培养基灭菌的目的和要求

1、2021/2/71 2021/2/72 灭菌的方法 化学法 化学药品灭菌法:甲醛、苯酚等 物理法 干热灭菌法 湿热灭菌法（生物工程工业常用方法） 射线灭菌法 2021/2/73 1. 湿热灭菌原理和影响灭菌的因素 湿热灭菌的原理湿热灭菌的原理:主要是因高温使微生物体内的一 些重要蛋白质,如酶等,发生凝固、变性,从而导 致微生物无法生存而死亡。 致死温度与致死时间致死温度与致死时间:杀死微生物的极限温度称 为致死温度。在致死温度下,杀死全部微生物所 需的时间称为致死时间;在致死温度以上,温度愈 高,致死时间愈短。 2021/2/74 微生物的热阻和相对热阻微生物的热阻和相对热阻:前者是指微生物在

2、 某一特定条件（主要是温度和加热方式） 下的致死时间。后者是指某一微生物在某 条件下的致死时间与另一微生物在相同条 件下的致死时间的比值。 2021/2/75 各种微生物对湿热的相对热阻各种微生物对湿热的相对热阻 微生物相对热阻 营养细胞和酵母1.0 细菌芽孢3106 霉菌孢子210 病毒和噬菌体15 2021/2/76 某些微生物的相对热阻 灭菌方式灭菌方式大肠杆菌大肠杆菌霉菌孢子霉菌孢子细菌芽孢细菌芽孢噬菌体或病毒噬菌体或病毒 干热灭菌12-1010001 湿热灭菌12-1031051-5 苯酚11-2110930 甲醛12-102502 紫外线15-1002-55-10 2021/2/7

3、7 湿热灭菌的优点 蒸汽来源容易,操作费用低,本身无毒; 蒸汽有强的穿透力,灭菌易于彻底; 蒸汽有很大的潜热; 操作方便,易管理。 2021/2/78 1.1 湿热灭菌的理论基础 将培养基中的杂菌总数N0杀灭到可以 接受的总数N（10-3）,需要多高的温度、 多长的时间为合理。 灭菌温度和时间的确定取决于: 杂菌孢子的热灭死动力学 反应器的形式和操作方式 培养基中有效成分受热破坏的可接受范围 2021/2/79 微生物的热死灭动力学方程:对数残留定律 微生物营养细胞的均相热死灭动力学符合化学 反应的一级反应动力学,即: N-任一时刻的活细菌浓度,个/L; t-时间,min; K-比热死速率常数

4、,min-1,越小越耐热 Nk dt dN 2021/2/710 细菌孢子的热死灭动力学与营养细胞的有 所不同。它表现为非对数的死亡动力学。 但当温度超过120C时,热阻极强的嗜热脂 肪芽孢杆菌孢子的热杀灭动力学也接近 对数死亡动力学即符合一级反应规律。 2021/2/711 取边界条件取边界条件t0=0,N=N0,对上式积分得对上式积分得 或或 为理论灭菌时间的对数残留规律公式为理论灭菌时间的对数残留规律公式。 00 12.303 lnlg tt NN t KNKN 0 kt t N e N 问题:能不能做到绝对无菌? 2021/2/712 温度对K的影响 微生物的热死灭动力学接近一级反应

5、动力学,它的比热死灭速率常数K与灭 菌温度T的关系可用阿累尼乌斯方程 表征 A-频率因子,min-1 E-活化能,J/mol R-通用气体常数,J/（mol.k） RTE eAK / 2021/2/713 活化能E的大小对K值有重大影响。其它条件 相同时, E越高,K越低,热死速率越慢。 不同菌的孢子的热死灭反应E可能各不相同。 对（4）两边取对数,得 AK RT E lnln 2021/2/714 微生物死亡速度常数K与温度的关系 斜率= -E/R k/min 4.0 3.0 2.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 2.642.622.602.582.562.54 2021/

6、2/715 K是E和T的函数,K的对T的变化率与有关, 对（5）两边对T的导数,得 2 ln TR E dT Kd 2021/2/716 试验表明,细菌孢子热死灭反应的E很高,而某些 有效成分热破坏反应的E较低。 将温度提高到一定程度,会加速细菌孢子的死灭速 度,缩短灭菌时间,由于有效成分的E很低,温度的 提高只能稍微增大其破坏速度,但由于灭菌时间的 显著缩短,有效成分的破坏反而减少 2021/2/717 物质E（J/mol） 维生素B1296232 维生素B1盐酸盐92048 嗜热脂肪芽孢杆菌孢子283257 肉毒梭菌孢子343088 枯草杆菌孢子317984 孢子热死灭和营养成分破坏活化能

7、孢子热死灭和营养成分破坏活化能 2021/2/718 EBS=67000 4.184（J/mol） EVB=22000 4.184 （J/mol） 将灭菌温度从将灭菌温度从105C提高到提高到127 C KVB从从0.02（min-1）提高到）提高到0.06（min -1 ） KBS从从0.12（min-1）提高到）提高到40.0（min -1 ） 绝对温度倒数，1/T（K）10-3 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2021/2/719 嗜热脂肪芽孢杆菌孢子死灭程度为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子死灭程度为N/N0=10-16时时,灭菌温度对灭菌温度对 维生素维生素B1破

8、坏的影响破坏的影响 灭菌温度（C）达到灭菌程度的时间 （min） 维生素B1的损失（%） 10084399.99 1107589 1207.627 1300.85110 1400.1073 1500.0151 2021/2/720 1.2 影响灭菌的因素 培养基成分培养基成分 培养基的物理状态培养基的物理状态 培养基中氢离子浓度培养基中氢离子浓度 培养基中微生物数量培养基中微生物数量 微生物细胞含水量微生物细胞含水量 微生物细胞菌龄微生物细胞菌龄 微生物的耐热性微生物的耐热性 空气排出情况空气排出情况 搅拌搅拌 泡沫泡沫 2021/2/721 1、培养基成分 培养基中脂肪、糖分和蛋白质的含量越

9、 高,微生物的热死亡速率越慢 在热死温度下,脂肪、糖分和蛋白质等有 机物质在微生物细胞外面形成一层薄膜, 它能有效保护微生物细胞抵抗不良环境, 因此需较高的灭菌温度。 另一些物质,如高浓度的盐类,色素等可削 弱其耐热性。 2021/2/722 2、培养基的物理状态 固体培养基的灭菌时间比液体培养基的灭菌 时间长。其原因是液体培养基灭菌时,热的 传递有对流和传导,固体培养基只有传导。 对于含有少量大颗粒及粗纤维的培养基的灭 菌,需提高灭菌温度,且在不影响培养基质量 的条件下,采用粗过滤方法预先处理,以防培 养基结块而造成灭菌的不彻底。 2021/2/723 3、pH 培养基的培养基的pH越低越低

10、,灭菌所需时间越短。灭菌所需时间越短。 2021/2/724 4、培养基的微生物数量: 微生物数量越多,所需灭菌时间越长。 5、微生物细胞含水量 微生物细胞含水量越多,蛋白质的凝固温度越低,越容 易受热凝固而丧失生命活力。 6、微生物细胞菌龄 老龄细胞对不良环境的抵抗力比幼龄细胞强,后者易 被杀死。 7、微生物的耐热性 细菌的营养体、酵母、霉菌的菌丝体对热较为敏感, 放线菌、酵母、霉菌孢子比营养细胞的抗热性强, 细菌芽孢的抗热性最强。 2021/2/725 8、空气排出情况 蒸汽灭菌过程中,温度的控制是通过控制罐内 的蒸汽压力蒸汽压力来实现。压力表显示的压力应与罐 内蒸汽压力相对应,即压力表的

11、压力所对应的 温度应是罐内的实际温度。如果罐内空气排除 不完全,压力表所显示的压力就不单是罐内蒸 汽压力,还包括了空气分压还包括了空气分压,因此,此时罐内的实 际温度就低于压力表显示压力所对应的温度, 以致造成灭菌温度不够而灭菌不彻底。 2021/2/726 9、搅拌: 有助于传质和传热。 10、泡沫 泡沫中的空气形成隔层,使热量难以传递,不 易达到微生物的致死温度,导致灭菌不彻底。 泡沫的形成主要是由于进汽排汽不均衡,如 果在灭菌过程突然减少进汽或加大排汽,则 会出现大量泡沫,对易发泡沫的培养基应加 消泡剂以减少泡沫量。 2021/2/727 2. 连续灭菌流程 连续灭菌优点: （1）提高产

12、量; （2）产品质量较易控制; （3）蒸汽负荷均衡,锅炉利用率高,操作方便; （4）适宜采用自动控制; （5）降低劳动强度。 实际操作: 高温灭菌时间约为1530s,然后根据发酵类型不同 在维持罐维持825min。 2021/2/728 2、连续灭菌流程及设备 即在培养基输 送至发酵罐 的同时进行 加热、保温 和冷却而进 行的灭菌。 2021/2/729 （1 1）连消塔）连消塔- -喷淋冷却连续灭菌喷淋冷却连续灭菌 流程流程 （1）配料预热罐,将配好的料液预热到 6070,以避免灭菌时由于料液与蒸汽温度 相差过大而产生水汽撞击声; （2）连消塔,是使高温蒸汽与料液迅速接触混 合,并使料液的温

13、度很快升高到灭菌温度 （126132）; （3）维持罐,维持料液温度,延长灭菌时间 （4）冷却管,生产上一般采用冷水喷淋冷却, 冷却到4050后,输送到预先已经灭菌过的 罐内。 2021/2/730 培养液连续灭菌流程 2021/2/731 （2 2）喷射加热）喷射加热- -真空冷却流程真空冷却流程 喷射加热器以较高速度自喷嘴喷出,借高速 流体的抽吸作用与蒸汽混合 管道维持器:维持灭菌时间 真空闪急蒸发室:由膨胀阀进入,因真空作 用使水分急骤蒸发而冷却到7080左右, 再进入发酵罐冷却到接种温度。 2021/2/732 优点:加热和冷却在瞬间完成,营养成分 破坏最少,可以采用高温灭菌,把温度 升高到140而不致引起培养基营养成 分的严重破坏。设计得合适的管道维 持器能保证物料先进先出,避免过热。 缺点:受压力影响, 出料泵 2021/2/733 （2 2）喷射加热）喷射加热- -真空冷却流程真空冷却流程 图2-5 加热-真空冷却连续灭菌流程 生培养液 蒸汽 喷射加热器 维持管 膨胀阀 急聚蒸发室 灭菌好的培养液 真空 2021/2/734 （3）板式换热器灭菌流程）板式换热器灭菌流程 采用