量在一 定范围内成 正比 。蒽酮也可以和其他一些糖类发生反应，但显现的颜色 不同。当存在含有较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。上 述特定的糖类物质，反应较稳定。该法特点：灵敏度高，测定量少，快 速方便。三、材料、仪器及试剂1. 材料：植物种子、白菜叶、柑桔2. 仪器：分光光度计；恒温水箱；20ml具塞刻度试管(3支)漏斗；100ml容量瓶；刻度

3、试管；试管架；剪刀；研钵3. 试剂(1) 200卩g/ml标准葡萄糖：AR级葡萄糖100mg，蒸馏水溶解，定容至 500ml。(2) 蒽酮试剂：1g蒽酮，用乙酸乙酯溶解，定容至 50ml，棕色瓶避光 处贮藏；(3) 浓硫酸四、实验方法1. 葡萄糖标准曲线的制作取6支20ml具寒试管，编号，按下表数据配制一系列不同浓度的标 准葡萄糖溶液。在每管中均加入 0.5ml蒽酮试剂，再缓慢地加入 5ml浓 H2SO4，摇匀后，打开试管塞，置沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却至室温，在620nm波长下比色，测各管溶液的光密度值( OD)，以标准葡 萄糖含量为横坐标，光密度值为纵坐标，作出标准曲线。管号1 1 1

4、2 1I 3 |I 4 |1 5 |1 6 |标准葡萄糖原液(ml)(200 卩 g/ml)00.20.40.60.81.0蒸馏水I2.0 11 1.8 |I 1.6 |I1.4 11 1.2 |1 1.0 1葡萄糖含量(yg11 0 14080| 120 | 160 | 200 |2. 样品中可溶性糖的提取称取1克白菜叶，剪碎，置于研钵中，加入少量蒸馏水，研磨成匀 浆，然后转入20ml刻度试管中，用10ml蒸馏水分次洗涤研钵，洗液一 并转入刻度试管中。置沸水浴中加盖煮沸10分钟，冷却后过滤，滤液收集于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。3. 糖含量测定用移液管吸收1ml提取液于

5、20ml具塞刻度试管中，加1ml水和0.5ml 蒽酮试剂。再缓慢加入 5ml浓H2SO4 (注意：浓硫酸遇水会产生大量的 热！)，盖上试管塞后，轻轻摇匀，再置沸水浴中10分钟(比色空白用2ml蒸馏水与0.5ml蒽酮试剂混合，并一同于沸水浴保温10分钟)。冷 却至室温后，在波长 620nm 下比色，记录光密度值。查标准曲线上得知 对应的葡萄糖含量（ug。五、结果计算样品含糖量（g/100g鲜重）=查表所得糖含量（稀释倍数X100/ 样品重（g）X106六、注意事项（ 1 ）加浓 H2SO4 时应缓慢加入，以免产生大量热量而爆沸，灼伤皮肤， 如出现上述情况，应迅速用自来水冲洗。（ 2）水浴加热时应

6、打开试管塞。实验（三） 维生素 C 的定量测定（ 2,6-二氯酚靛酚滴定法）一、目的要求 :（ 1）学习并掌握定量测定维生素 C 的原理和方法。（ 2）了解蔬菜、水果中维生素 C 含量情况。二、实验原理 :维生素 C 是人类营养中最重要的维生素之一，缺少它时会产生坏血病，因此又称为抗坏血酸（ascorbic acid）。它对物质代谢的调节具有重要的作用。 近年来，发现它还有增强机体对肿瘤的抵抗力， 并具有化学致癌物的阻断作用。维生素 C 是具有 L 系糖型的不饱和多羟基物，属于水溶性维生素。它分布很广，植物的绿色部分 及许多水果（如橘子、苹果、草莓、山楂等） 、蔬菜（黄瓜、洋白菜、西红柿等）中

7、的含量更为丰富。维生素 c 具有很强的还原性 。它可分为还原性和脱氢型。金属铜和酶（抗坏血酸氧化酶）可以催化 维生素 C 氧化为脱氢型。根据它具有还原性质可测定其金属含量。还原型抗坏血酸能还原染料 2,6-二氯酚靛酚（ DCPIP ），本身则氧化为脱氢型。在酸性溶液中， 2,6- 二氯酚靛酚呈红色，还原后变为无色 。因此，当用此染料滴定含有维生素 C 的酸性溶液时，维生素 C 尚未全部被氧化前，则滴下的染料立即被还原成无色。一旦溶液中的维生素 C 已全部被氧化时，则滴下的染料立即使溶液变成粉红色 。所以，当溶液从无色变成微红色时即表示溶液中的维生素 C 刚刚全 部被氧化， 此时即为滴定终点。

8、如无其它杂质干扰， 样品提取液所还原的标准染料量与样品中所含还原 型抗坏血酸量成正比。本法用于测定还原型抗坏血酸，总抗坏血酸的量常用2,4-二硝基苯肼法和荧光分光光度法测定。OCHOHOHHO 一CCH OH氧化型脱氢抗坏血酸还原型抗坏血酸（蓝色）HOH还原型2 ,6 二氯 酚靛酚（无色）三、试剂和器材：（一）试剂2%草酸溶液：草酸2g溶于100ml蒸馏水中。1%草酸溶液：草酸1g溶于100ml蒸馏水中。标准抗坏血酸溶液（1mg/ml）:准确称取100mg纯抗坏血酸（应为洁白色，如变为黄色则不能用） 溶于1%草酸溶液中，并稀释至100ml，贮于棕色瓶中，冷藏。最好临用前配制。0.1% 2,6-

9、二氯酚靛酚溶液：250mg 2,6-二氯酚靛酚溶于 150ml含有52mg NaHCO 3的热水中，冷却后 加水稀释至250ml，贮于棕色瓶中冷藏（4C）约可保存一周。每次临用时，以标准抗坏血酸溶液标定。（二）材料辣椒、苹果、卷心菜等。（三）器材锥形瓶（100ml）,组织捣碎器，吸量管 （10ml）,漏斗，滤纸，微量滴定管（5ml）,容量瓶（100ml, 250ml）。四、操作方法：1. 提取水洗干净整株新鲜蔬菜或整个新鲜水果，用纱布或吸水纸吸干表面水分。然后称取20g,加入20ml2%草酸，用研钵研磨，四层纱布过滤，滤液备用。纱布可用少量2%草酸洗几次，合并滤液，滤液总体积定容至50ml。2

10、. 标准液滴定准确吸取标准抗坏血酸溶液 1ml置100ml锥形瓶中，加9ml 1%草酸，用微量滴定管以 0.1% 2,6-二 氯酚靛酚溶液滴定至淡红色， 并保持15s不褪色，即达终点。由所用染料的体积计算出 1ml染料相当于 多少毫克抗坏血酸（取 10ml 1%草酸作空白对照，按以上方法滴定） 。3. 样品滴定准确吸取滤液两份， 每份10ml,分别放入2个锥形瓶内，滴定方法同前。另取10ml 1%草酸作空白 对照滴定。4. 计算维生素C含量（mg/100g样品）= “必）C T 100D W式中：Va为滴定样品所耗用的染料的平均毫升数；Vb为滴定空白对照所耗用的染料的平均毫升数；C为样品提取液

11、的总毫升数；D为滴定时所取的样品提取液毫升数；T为1ml染料能氧化抗坏血酸毫克数（ 由操作二计算出）；W为待测样品的重量（g ）。五、注意事项：1. 某些水果、蔬菜（如橘子、西红柿等）浆状物泡沫太多，可加数滴丁醇或辛醇。2. 整个操作过程要迅速，防止还原型抗坏血酸被氧化。滴定过程一般不超过2min。滴定所用的染料不应小于1ml或多于4ml，如果样品含维生素 C太高或太低时，可酌情增减样液用量或改变提取液稀 释度。3. 本实验必须在酸性条件下进行。在此条件下，干扰物反应进行得很慢。4.2%草酸有抑制抗坏血酸氧化酶的作用，而1%草酸无此作 用。5. 干扰滴定因素有：若提取液中色素很多时，滴定不易看

12、出颜色变化，可用白陶土脱色，或加1ml氯仿，到达终点时，氯仿层呈现淡红色。Fe2+可还原二氯酚靛酚。 对含有大量Fe2+的样品可用8%乙酸溶液代替草酸溶液提取 ，此时Fe2 +不 会很快与染料起作用。样品中可能有其它杂质还原二氯酚靛酚，但反应速度均较抗坏血酸慢，因而滴定开始时，染料要 迅速加入，而后尽可能一点一点地加入，并要不断地摇动三角瓶直至呈粉红色，于15s内不消退为终点。6. 提取的浆状物如不易过滤，亦可离心，留取上清液进行滴定。六、思考题：1 .为了测得准确的维生素 C含量，实验过程中都应注意哪些操作步骤？为什么？2 .试简述维生素 C的生理意义。实验（四）蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G

13、 250法）一、目的1. 学习一种蛋白质染色测定的方法2. 掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法二、原理蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。 涉及的指示剂有甲基橙、 考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。 目前广泛 使用的染料是考马斯亮蓝。考马斯亮蓝 G-250在酸性溶液中为棕红色， 当它与蛋白质通过范德华键结合后， 变为蓝色，且在蛋 白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。25分钟即呈最大光吸收，至少稳定 1小时。在0.011.0 mg蛋白质/ml范围内均可。该法操作简便迅速，消耗样品量少，但

14、不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英怀测定。三、器材与试剂1. 仪器(1)分析天平；(2)具塞刻度试管 10ml X 8; (3)吸管 0.1ml x I, lml x Z , 5ml x I ； (4)研钵；(5) 漏斗；(6)离心管10ml; (7)容量瓶10ml; ( 8)离心机；(9) 721型分光光度计2. 试剂(1) 标准蛋白质溶液 称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成

15、100 pg/ ml的 原液。(2) 考马斯亮蓝G 250蛋白试剂 称取100mg考马斯亮蓝G 250,溶于50ml 90 %乙醇中，加入85% (m/v)的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml。此溶液在常温下可放置一个月。3. 材料植物种子四、操作步骤1.标准曲线的制作取6支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。操作项目管号123456标准蛋白质溶液(ml)00.20.40. 60.81.0蒸馏水(ml)1.00.80.60.40.20G-250 试剂(ml)各5蛋白质含量(卩g)020406080100盖上塞子，摇匀。放置 2min后在595 nm波长下比色测定(比色应在I h内完成

16、)。以牛血清白蛋白含量(卩g)为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。2. 样品中蛋白质含量的测定(1) 准确称取约200mg绿豆芽下胚轴，放入研钵中，加入5ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆， 离心(4000r / min , 10min ),将上清液倒入10ml容量瓶，再向残渣中加入 2ml蒸馏水，悬浮后再离心 10min，合并 上清液，定至刻度。(2) 另取1支具塞试管，准确加入 0.l ml样品提取液，再加入 0.9 ml蒸馏水，5ml考马斯亮蓝G 250 试剂，充分混合，放置 2min 后，以标准曲线 1号试管做参比，在 595 nm 波长下比色，记录吸光度。3. 结果处理根据所测样品提取

17、液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（卩g）,按下式计算：样品蛋白质含量（卩g/g鲜重）=（查得的蛋白质含量（ 卩g）x提取液总体积（ml） /（样品鲜 重（g）x测定时取用提取液的体积（ml）六、注意事项1. 由于染料本身的两种颜色形式的光谱有重叠，试剂背景值会因与蛋白质结合的染料增加而不断降低， 因而当蛋白质浓度较大时，标准曲线稍有弯曲，但直线弯曲程度很轻，不致影响测定2. 测定工作应在蛋白质染料混合后 2min 开始，力争 1hr 内完成，否则会因蛋白质一染料复合物发生凝 集沉淀而影响测定结果。3. 样品中的Tris、乙酸、2-巯基乙醇、EDTA等物质对实验结果有少量颜色干扰，可

18、以在做标准曲线时 可以用缓冲液代替蒸馏水，就可以将干扰扣除，（五）有机酸含量的测定一、实验目的1. 掌握强碱滴定弱酸的基本原理和指示剂的选择；2. 学会有机酸含量的测定方法；3. 进一步熟练滴定操作技术。二、实验原理大多数有机酸是弱酸，如果某有机酸易溶于水，解离常数10-7 ，用标准碱可以直接测其含量，反应产物为强碱弱酸盐。 本实验我们选用的有机酸是苯甲酸，其解离常数Ka为6.2 X 10-5 ,若CspKa10-8采用指示剂判断终点时 , 直接准确滴定某一元弱酸的可行性判据。Csp 是计量点时体积计算被滴定物质的分析浓度。 如果我们配制的苯甲酸浓度不是特别小， 就可以用标准碱溶液直接测定其含量， 计量点时 反应产物为强碱弱酸盐， 滴定突跃在碱性范围内， 可以选用酚酞指示剂， 滴定溶液由无色变为微红色即 为终点。根据 NaOH标准溶液的浓度c和消耗的体积 V计算该有机酸的浓度：三、主要试剂和仪器0.1 mol L-1NaO