人骨髓间充质干细胞对K562细胞增殖和化疗敏感性的影响(1)

1、人骨髓间充质干细胞对 K562 细胞增殖 和化疗敏感性的影响 (1) 作者：林玉梅，卜丽梅，杨少娟，高申，张桂珍 【摘要】本研究比较 K562 细胞与正常人骨髓间充质干 细胞(MSC黏附培养前后细胞增殖、化疗敏感性及 MDR俊 化，以寻找白血病耐药与造血微环境的关系。对悬浮培养和 与MSC黏附培养的K562细胞绘制细胞生长曲线；用流式细 胞术测定细胞周期并观察化学药物对细胞存活率和凋亡的 影响；用RT-PCR技术检测MDR基因表达。结果表明：与悬 浮培养比较，黏附培养K562细胞增殖受抑，G0/G1期细胞比 例增加，S期细胞比例下降，G2/M期细胞比例增加。在柔红 霉素(DNR诱导的凋亡中，黏

2、附培养组K562细胞凋亡受阻。 黏附培养未诱导 K562细胞MDR基因表达，也未使K562/ADM 细胞的MDR1基因表达发生改变。结论：K562细胞与MSC黏 附接触共培养，可导致 K562 细胞生长抑制，并产生化疗耐 药，其机制可能与 MDR优关。 【关键词】骨髓间充质干细胞 InfluenceofHumanMesenchymalStemCellsonCellProlifera tionandChemo-sensitivityofK562Cells AbstractThisstudywasaimedtocompareK562cellprolifera tion， chemo-sensiti

3、vityandalterationofMDR1beforeandaftera dhesiveculturewithMSC， soastoevaluatetherelationshipbetweenchemodrug-resis tanceofleukemiacellsandhemopoieticmicroenvironment. K562cellcultivatedinsuspensionandadhesivelycultivat edwithMSCwerecollectedrespectivelyandcellproliferat ioncurvesweredrawn;thecellcycl

4、ewasdeterminedbyflowc ytometry;theeffectofchemotherapyoncellularviability andapoptosisofK562cellwasinvestigated ， theMDR1geneexpressionwasdeterminedbyRT-PCR.Theresul tsshowedthatK562cellsadhesivelycultivatedwithMSCwer einhibitedandcellsinG0/G1increased， cellsinSphasedecreasedandthoseinG0/G1increased

5、， comparedwiththatcultivatedinprocessofdaunomycin-ind ucingapoptosis， K562cellapoptosisintheadhesiveculturewithMSCwasinhi bited.MDR1geneexpressioninK562cellswasnotinducedo r alteredbyadhesiveisconcludedthatbyco-cultureofce ll-cellcontactwithMSC， growthsuppressionandinductionofchemo-resistanceofK5 62

6、cellstakemechanism however seemsnotrelevantwithMDR1. Keywordsmesenchymalstemcell;K562;drugresistance;apo ptosis;MDR1 耐药是根治白血病的最主要障碍，其发生机制及逆转的 研究一直是白血病的研究热点，以往人们主要集中在对单个 白血病细胞本身的分子生物学改变的研究，并取得了显著成 果，但在体内仍难克服耐药的发生。近年来，随着对骨髓造 血微环境（hematopoieticmicroenviroment , HM 的认识不 断加深，发现骨髓基质细胞在白血病细胞恶性克隆的增殖、 分化和凋亡中

7、起重要作用 1。而骨髓基质细胞的前体细胞 骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcell , MSC是骨髓造 血微环境中基质细胞的主要来源，对正常造血也具有调控作 用，但对白血病细胞的调节作用尚不清楚。本研究以人慢性 髓细胞白血病K562细胞株为靶细胞，与正常人MSC共培养， 观察其对 K562 细胞增殖和化疗敏感性的影响，以探讨 MSC 与白血病耐药的关系。 材料和方法 试剂 柔红霉素、阿霉素（DNR ADM，均购自 Pharmacia公 司；DMEM-LG RPMI1640培养液购自 Gibco公司；FBS购自 Hyclone公司；RT-PCR试剂盒、蛋白酶 K、RNA酶及琼脂糖

8、 均购自Promega公司；PCR引物由上海生物工程公司合成。 TRIZOL 购 自 Invitrogen 公 司 ； Percoll ， 购 自 AmershamBiosciences 公 司 。 碘 化 丙 锭 （ PI ） 购 自 美 国 Coulter-Immunotech 公司。 人骨髓MSC的分离和培养 骨髓MSC的分离、纯化和扩增按 Pittenger 等2报 道的方法进行。取肝素抗凝健康自愿者骨髓液5ml ，用 Percoll 分离液分离单个核细胞（ MNC,以x 105/cm2细胞 接种于75cm2的Nunc培养瓶内，培养体系为含10%FBS的 DMEM-LG置于37C、5%

9、CO2饱和湿度的孵箱中进行原代培 养。培养 48 小时后换液，除去非贴壁细胞，以后每 3 天换 液 1 次。待覆盖培养瓶底面积的 80%以上时加入 %胰蛋白酶消 化传代，按 5x 103/cm2 传代培养，每 3 天换液 1 次。 2-4 代 细胞用于实验。 人骨髓MSC表面标志的鉴定 将胰蛋白酶消化收获的 MSC以2X 105个细胞分别与抗 CD29、 CD34、 CD44、 CD45、 CD73、 CD105、 CD166、 HLA-A/B/C 和HLA-DR（ PharMingen公司）室温反应 30分钟，经PBS洗 涤 2 次后与标记 FITC 的二抗避光反应 15 分钟，细胞洗涤后

10、悬浮于PBS中以备流式细胞仪分析。 K562细胞与MSC黏附培养 K562/ADM 细胞株，购于中国医学科学院血液学研究所， 在ADM g/ml的含10%FCS勺RPMI1640培养液中稳定生长。 试验前2周换用无ADM勺培养液培养。K562细胞株由本医院 中心研究室提供，培养体系同上。已传代的MSC以1X 104/cm2 接种于75cm2的培养瓶中，待细胞贴壁呈融合状态时在其上 分别直接加入对数生长期的K562和K562/ADM细胞(1 X 105/ml )。 48 小时后先去除未黏附的白血病细胞，根据文献 报道方法 3吹打收集黏附生长的白血病细胞。 细胞生长曲线测定 悬浮培养组 取生长状态良好的 K562细胞接种于24孔培养板，每孔 1ml，含1X 104细胞，每3天换液1次。 黏附培养组 已传代的MSC接种于24孔培养板，每孔1ml，含1 X 104 细胞，待MSC完全贴壁融合后，在其上直接加入悬浮生长的 K562细胞1 X 104,体积同上。 每组均 3 天换液 1 次。在第 1 至 8 天分别收集各组 K562 细胞，台盼蓝染色记数活细胞数，每组有 3 个平行孔，取均 值。最后以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标绘制生长曲 线。 细胞周期的流式细胞术