生物化学与分子生物学：第一章 蛋白质绪论

1、目目 录录 Biochemistry 目目 录录 第一章 绪 论 生物化学（生物化学（Biochemistry）是研究生物是研究生物 体的化学组成、生物分子的结构与功能、生体的化学组成、生物分子的结构与功能、生 物体的物质代谢及其调控的科学。物体的物质代谢及其调控的科学。 研究任务研究任务：从：从分子水平分子水平和和化学变化化学变化的深度阐的深度阐 明生命活动的机理，揭露生命现象的本质。明生命活动的机理，揭露生命现象的本质。 研究对象研究对象：生物体：生物体 研究方法研究方法：化学、物理、生物学：化学、物理、生物学 目目 录录 第一节第一节 生物化学发展简史生物化学发展简史 叙述生物化学阶段叙

2、述生物化学阶段 18世纪中叶至世纪中叶至20世纪初世纪初 生物体的化学组成生物体的化学组成 德国化学家德国化学家Fischer： 生物体的糖类、蛋白质、氨基酸生物体的糖类、蛋白质、氨基酸 合成多肽合成多肽 嘌呤环、嘧啶环的结构嘌呤环、嘧啶环的结构 生理化学家生理化学家Hoppe： 分离血红蛋白，首次提出分离血红蛋白，首次提出“生物化学生物化学” （ 1877年）年） 目目 录录 动态生物化学阶段动态生物化学阶段 20世纪中期世纪中期 酶学、细胞内的物质代谢（分解代谢）酶学、细胞内的物质代谢（分解代谢） 1926年：年：Sumner获得脲酶结晶获得脲酶结晶蛋白质蛋白质 1932年：年：Krebs

3、提出尿素循环的多酶反应途提出尿素循环的多酶反应途 径径 1937年：年：Krebs三羧酸循环三羧酸循环 目目 录录 分子生物学阶段分子生物学阶段 20世纪中、下叶世纪中、下叶 代谢及其调节、大分子的结构代谢及其调节、大分子的结构 50年代初：蛋白质的年代初：蛋白质的 螺旋结构螺旋结构 1953年：年：Watson和和Crick提出提出DNA双螺双螺 旋旋结构模型结构模型 DNA重组技术、重组技术、PCR技术、人类基因组计技术、人类基因组计 划（划（human genome project，HGP） 目目 录录 我国生物化学发展概况我国生物化学发展概况 20世纪世纪20年代年代 吴宪：蛋白质变性

4、学说吴宪：蛋白质变性学说 血糖测定法血糖测定法Folin-吴宪法吴宪法 1965年：人工合成牛胰岛素年：人工合成牛胰岛素 1981年：人工合成酵母丙氨酰年：人工合成酵母丙氨酰tRNA 目目 录录 第二节第二节 生物化学研究的主要内容生物化学研究的主要内容 1、生物分子的结构和功能生物分子的结构和功能 生物大分子：由某些基本结构单位生物大分子：由某些基本结构单位 按按 一定顺序和方式连接所形成的多聚体。一定顺序和方式连接所形成的多聚体。 2、物质代谢及调控物质代谢及调控 新陈代谢新陈代谢生命最基本的特征生命最基本的特征 摄取、消化、吸收、合成代谢、分解摄取、消化、吸收、合成代谢、分解 代谢、排泄

5、代谢、排泄 3、基因信息传递及其调控基因信息传递及其调控 遗传信息的传递、表达及调控遗传信息的传递、表达及调控 目目 录录 第一篇第一篇 生物大分子的结构和功能生物大分子的结构和功能 目目 录录 蛋白质的结构与功能蛋白质的结构与功能 第第 一一 章章 Structure and Function of Protein 目目 录录 一、什么是蛋白质一、什么是蛋白质? 蛋白质蛋白质(protein)是由许多氨基酸是由许多氨基酸 (amino acids)通过肽键通过肽键(peptide bond) 相连形成的高分子含氮化合物。相连形成的高分子含氮化合物。 目目 录录 二、蛋白质的生物学重要性二、蛋

6、白质的生物学重要性 1. 蛋白质是生物体重要组成成分蛋白质是生物体重要组成成分 分布广：分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞所有器官、组织都含有蛋白质；细胞 的各个部分都含有蛋白质。的各个部分都含有蛋白质。 含量高：含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，蛋白质是细胞内最丰富的有机分子， 占人体干重的占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、，某些组织含量更高，例如脾、 肺及横纹肌等高达肺及横纹肌等高达80。 种类多种类多: 目目 录录 1 1）作为生物催化剂（酶）作为生物催化剂（酶） 2 2）代谢调节作用）代谢调节作用 3 3）免疫保护作用）免疫保护作用 4 4）物质的转运和存储）物质

7、的转运和存储 5 5）运动与支持作用）运动与支持作用 6 6）参与细胞间信息传递）参与细胞间信息传递 2. 蛋白质具有重要的生物学功能蛋白质具有重要的生物学功能 3. 氧化供能氧化供能 目目 录录 蛋蛋 白白 质质 的的 分分 子子 组组 成成 The Molecular Component of Protein 第第 一一 节节 目目 录录 组成蛋白质的元素组成蛋白质的元素 主要有主要有C、H、O、N和和S。 有些蛋白质含有少量有些蛋白质含有少量磷磷或金属元素或金属元素铁、铁、 铜、锌、锰、钴、钼铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有，个别蛋白质还含有 碘碘 。 目目 录录 各种蛋白质的含氮量

8、很接近，平均为各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。 由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此， 只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以 下公式推算出蛋白质的大致含量：下公式推算出蛋白质的大致含量： 100克样品中蛋白质的含量克样品中蛋白质的含量 ( g % ) = 每克样品含氮克数每克样品含氮克数 6.25100 1/16% 蛋白质元素组成的特点蛋白质元素组成的特点 目目 录录 一、蛋白质中的氨基酸一、蛋白质中的氨基酸 组成蛋白质的基本单位组成蛋白质的基本单位 蛋白质在酶作用下水解终产物为氨蛋白质在酶作用下水解终产物

9、为氨 基酸，存在自然界中的氨基酸有基酸，存在自然界中的氨基酸有300余余 种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20 种，且均属种，且均属 L-氨基酸氨基酸（甘氨酸除外）。（甘氨酸除外）。 目目 录录 H 甘氨酸甘氨酸 CH3 丙氨酸丙氨酸 L-L-氨基酸的通式氨基酸的通式 R C +NH3 COO- H 目目 录录 1. 非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸 2. 极性中性氨基酸极性中性氨基酸 3. 酸性氨基酸酸性氨基酸 4. 碱性氨基酸碱性氨基酸 （一）氨基酸的分类（一）氨基酸的分类 * * 20 20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下种氨基酸的英文名称、缩写

10、符号及分类如下: : 目目 录录 甘氨酸甘氨酸 glycine Gly G 5.97 丙氨酸丙氨酸 alanine Ala A 6.00 缬氨酸缬氨酸 valine Val V 5.96 亮氨酸亮氨酸 leucine Leu L 5.98 异亮氨酸异亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02 苯丙氨酸苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 5.48 脯氨酸脯氨酸 proline Pro P 6.30 1. 非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸 目目 录录 目目 录录 色氨酸色氨酸 tryptophan Try W 5.89 丝氨酸丝氨酸 serine Ser S 5.68 酪

11、氨酸酪氨酸 tyrosine Try Y 5.66 半胱氨酸半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07 蛋氨酸蛋氨酸 methionine Met M 5.74 天冬酰胺天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41 谷氨酰胺谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65 苏氨酸苏氨酸 threonine Thr T 5.60 2. 极性中性氨基酸极性中性氨基酸 目目 录录 目目 录录 天冬氨酸天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97 谷氨酸谷氨酸 glutamic acid Glu E 3.22 赖氨酸赖氨酸 lysine Lys K 9.74 精氨酸精氨酸

12、 arginine Arg R 10.76 组氨酸组氨酸 histidine His H 7.59 3. 酸性氨基酸酸性氨基酸 4. 碱性氨基酸碱性氨基酸 目目 录录 目目 录录 几种特殊氨基酸几种特殊氨基酸 脯氨酸脯氨酸 （亚氨基酸）（亚氨基酸） CH2 CHCOO- NH2+ CH2 CH2 CH2 CHCOO- NH2+ CH2 CH2 目目 录录 -OOC-CH-CH2-S +NH3 S-CH2-CH-COO- +NH3 -OOC-CH-CH2-S +NH3 S-CH2-CH-COO- +NH3 半胱氨酸半胱氨酸 + 胱氨酸胱氨酸 二硫键二硫键 -HH -OOC-CH-CH2-SH +

13、NH3 -OOC-CH-CH2-SH +NH3 HS-CH2-CH-COO- +NH3 HS-CH2-CH-COO- +NH3 目目 录录 （二）氨基酸的理化性质（二）氨基酸的理化性质 1. 两性解离及等电点两性解离及等电点 氨基酸是两性电解质，其解离方式和程氨基酸是两性电解质，其解离方式和程 度取决于所处溶液的酸碱度。度取决于所处溶液的酸碱度。 等电点等电点(isoelectric point, pI) 在某一在某一pH的溶液中，氨基酸解离成的溶液中，氨基酸解离成 阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为 兼性离子，呈电中性，此时溶液的兼性离子，呈电中性，此时

14、溶液的pH值值 称为该氨基酸的称为该氨基酸的等电点等电点。 目目 录录 pH=pI +OH- pHpI +H+ +OH- +H+ pHpIpHpI, , 蛋白质带负电蛋白质带负电, , 体内蛋白质的体内蛋白质的pIpI大大 多为多为5.05.0左右左右, , 故生理条件下一般以故生理条件下一般以负离子负离子形形 式存在式存在. . 目目 录录 （二）蛋白质的胶体性质（二）蛋白质的胶体性质 蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自 1万至万至100万之巨，其分子的直径可达万之巨，其分子的直径可达1 100nm，为胶粒范围之内。，为胶粒范围之内。 * * 蛋白质胶体

15、稳定的因素蛋白质胶体稳定的因素 颗粒表面电荷颗粒表面电荷 水化膜水化膜 目目 录录 + + + + + + + 带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质 带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质 水化膜水化膜 + + + + + + + 带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质 带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒 酸酸碱碱 酸酸碱碱 酸酸碱碱 脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用 溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉 目目 录录 （三）蛋白质的变性、沉淀和凝固（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固 * 蛋白质的变性蛋白质的变性(denaturati

16、on) 在某些物理和化学因素作用下，其特在某些物理和化学因素作用下，其特 定的空间构象被破坏（也即有序的空间定的空间构象被破坏（也即有序的空间 结构变成无序的空间结构），从而导致结构变成无序的空间结构），从而导致 其理化性质改变和生物活性的丧失。其理化性质改变和生物活性的丧失。 目目 录录 造成变性的因素造成变性的因素 物理因素：物理因素：加热、紫外线加热、紫外线、X线、超声波线、超声波 化学因素：乙醇等有机溶剂化学因素：乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、强酸、强碱、 重金属离子及生物碱试剂等重金属离子及生物碱试剂等 。 变性的本质变性的本质 破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白破坏非共价键和二硫键，不

17、改变蛋白 质的一级结构。质的一级结构。 目目 录录 变性特征变性特征 : : 生物活性的丧失生物活性的丧失; ; 理化性质的改变理化性质的改变 ( (溶解度降低、球状蛋白质的不对称性增溶解度降低、球状蛋白质的不对称性增 加、粘度增加、扩散系数降低加、粘度增加、扩散系数降低, , 某些蛋白某些蛋白 质不能够再形成结晶质不能够再形成结晶, , 变性后分子结构松变性后分子结构松 散、易被水解散、易被水解, , 变性蛋白易消化变性蛋白易消化) )。 目目 录录 u 应用举例应用举例 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及临床医学上，变性因素常被应用来消毒及 灭菌。灭菌。 此外此外, , 防止蛋白质变性也

18、是有效保存蛋白质防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质 制剂（如疫苗等）的必要条件。制剂（如疫苗等）的必要条件。 目目 录录 若蛋白质变性程度较轻，去除变性若蛋白质变性程度较轻，去除变性 因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其 原 有 的 构 象 和 功 能 ， 称 为原 有 的 构 象 和 功 能 ， 称 为 复 性复 性 (renaturation) 。 目目 录录 天然状态，天然状态， 有催化活性有催化活性 尿素、尿素、 -巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、 -巯基乙醇巯基乙醇 非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性 目目 录录 * * 蛋白质沉淀蛋白质沉淀 在

19、一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽 链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。 变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉 淀，但并不变性。淀，但并不变性。 * 蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固 的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。 目目 录录 （四）蛋白质的紫外吸收（四）蛋白质的紫外吸收 由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪

20、氨酸由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸 和色氨酸，因此在和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收波长处有特征性吸收 峰。蛋白质的峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因与其浓度呈正比关系，因 此可作蛋白质定量测定。此可作蛋白质定量测定。 目目 录录 （五）蛋白质的呈色反应（五）蛋白质的呈色反应 茚三酮反应茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚 三酮反应。三酮反应。 双缩脲反应双缩脲反应(biuret reaction) 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与 硫酸铜

21、共热，呈现紫色或红色，此反应称为硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双双 缩脲反应缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解 程度。程度。 目目 录录 二、蛋白质的分离和纯化二、蛋白质的分离和纯化 （一）透析及超滤法（一）透析及超滤法 * 透析透析(dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分 开的方法。开的方法。 * * 超滤法超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留 分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。

22、目目 录录 （二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 *使用使用丙酮沉淀丙酮沉淀时，必须在时，必须在04低温下进行，低温下进行， 丙酮用量一般丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白倍于蛋白质溶液体积。蛋白 质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以 外，也可用乙醇沉淀。外，也可用乙醇沉淀。 *盐析盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠是将硫酸铵、硫酸钠 或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面 电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质 沉淀。沉

23、淀。 目目 录录 * * 免疫沉淀法：免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物将某一纯化蛋白质免疫动物 可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗 体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体 复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分 离获得抗原蛋白。离获得抗原蛋白。 目目 录录 （三）电泳（三）电泳 蛋白质在高于或低于其蛋白质在高于或低于其pIpI的溶液中为带电的溶液中为带电 的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种 通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白通过蛋白质

24、在电场中泳动而达到分离各种蛋白 质的技术质的技术, , 称为称为电泳电泳(elctrophoresis) 。 根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝 胶电泳等。胶电泳等。 目目 录录 几种重要的蛋白质电泳几种重要的蛋白质电泳 *SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质，常用于蛋白质 分子量的测定。分子量的测定。 *等电聚焦电泳等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异，通过蛋白质等电点的差异 而分离蛋白质的电泳方法。而分离蛋白质的电泳方法。 *双向凝胶电泳双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技是蛋白质组学研究的重要技 术。术。 目目 录录 （四）层析

25、（四）层析 层析层析(chromatography)分离蛋白质的原理分离蛋白质的原理 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个 固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的 蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待 分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不 同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。 目目 录录 蛋白质分离常用的层析方法蛋白质分离常用的层析方法 * * 离子交换层析：离子交换层析：利用各蛋白质的电荷

26、量及性利用各蛋白质的电荷量及性 质不同进行分离。质不同进行分离。 * * 凝胶过滤凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，又称分子筛层析，利利 用用各各蛋白质分子大小不同分离。蛋白质分子大小不同分离。 目目 录录 目目 录录 目目 录录 （五）超速离心（五）超速离心 * * 超速离心法超速离心法(ultracentrifugation)既可以既可以 用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋 白质的分子量。白质的分子量。 *蛋白质在离心场中的行为用蛋白质在离心场中的行为用沉降系数沉降系数 (sedimentation coefficient, S)表示

27、表示,沉降系沉降系 数与蛋白质的密度和形状相关数与蛋白质的密度和形状相关 。 目目 录录 因为沉降系数因为沉降系数S大体上和分子量成正比大体上和分子量成正比 关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子 量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤 维状蛋白质不适用。维状蛋白质不适用。 目目 录录 三、多肽链中氨基酸序列分析三、多肽链中氨基酸序列分析 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基 把肽链水解成片段，分别进行分析把肽链水解成片段，分别进行分析 测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用测定各