第五章生化药物与基因工程药物分析

1、第五章生化药物与基因工程药物分 析 第第 五五 章章 生化药物和基因工程药物生化药物和基因工程药物 的分析的分析 第五章生化药物与基因工程药物分 析 1 1、 了解生化药物、基因工程药物的定义、了解生化药物、基因工程药物的定义、 种类。种类。 2 2、熟悉质量检验的基本程序与方法。、熟悉质量检验的基本程序与方法。 3 3、掌握生化药物、基因工程药物的特点、掌握生化药物、基因工程药物的特点 及常用的化学定量分析方法。及常用的化学定量分析方法。 本章学习要点本章学习要点 第五章生化药物与基因工程药物分 析 人类用于预防、治疗和诊人类用于预防、治疗和诊 断疾病的三大主要药物断疾病的三大主要药物 第一

2、节第一节 概概 述述 化学药物化学药物 生物药物生物药物 中中 药药 第五章生化药物与基因工程药物分 析 生物药物的分类：生物药物的分类： 生化药物生化药物 生物技术药物生物技术药物 生物制品生物制品 从生物体分离纯化制得的生化基从生物体分离纯化制得的生化基 本物质，以及用化学合成、微生本物质，以及用化学合成、微生 物合成或现代生物技术制得的一物合成或现代生物技术制得的一 类药物。类药物。 利用生物体或其组成部分利用生物体或其组成部分 发展产品的技术体系即现发展产品的技术体系即现 代生物技术研制的药物称代生物技术研制的药物称 之。之。 应用普通的或基因工程、应用普通的或基因工程、 细胞工程、蛋

3、白质工程、细胞工程、蛋白质工程、 发酵工程等生物技术获得发酵工程等生物技术获得 的微生物、细胞及各种动的微生物、细胞及各种动 物和人源的组织和体液等物和人源的组织和体液等 生物材料制备，用于人类生物材料制备，用于人类 疾病预防、治疗和诊断的疾病预防、治疗和诊断的 药品。药品。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 一、生化药物和基因工程药物的定义一、生化药物和基因工程药物的定义 1 1、生化药物的定义、生化药物的定义 从动物、植物及微生物提取的，也可用从动物、植物及微生物提取的，也可用 生物化学半合成或用现代生物技术制得生物化学半合成或用现代生物技术制得 的生命基本物质及其衍生物、降解物以及的生

4、命基本物质及其衍生物、降解物以及 大分子的结构修饰物等。大分子的结构修饰物等。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 2 2、基因工程药物的定义、基因工程药物的定义 先确定对某种疾病具有预防和治疗作用先确定对某种疾病具有预防和治疗作用 的蛋白质，然后将控制该蛋白质合成过程的蛋白质，然后将控制该蛋白质合成过程 的基因进行分离、纯化或人工合成，利用的基因进行分离、纯化或人工合成，利用 重组重组DNADNA技术加以改造，最后将该基因技术加以改造，最后将该基因 导入可以大量生产的受体细胞中不断繁殖导入可以大量生产的受体细胞中不断繁殖 或表达，并能进行大规模生产具有预防和或表达，并能进行大规模生产具有预防

5、和 治疗这种疾病的蛋白质，通过这种方法生治疗这种疾病的蛋白质，通过这种方法生 产的药物称之。产的药物称之。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 1 1、氨基酸、多肽与蛋白质类药物、氨基酸、多肽与蛋白质类药物 二、生化药物和基因工程药物的种类二、生化药物和基因工程药物的种类 （一）生化药物的种类（一）生化药物的种类 （1 1）氨基酸及其衍生物：）氨基酸及其衍生物： 单氨基酸：亮氨酸、半胱氨酸、丝氨单氨基酸：亮氨酸、半胱氨酸、丝氨 酸、色氨酸、赖氨酸、甘氨酸等。酸、色氨酸、赖氨酸、甘氨酸等。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 氨基酸衍生物：氨基酸衍生物：N-N-乙酰乙酰-L-L-半胱氨酸、半胱氨

6、酸、 S- S-氨基甲酰半胱氨酸、氨基甲酰半胱氨酸、S- S-甲基半胱氨酸、甲基半胱氨酸、 谷胺酰胺、谷胺酰胺、S- S-羟色氨酸。羟色氨酸。 复合氨基酸注射液：复合氨基酸注射液：3S3S、6S6S、9S9S、 11S11S、13S13S、14S14S、15S15S、17S17S、18S18S复合氨复合氨 基酸注射液。（基酸注射液。（S S代表氨基酸的种类）代表氨基酸的种类） 第五章生化药物与基因工程药物分 析 （2 2）多肽类药物）多肽类药物 ： 垂体多肽：促肾上腺皮质激素、促垂体多肽：促肾上腺皮质激素、促 胃液素、加压素。胃液素、加压素。 消化道多肽：促胰液素（胰泌素）、消化道多肽：促胰液

7、素（胰泌素）、 胃泌素、抑胃肽。胃泌素、抑胃肽。 下丘脑多肽：促甲状腺素释放激素、下丘脑多肽：促甲状腺素释放激素、 促性腺激素释放激素、生长激素释放激促性腺激素释放激素、生长激素释放激 素。素。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 脑多肽：由人及动物脑和脑脊液中脑多肽：由人及动物脑和脑脊液中 分离出来的多肽、蛋氨酸脑啡肽和亮氨分离出来的多肽、蛋氨酸脑啡肽和亮氨 酸脑啡肽等。酸脑啡肽等。 激肽类：血管紧张肽激肽类：血管紧张肽I I、II II、IIIIII等活性等活性 肽。肽。 其它肽类：谷脱甘肽、降钙素、睡其它肽类：谷脱甘肽、降钙素、睡 眠肽、松果肽、血活素（分子量为眠肽、松果肽、血活素（分子

8、量为 30003000的肽为主成分的肽为主成分) )。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 （3 3）蛋白类药物）蛋白类药物 猪或牛的纤维蛋白原、纤维蛋白、猪或牛的纤维蛋白原、纤维蛋白、 胃膜素（糖蛋白）、水蛭素、肝细胞生胃膜素（糖蛋白）、水蛭素、肝细胞生 长因子；属蛋白质类激素尚有生长素、长因子；属蛋白质类激素尚有生长素、 催 乳 素 、 促 甲 状 腺 素 、 促 泡 激 素催 乳 素 、 促 甲 状 腺 素 、 促 泡 激 素 （FSHFSH）、促黄体激素（）、促黄体激素（LHLH）；植物来）；植物来 源的蛋白类药物有植物凝集素、天花粉源的蛋白类药物有植物凝集素、天花粉 蛋白、蓖麻和相思

9、豆毒蛋白等。蛋白、蓖麻和相思豆毒蛋白等。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 2 2、酶类药物、酶类药物 （1 1）助消化酶类：胃蛋白酶、胰蛋白）助消化酶类：胃蛋白酶、胰蛋白 酶、胰淀粉酶、麦芽淀粉酶。酶、胰淀粉酶、麦芽淀粉酶。 （2 2）蛋白水解酶类：溶菌酶、胰）蛋白水解酶类：溶菌酶、胰DNADNA 酶、木瓜蛋白酶、胶原蛋白酶。酶、木瓜蛋白酶、胶原蛋白酶。 （3 3）凝血酶及抗栓酶：凝血酶（猪、）凝血酶及抗栓酶：凝血酶（猪、 牛血）、纤溶酶、尿激酶、蛇毒凝血酶。牛血）、纤溶酶、尿激酶、蛇毒凝血酶。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 （4 4）抗肿瘤酶类：）抗肿瘤酶类：L- L-天门冬酰胺酶

10、、甲天门冬酰胺酶、甲 硫氨酸酶、组氨酸酶、谷氨酸胺酶。硫氨酸酶、组氨酸酶、谷氨酸胺酶。 （5 5）其它酶类：细胞色素）其它酶类：细胞色素C C、超氧化物、超氧化物 歧化酶（歧化酶（SODSOD）、）、RNARNA酶、青霉素酶。酶、青霉素酶。 （ 6 6 ） 辅 酶 ：） 辅 酶 ： C o AC o A 、 黄 素 单 核 苷 酸、 黄 素 单 核 苷 酸 （ F M NF M N ） 、 黄 素 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸） 、 黄 素 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸 （FADFAD）。）。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 3 3、多糖类药物、多糖类药物 （1 1）肝素、硫酸软骨素）肝素、硫

11、酸软骨素A A和和C C、硫酸皮、硫酸皮 肤素（硫酸软骨素肤素（硫酸软骨素B B）、硫酸角质素、透）、硫酸角质素、透 明质酸等。明质酸等。 （2 2）类肝素（酸性粘多糖）、鹿茸多糖、）类肝素（酸性粘多糖）、鹿茸多糖、 壳聚多糖、右旋糖苷、灵芝多糖、猪苓壳聚多糖、右旋糖苷、灵芝多糖、猪苓 多糖、人参多糖、黄芪多糖等。多糖、人参多糖、黄芪多糖等。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 4 4、脂质类药物、脂质类药物 卵磷脂、脑磷脂、胆固醇、麦角固卵磷脂、脑磷脂、胆固醇、麦角固 醇、醇、B B谷固醇、胆汁酸（胆酸与甘氨酸或谷固醇、胆汁酸（胆酸与甘氨酸或 牛黄酸的结合物）、鹅脱氧胆酸、胆红牛黄酸的结合物

12、）、鹅脱氧胆酸、胆红 素、原叶琳、血叶琳、亚油酸、花生四素、原叶琳、血叶琳、亚油酸、花生四 烯酸、五烯酸、五- -六烯酸、前列腺素系列（六烯酸、前列腺素系列（PGE1PGE1、 PGE2PGE2、PGE2aPGE2a和和PG12PG12）。）。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 5 5、核酸类药物、核酸类药物 RNA RNA（包括（包括iRNA-iRNA-免疫核糖核酸）、免疫核糖核酸）、 DNADNA（脱氧核糖核酸）、聚肌苷酸、巯（脱氧核糖核酸）、聚肌苷酸、巯 基聚胞苷酸、基聚胞苷酸、cAMPcAMP、AMPAMP、肌苷。、肌苷。 此外，有核酪制剂，此外，有核酪制剂，6-6-巯基嘌呤、巯基嘌

13、呤、 6-6-硫代嘌呤、硫代嘌呤、5-5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、阿糖胞苷、5-5- 碘苷和无环鸟苷等。碘苷和无环鸟苷等。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 二、基因工程药物的种类二、基因工程药物的种类 1 1、激素类及神经递质类药物、激素类及神经递质类药物 （1 1）人生长激素释放抑制因子）人生长激素释放抑制因子 （2 2）人胰岛素）人胰岛素 （3 3）人生长激素）人生长激素 第五章生化药物与基因工程药物分 析 2 2、细胞因子类药物、细胞因子类药物 （1 1）人干扰素）人干扰素 （2 2）人白细胞介素）人白细胞介素 （3 3）集落刺激因子）集落刺激因子 （4 4）促红细胞生长素）促

14、红细胞生长素 第五章生化药物与基因工程药物分 析 3 3、酶类及凝血因子类药物、酶类及凝血因子类药物 单克隆抗体、疫苗、基因治疗药物、单克隆抗体、疫苗、基因治疗药物、 白介素、生长因子、反义药物、肿瘤坏白介素、生长因子、反义药物、肿瘤坏 死因子等。死因子等。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 1 1、具有一定的生物活性或生理功能，、具有一定的生物活性或生理功能， 能够参与、影响和调控人体代谢和生能够参与、影响和调控人体代谢和生 理功能，对于某些疾病的治疗具有针理功能，对于某些疾病的治疗具有针 对性强、毒副作用小、易为人体所吸对性强、毒副作用小、易为人体所吸 收等特点。收等特点。 三、生化药物

15、和基因工程药物的特点三、生化药物和基因工程药物的特点 第五章生化药物与基因工程药物分 析 2 2、分子量不是定值、分子量不是定值 除氨基酸、核苷酸、辅酶及甾体激除氨基酸、核苷酸、辅酶及甾体激 素等属化学结构明确的小分子化合物外，素等属化学结构明确的小分子化合物外， 大部分为大分子物质，其分子量一般几大部分为大分子物质，其分子量一般几 千至几十万。对大分子的药物而言，即千至几十万。对大分子的药物而言，即 使组分相同，往往由于分子量不同而产使组分相同，往往由于分子量不同而产 生不同的生理活性。生不同的生理活性。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 3 3、结构确证难、结构确证难 在此类药物中，由于

16、有效结构或分子在此类药物中，由于有效结构或分子 量不确定，其结构的确证很难沿用元素分量不确定，其结构的确证很难沿用元素分 析、析、IRIR、UVUV、NMRNMR、MSMS等方法加以证实，等方法加以证实， 往往还要用生化法往往还要用生化法 如氨基酸序列等法加如氨基酸序列等法加 以证实。以证实。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 4 4、全过程的质量控制、全过程的质量控制 此类药物对热、酸、碱、重金属以此类药物对热、酸、碱、重金属以 及及pHpH较敏感，需对原材料、生产过程较敏感，需对原材料、生产过程 和最终产品进行质量控制。和最终产品进行质量控制。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 5 5

17、、生物活性检查、生物活性检查 在制备多肽或蛋白质类药物时，有在制备多肽或蛋白质类药物时，有 时因工艺条件的变化，导致蛋白质失活。时因工艺条件的变化，导致蛋白质失活。 因此，除了用通常采用的理化法检验外：因此，除了用通常采用的理化法检验外： 尚需用生物检定法进行检定，以证实药尚需用生物检定法进行检定，以证实药 物的生物活性。物的生物活性。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 6 6、安全性检查、安全性检查 由于此类药物性质特殊，生产工艺由于此类药物性质特殊，生产工艺 复杂，易引入特殊杂质和污染物，故常复杂，易引入特殊杂质和污染物，故常 需做安全性检查。需做安全性检查。 第五章生化药物与基因工程药

18、物分 析 7 7、效价测定、效价测定 对酶类药物需进行效价测定或酶活对酶类药物需进行效价测定或酶活 力测定，以表明其有效成分含量的高力测定，以表明其有效成分含量的高 低。低。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 第二节第二节 质量检验的基本程序与方法质量检验的基本程序与方法 一、鉴别试验一、鉴别试验 （一）理化鉴别法（一）理化鉴别法 利用化学法、物理法及生物学利用化学法、物理法及生物学 方法来确证生化药物的真伪。用标准品或方法来确证生化药物的真伪。用标准品或 对照品在同一条件下进行对照试验。对照品在同一条件下进行对照试验。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 1 1、化学反应法、化学反应法 通

19、常利用药物与某试剂在一定通常利用药物与某试剂在一定 条件下反应，生成有颜色的产物或沉淀条件下反应，生成有颜色的产物或沉淀 进行鉴别。例如，溶菌酶的鉴别采用呈进行鉴别。例如，溶菌酶的鉴别采用呈 色法；胃蛋白酶的鉴别采用沉淀法。色法；胃蛋白酶的鉴别采用沉淀法。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 2、HPLC法法 高效液相色谱法高效液相色谱法: : 见见 后后 第五章生化药物与基因工程药物分 析 3 3、UVUV法法 三磷酸腺苷二钠的分子中具有三磷酸腺苷二钠的分子中具有 共轭系统，能吸收紫外光。本品的共轭系统，能吸收紫外光。本品的 0.01mol0.01molL L盐酸水溶液（盐酸水溶液（20g2

20、0gmlml），）， 在（在（2572571 1）nmnm的波长处有最大吸收。的波长处有最大吸收。 A250nmA250nmA260nmA260nm的值应为的值应为0.170.170.270.27。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 （二）生化鉴别法（二）生化鉴别法 1 1、酶法：尿激酶是专属性较强的蛋白、酶法：尿激酶是专属性较强的蛋白 水解酶，根据尿激酶能激活牛纤维蛋白水解酶，根据尿激酶能激活牛纤维蛋白 溶酶原，而具有相同作用的链激酶不能溶酶原，而具有相同作用的链激酶不能 激活牛纤维蛋白溶酶原而加以区别，并激活牛纤维蛋白溶酶原而加以区别，并 用直接观察溶解纤维蛋白作用的气泡上用直接观察溶解

21、纤维蛋白作用的气泡上 升法作为判断指标。升法作为判断指标。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 2 2、电泳法、电泳法 肝素的鉴别采用糖凝胶电泳法：肝素肝素的鉴别采用糖凝胶电泳法：肝素 是由是由D-D-硫酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子硫酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子 间组成的酸性粘多糖，其水溶液带强负电间组成的酸性粘多糖，其水溶液带强负电 荷，于琼脂凝胶板上，在电场作用下，向荷，于琼脂凝胶板上，在电场作用下，向 正极方向移动，与肝素国家标准品对照，正极方向移动，与肝素国家标准品对照， 其移动位置应相一致。其移动位置应相一致。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 3 3、样品脱盐后等电点聚焦法测定、

22、样品脱盐后等电点聚焦法测定 测定药物的等电点（为出现多测定药物的等电点（为出现多 条区带多个等电点），同批次同一产品条区带多个等电点），同批次同一产品 的等电点应相同，表明其工艺稳定。的等电点应相同，表明其工艺稳定。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 （三）生物鉴别法（三）生物鉴别法 利用生物体进行试验来鉴别药物。利用生物体进行试验来鉴别药物。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 二、杂质检查二、杂质检查 （一）一般杂质检查（一）一般杂质检查 检查项目包括氯化物、硫酸盐、检查项目包括氯化物、硫酸盐、 磷酸盐、铵盐、铁盐、重金属、酸度、磷酸盐、铵盐、铁盐、重金属、酸度、 溶液的澄清度或溶液的颜

23、色、水分及干溶液的澄清度或溶液的颜色、水分及干 燥失重、炽灼残渣等。燥失重、炽灼残渣等。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 （二）特殊杂质检查（二）特殊杂质检查 许多药物是从生物组织中提取许多药物是从生物组织中提取 或用微生物发酵法制得，药物中易残存或用微生物发酵法制得，药物中易残存 一些杂质或其他成分。一些杂质或其他成分。 1 1、原料药的纯度分析、原料药的纯度分析 2 2、生产过程中杂质检查、生产过程中杂质检查 第五章生化药物与基因工程药物分 析 三、安全性检查三、安全性检查 （一）热原检查法（家兔、（一）热原检查法（家兔、鲎鲎试剂）试剂） （二）异常毒性试验（二）异常毒性试验 ：用一定

24、剂量的药：用一定剂量的药 物按指定的操作方法和给药途径给予规物按指定的操作方法和给药途径给予规 定体重的某种试验动物，观察其急性毒定体重的某种试验动物，观察其急性毒 性反应。反应的判断以试验动物死亡与性反应。反应的判断以试验动物死亡与 否为终点。否为终点。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 （三）过敏试验（检查异性蛋白）（三）过敏试验（检查异性蛋白） 药物中若夹杂有异性蛋白，在临床药物中若夹杂有异性蛋白，在临床 使用时易引起病人多种过敏反应，轻者使用时易引起病人多种过敏反应，轻者 皮肤出现红斑或丘疹，严重者可出现窒皮肤出现红斑或丘疹，严重者可出现窒 息、发绀、血管神经性水肿、血压下降，息、发

25、绀、血管神经性水肿、血压下降， 甚至休克和死亡。甚至休克和死亡。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 （四）降压物质检查法（四）降压物质检查法 降压物质是指某些药物中含有的能导降压物质是指某些药物中含有的能导 致血压降低的杂质，包括组胺、类组胺或致血压降低的杂质，包括组胺、类组胺或 其他导致血压降低的物质。其他导致血压降低的物质。 来源：用动物脏器或组织为原料制备生化来源：用动物脏器或组织为原料制备生化 药物，正常组织内存在的组胺及部分氨基药物，正常组织内存在的组胺及部分氨基 酸脱羧形成的组胺、酪胺等物质。酸脱羧形成的组胺、酪胺等物质。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 （五）无菌检查法五）

26、无菌检查法 （检查活菌）（检查活菌） 由于许多药物是在无菌条件下制备由于许多药物是在无菌条件下制备 的，且不能高温灭菌。因此，无菌检查的，且不能高温灭菌。因此，无菌检查 就更有必要。中国药典中几乎所有的注就更有必要。中国药典中几乎所有的注 射用药如注射用尿激酶等，均做无菌检射用药如注射用尿激酶等，均做无菌检 查。查。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 1 1、无菌检查的基本步骤：、无菌检查的基本步骤： 培养基的制备，为细菌生长、繁殖提培养基的制备，为细菌生长、繁殖提 供所必需的营养物质供所必需的营养物质碳源、氮源、维生碳源、氮源、维生 素、矿物质等。素、矿物质等。 选择对照用菌液，供对照试验

27、用。选择对照用菌液，供对照试验用。 具体检查，如接种、培养等操作。具体检查，如接种、培养等操作。 结果判断，得出阴性或阳性的结论。结果判断，得出阴性或阳性的结论。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 2 2、注意事项：、注意事项： 无菌检查的全部过程应严格遵守无菌操无菌检查的全部过程应严格遵守无菌操 作法，包括对操作环境、试验材料及用具作法，包括对操作环境、试验材料及用具 酶灭菌等，防止微生物污染。酶灭菌等，防止微生物污染。 应避免在有抑菌条件下操作。应避免在有抑菌条件下操作。 从事无菌操作人员应具备微生物学的基从事无菌操作人员应具备微生物学的基 础知识及一定工作经验，否则要经过无菌础知识及一

28、定工作经验，否则要经过无菌 技能的培训，方能从事此工作。技能的培训，方能从事此工作。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 （六）基因工程药物中可能杂质与污染（六）基因工程药物中可能杂质与污染 物检查物检查 可能杂质：残留可能杂质：残留DNADNA、宿主细胞蛋白质、宿主细胞蛋白质、 内毒素等；内毒素等； 主要污染物：微生物、热原、病毒等。主要污染物：微生物、热原、病毒等。 主要检查项目：外源性主要检查项目：外源性DNADNA、其他外源、其他外源 性杂质测定性杂质测定 第五章生化药物与基因工程药物分 析 （七）致突变试验（七）致突变试验 包括：微生物回复突变试验、哺乳动物包括：微生物回复突变试验、

29、哺乳动物 培养细胞染色体畸变试验、啮齿动物微培养细胞染色体畸变试验、啮齿动物微 核试验等。核试验等。 （八）生殖毒性试验（八）生殖毒性试验 包括：一般生殖毒性试验、围生期毒性包括：一般生殖毒性试验、围生期毒性 试验。试验。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 四、含量（效价）测定四、含量（效价）测定 含量含量 表示表示 方法方法 百分含量，适用于结构明确的小百分含量，适用于结构明确的小 分子药物或经水解后变成小分子分子药物或经水解后变成小分子 的药物。的药物。 生物效价或酶活力，适用于酶类、生物效价或酶活力，适用于酶类、 蛋白质类等药物。蛋白质类等药物。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 （

30、一）含量测定（一）含量测定 1 1、HPLCHPLC法法 2 2、SDS-PAGESDS-PAGE法法 （二）效价测定：采用国际或国家参考（二）效价测定：采用国际或国家参考 品，或经国家检定机构认可的参考品，品，或经国家检定机构认可的参考品， 以体内或体外法测定其生物学活性，并以体内或体外法测定其生物学活性，并 标明其活性单位。标明其活性单位。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 第三节第三节 常用定量分析方法及其应用常用定量分析方法及其应用 一、理化法一、理化法 （一）化学分析法（一）化学分析法 1 1、重量法：根据样品中分离出的单质、重量法：根据样品中分离出的单质 或化合物的重量测定所含成

31、分的含量。或化合物的重量测定所含成分的含量。 （1 1）提取法）提取法 （2 2）挥发法）挥发法 （3 3）沉淀法）沉淀法 第五章生化药物与基因工程药物分 析 （二）电化学分析法（二）电化学分析法 离子选择性电极：测量离子活度的指示离子选择性电极：测量离子活度的指示 电极。电极。 2 2、滴定分析法：根据样品中某些成分与、滴定分析法：根据样品中某些成分与 标准溶液能定量地发生酸碱中和、氧化还标准溶液能定量地发生酸碱中和、氧化还 原或络合反应等进行测定。原或络合反应等进行测定。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 （三）光谱分析法（三）光谱分析法 1 1、比色法：样品与显色剂可发生颜色、比色法：

32、样品与显色剂可发生颜色 反应，依颜色反应的强度测定含量。反应，依颜色反应的强度测定含量。 如蛋白质的含量测定，可利用蛋白质如蛋白质的含量测定，可利用蛋白质 与双缩脲试剂发生颜色反应，而进行与双缩脲试剂发生颜色反应，而进行 定量测定。定量测定。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 2 2、UVUV法：样品或转化后的产物在某一波法：样品或转化后的产物在某一波 长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，长处有最大吸收，在一定的浓度范围内， 其浓度与吸收度成正比，则可进行定量测其浓度与吸收度成正比，则可进行定量测 定。如蛋白质在定。如蛋白质在280nm280nm左右有最大吸收左右有最大吸收 。 3 3、荧光

33、分光光度法：根据物质被、荧光分光光度法：根据物质被UVUV光照光照 射后产生的荧光强度进行定量测定。射后产生的荧光强度进行定量测定。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 （四）色谱分析法（四）色谱分析法 1 1、HPLCHPLC法法 （1 1）RP-HPLCRP-HPLC法：适用于肽类、氨基酸、法：适用于肽类、氨基酸、 蛋白质和多糖的测定。蛋白质和多糖的测定。 固定相：固定相：C8C8、C18C18烷基硅烷键合相烷基硅烷键合相 流动相：甲醇流动相：甲醇- -水、乙腈水、乙腈- -水（甲醇）、乙水（甲醇）、乙 腈腈- -缓冲液缓冲液 第五章生化药物与基因工程药物分 析 （2 2）高效离子交换色谱

34、法（）高效离子交换色谱法（HPIECHPIEC） HPIEC HPIEC特点如下：特点如下： 蛋白质、多肽的分离是根据其相应的蛋白质、多肽的分离是根据其相应的 离子化程度而进行的。离子化程度而进行的。 分离过程是以盐浓度增大的梯度洗脱分离过程是以盐浓度增大的梯度洗脱 法进行的法进行的 柱效中等并具较高质量的活性回收。柱效中等并具较高质量的活性回收。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 （3 3）高效凝胶过滤色谱法（）高效凝胶过滤色谱法（HPGFCHPGFC） HPGFC HPGFC特点如下：特点如下： 活性蛋白质可得以回收。活性蛋白质可得以回收。 分离是在固定比例的水溶液中进行的。分离是在固定

35、比例的水溶液中进行的。 分离是根据蛋白质或多肽在溶液中相分离是根据蛋白质或多肽在溶液中相 应的有效粒径而进行的。应的有效粒径而进行的。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 2 2、高效毛细管电泳法（、高效毛细管电泳法（HPCEHPCE） HPCE HPCE是根据带电组分在管中由于是根据带电组分在管中由于 其所带电荷和分子量的大小，即核质比其所带电荷和分子量的大小，即核质比 不同产生不同的迁移速度而分离。不同产生不同的迁移速度而分离。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 类类 型型 酶活力测定法：以酶为分析对象，酶活力测定法：以酶为分析对象， 测定样品中某种酶的活力或活性，测定样品中某种酶的活力

36、或活性， 并用活力单位和比活性表示并用活力单位和比活性表示 。 酶分析法：以酶为分析工具或分析酶分析法：以酶为分析工具或分析 试剂，测定样品中酶以外的其它物试剂，测定样品中酶以外的其它物 质的含量。质的含量。 二、酶法二、酶法 第五章生化药物与基因工程药物分 析 （一）酶活力测定法（一）酶活力测定法 1 1、定义：、定义： 酶活力是指酶催化一定化学反应的酶活力是指酶催化一定化学反应的 能力。酶活力的测定实际上是测定一个能力。酶活力的测定实际上是测定一个 被酶所催化的化学反应的速度被酶所催化的化学反应的速度可以用可以用 单位时间反应底物的减少或产物的增加单位时间反应底物的减少或产物的增加 来表示

37、。来表示。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 2 2、方法、方法 （1 1）终点法：在适当的条件下，把酶和）终点法：在适当的条件下，把酶和 底物混合，测定生成一定量产物所需的底物混合，测定生成一定量产物所需的 时间。时间。 （2 2）将酶和底物混合后隔一定时间，间）将酶和底物混合后隔一定时间，间 断地或连续地测定反应的连续变化。断地或连续地测定反应的连续变化。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 （3 3）将酶与底物混合后，让其反应一）将酶与底物混合后，让其反应一 定时间，然后停止反应，定量测定底定时间，然后停止反应，定量测定底 物减少或产物生成的量。物减少或产物生成的量。 第五章生化药物与

38、基因工程药物分 析 （二）酶分析法（二）酶分析法 1 1、动力学分析法：、动力学分析法： 通过条件控制，分别使底物、辅酶通过条件控制，分别使底物、辅酶 活化剂或抑制剂的浓度在酶反应中起决活化剂或抑制剂的浓度在酶反应中起决 定反应速度的主导作用。则酶的反应速定反应速度的主导作用。则酶的反应速 度和上述相应因素的浓度间将具有确定度和上述相应因素的浓度间将具有确定 的比例关系，通过测定酶反应速度即可的比例关系，通过测定酶反应速度即可 求出它们的浓度。求出它们的浓度。 第五章生化药物与基因工程药物分 析 2 2、总变量分析法（平衡法或终点法）：、总变量分析法（平衡法或终点法）： 根据被测物质（底物）的性质，选根据被测物质（底物）的性质，选 择适宜的分析工具酶对该物质进行作用，择适宜的分析工具酶对该物质进行作用， 在反应完成后，借助理化方法测出其总在反应完成后，借助理化方法测出其总 变化量，并参考反应的平衡点，计算出变化量，并参考反应的平衡点，计算出 被测物的实际含量或浓度。被测物的实际含量或浓度。