生物化学和分子生物学：第十四章 DNA生物合成

1、第十四章 DNA的生物合成的生物合成 DNA Biosynthesis ( Replication ) 1 Structure of DNA Nature, 1953 Discovery of DNA Structure and Function 2 DNA复制复制(replication) :以亲以亲代代DNA作为合成模板，作为合成模板， 按照碱基配对原则合成按照碱基配对原则合成子代子代DNA分子分子，其化学本质，其化学本质 是酶促脱氧核苷酸聚合反应。是酶促脱氧核苷酸聚合反应。 复制复制 亲代亲代DNA 子代子代DNA 3 1. DNA复制复制有哪些有哪些基本基本特征？特征？ 2. DNA复

2、制需要哪些酶？分别发挥何种功能？复制需要哪些酶？分别发挥何种功能？ 3. DNA的双螺旋结构在复制中发生何种变化？的双螺旋结构在复制中发生何种变化？ 4. 原核生物是如何进行原核生物是如何进行DNA复制的？复制的？ 5. 真核生物是如何进行真核生物是如何进行DNA复制的？复制的？ 6. 线粒体线粒体DNA是如何复制的？是如何复制的？ 7. 逆转录合成逆转录合成DNA是如何进行的？是如何进行的？ 核心核心内容内容： 4 DNA复制复制的的基本基本特征特征 Basic Rules of DNA Replication 第第 一一 节节 5 密度梯度离心试验密度梯度离心试验 （Meselson-St

3、ahl experiment） 6 半 保 留 复 制半 保 留 复 制 ( s e m i - conservative replication): DNA两条单链各自为模板两条单链各自为模板 按碱基配对原则合成互补按碱基配对原则合成互补 链，所形成的子代链，所形成的子代DNA一一 条条链来自链来自亲代、另一条从亲代、另一条从 新合成，碱基序列与亲代新合成，碱基序列与亲代 DNA完全一致。完全一致。 一、一、DNA以以半保留方式进行复制半保留方式进行复制 7 二、二、DNA复制从起始点向两个方向延伸复制从起始点向两个方向延伸 形成双向复制形成双向复制 8 复制子复制子(replicon)：含

4、一个复制起始点的独立复制单：含一个复制起始点的独立复制单 元，是一个完整元，是一个完整DNA分子或分子或DNA分子上的某段区域。分子上的某段区域。 ori ter 原核生物环状原核生物环状DNA仅仅一个复制点一个复制点(origin), 是单复制子双向复制是单复制子双向复制 9 5 3 oriorioriori 5 3 5 5 3 3 真核生物每条染色体存在多个起始真核生物每条染色体存在多个起始 点，是多复制子复制点，是多复制子复制 10 3 5 3 5 解链方向解链方向 3 5 3 3 5 领头链领头链 (leading strand) 随从链随从链 (lagging strand) 三、三

5、、DNA一股子链复制的方向与解链一股子链复制的方向与解链 方向相反导致半不连续复制方向相反导致半不连续复制 11 前导链或领头链前导链或领头链(leading strand)：顺着顺着解链方解链方 向生成的子链，复制是连续进行向生成的子链，复制是连续进行的。的。 后随链后随链(lagging strand)：复制方向复制方向与解链方向与解链方向 相反，是不连续相反，是不连续复制的复制的链。链。复制中的不连续片复制中的不连续片 段段称为称为冈冈崎片段崎片段(Okazaki fragment)。 12 1. 半保留半保留(semi-conservative ) DNA复制的主要特征复制的主要特征:

6、 2. 双向性双向性(bidirectional ) 3. 半不连续半不连续(semi-discontinuous ) 4. 高保真性高保真性(high fidelity) 13 DNA复制的酶学和拓扑学变化复制的酶学和拓扑学变化 第第 二二 节节 Enzymology and Topology of DNA Replication 14 1. 底物底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP； 2. 聚合酶聚合酶(polymerase): 依赖依赖DNA的的DNA聚聚合合酶酶 3. 模板模板(template): 解开成单链的解开成单链的DNA母链；母链； 4.

7、 引物引物(primer): RNA短链，为短链，为dNTP提供提供3 -OH末端；末端； 5. 其他其他的酶和蛋白质的酶和蛋白质因子因子 参与参与DNA复制的物质复制的物质: 15 DNA-dependent DNA polymerase （DNA pol），）， 具有具有53 的聚合活的聚合活性和核性和核酸外切酶活性酸外切酶活性 1. 原原核生核生物物DNA pol：DNA pol I; DNA pol II; DNA pol III 2. 真真核核生生物物DNA pol：DNA pol ; DNA pol ; DNA pol ; DNA pol ; DNA pol 一一、DNA聚合酶催化

8、核苷酸间的聚合聚合酶催化核苷酸间的聚合 16 多亚基不对称二聚体，结多亚基不对称二聚体，结构包括：构包括： DNA pol III (105 nt/min) 核心酶核心酶 核心酶核心酶 -复合物复合物 1对对 -亚基（可滑亚基（可滑 动的动的DNA夹子）夹子） 亚基，亚基，合成合成DNA； 亚基，亚基，35 外切外切酶活性；酶活性； 亚基，亚基，组装组装 核心酶：核心酶： 17 DNA pol III 核心酶核心酶 核心酶核心酶 -复合物复合物 1对对 -亚基（可滑亚基（可滑 动的动的DNA夹子）夹子） 亚基亚基：柔性柔性连接连接 区确保区确保2个个核心酶核心酶 分别分别负责合成前负责合成前

9、导链和后随链导链和后随链。 功能功能：促促进全酶组进全酶组 装至模板装至模板上，增强上，增强 核心核心酶活性酶活性 -复合物：复合物： 、 、 、 、 、 亚基亚基 亚基：夹亚基：夹稳稳DNA模板，模板， 促使促使酶沿模板滑酶沿模板滑动动 18 功能：对复制中的错误进功能：对复制中的错误进 行校行校读；对读；对复制和修复中复制和修复中 出现的空隙进行填补出现的空隙进行填补。 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶 F G A FA R GR 3 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 小小片段片段Klenow DNA-pol I，单肽，多个，单肽，多个螺旋组成螺旋组成 19 E.Co

10、li真核细胞真核细胞 功能功能 填补复制中的填补复制中的DNA空隙，空隙，DNA校对校对 和修复和修复 DNA损伤应急修复损伤应急修复 DNA修复修复 线粒体线粒体DNA合成合成 /前导链及后随链合成，错配修复前导链及后随链合成，错配修复 DnaG 引物酶引物酶 真核生物和原核生物真核生物和原核生物DNA聚合酶的比较聚合酶的比较 20 二二、DNA聚合酶的碱基选择和校对功能聚合酶的碱基选择和校对功能 实现复制的保真性实现复制的保真性 DNA复制的保真性至少依赖三种机制：复制的保真性至少依赖三种机制： 1. 遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律； 2. 聚合酶在复制中对碱基的选择功能；

11、聚合酶在复制中对碱基的选择功能； 3. 复制出错时有复制出错时有DNA聚合酶具有即时校读功能。聚合酶具有即时校读功能。 21 1. DNA pol对碱基的正确选择对碱基的正确选择 DNA pol 对核苷酸的参入具有选择功能对核苷酸的参入具有选择功能 2. DNA pol的的核酸外切酶活性在复制中辨认核酸外切酶活性在复制中辨认 切除错配碱基并加以校正切除错配碱基并加以校正 核酸外切酶核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的末端把是指能从核酸链的末端把 核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的。核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的。 复制保真的酶学机制复制保真的酶学机制 22

12、A：DNA-pol I 的的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合 活性掺入正确配对的底物。活性掺入正确配对的底物。 B：碱基配对正确，：碱基配对正确， DNA-pol I不不表表现外切核酸酶活现外切核酸酶活性。性。 DNA pol的的校读功能校读功能 23 解链过程解链过程中必然产生正中必然产生正超螺超螺旋旋 10 8 局部解链后局部解链后 如何解链？如何解链？ 24 多多种酶参与种酶参与DNA解链和稳定单链状态解链和稳定单链状态 DNA拓扑异构酶改变拓扑异构酶改变DNA超螺旋超螺旋状态状态 三、三、复制中的分子解链伴有复制中的分子解链伴有DNA DNA 分子拓

13、扑学变化分子拓扑学变化 25 理理顺顺DNA链链拓拓扑扑异异构构酶酶 (gyrA, B) 稳稳定定已已解解开开的的单单链链单单链链DNA 结结合合蛋蛋白白 SSB 催催化化RNA引引物物生生成成引引物物酶酶DnaG (dnaG) 运运送送和和协协同同DnaB DnaC (dnaC) 解解开开DNA双双链链 解解螺螺旋旋酶酶DnaB (dnaB) 辨辨认认起起始始点点 DnaA (dnaA) 蛋蛋白白质质（基基因因）通通用用名名功功能能 原原核核生生物物复复制制起起始始的的相相关关蛋蛋白白质质 （一）多种酶参与（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态解链和稳定单链状态 26 解解螺旋酶螺旋酶(h

14、elicase)利用利用ATP供能，作用供能，作用 于氢键，使于氢键，使DNA双链解开成为两条单链双链解开成为两条单链。 引物引物酶酶(primase) 复制起始时催化生成复制起始时催化生成RNA 引物的酶引物的酶。 单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 与单链与单链DNA结合，在结合，在复制中维复制中维 持模板处于单链状态并保护单链的完整。持模板处于单链状态并保护单链的完整。 27 拓扑异构酶拓扑异构酶 切断切断DNA双链中一股链，使双链中一股链，使DNA解解 链旋转不致打结链旋转不致打结；封；封闭切口，闭切口，D

15、NA 变为松弛变为松弛状态，无需状态，无需ATP供能供能。 拓扑异构酶拓扑异构酶 切断切断DNA分子两股链分子两股链，双双链链DNA通通 过切口使过切口使超螺旋松弛。超螺旋松弛。 利用利用ATP供能，连接断端，供能，连接断端， DNA分分 子进入负超螺旋状态。子进入负超螺旋状态。 （二）（二）DNA拓扑异构酶改变拓扑异构酶改变DNA超螺旋超螺旋状态状态 28 Topo II 在复制叉附近 区域切断DNA双链， 未复制的dsDNA穿过 切口移去正超螺旋进 入负超螺旋状态，断 端在酶的作用下连接 恢复，ATP供能。 29 复制叉处的蛋白协同作用复制叉处的蛋白协同作用 30 DNA ligase：催

16、化：催化DNA缺口缺口(nick)上游单链上游单链3 -OH和下和下 游单链游单链5 -P间形成间形成磷酸二酯键磷酸二酯键，连接，连接成一条完整的链。成一条完整的链。 P O O- O- O HO 5 P O O- O- O 3 3 5 DNA连接酶连接酶 ATP ADP 53 53 四四、DNA连接酶连接连接酶连接DNA双链中的单链缺口双链中的单链缺口 31 提供核糖提供核糖3 -OH提供提供5 -P结果结果 DNA聚合酶聚合酶 引物或延长中的新链引物或延长中的新链游离游离dNTP(dNMP)n+1 连接酶连接酶复制中不连续的两条单链复制中不连续的两条单链不连续不连续连续链连续链 拓扑酶拓扑

17、酶切断、整理后的两链切断、整理后的两链改变拓扑状态改变拓扑状态 DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化聚合酶，拓扑酶和连接酶催化 3 ,5 -磷酸二酯键生成的比较磷酸二酯键生成的比较 32 原核生物原核生物DNA复制过程复制过程 The Process of DNA Replication in Prokaryotes 第第 三三 节节 33 两两个问题：个问题： 1. DNA解开成单链，提供解开成单链，提供模板模板 2. 形成引发体，合成引物，提供形成引发体，合成引物，提供3 -OH 一一、复制的起始复制的起始 34 E.coli复制起始点复制起始点 oriC的序列特征的序列特征 （识别区）（识别

18、区） （AT-rich） 35 1. DnaA-ATP识别结合识别结合 反向重复序列区反向重复序列区 2. DnaA蛋白多聚，促蛋白多聚，促 使使AT-rich 区解链区解链 3. DnaB在在DnaC协同下协同下 识别识别AT-rich区区 4. DnaB活化，解开双活化，解开双 链并沿解链方向移动。链并沿解链方向移动。 （一）（一）In E.coli, 解链过程由解链过程由DnaA、B、C三种蛋白完成三种蛋白完成 36 含有含有解旋解旋酶酶(DnaB)、DnaC蛋白、引物酶蛋白、引物酶(DnaG)和和DNA 复制起始复制起始区的区的复合结构称为复合结构称为引发体（引发体（primosome

19、)。 ( (二二）引发体形成和引物合成引发体形成和引物合成 37 3 3 5 3 5 引物引物是由引物是由引物酶催化酶催化NTP聚聚 合所生成合所生成的短链的短链RNA分子。分子。 引物引物 3 HO 5 引物酶引物酶 引物引物长度约为长度约为十到十到几十个核苷酸。几十个核苷酸。 引物合成的方向引物合成的方向53。 38 复制的复制的延长：在延长：在DNA-pol催化下，催化下，dNTP以以dNMP 的方式逐个加入引物或的方式逐个加入引物或延伸中延伸中的子的子链，化学链，化学本质本质 是磷酸二酯键的不断生成。是磷酸二酯键的不断生成。 二、二、DNA链的延长：链的延长：领头链连续复制，随从领头链

20、连续复制，随从 链不连续复制链不连续复制 39 领头链的合成领头链的合成：沿沿5 5 33 方向连续延伸方向连续延伸 40 随从随从链链的合成的合成：延长方向与解链方向相反延长方向与解链方向相反，复，复 制叉制叉解开解开至至一定一定长度时生成长度时生成引物并延长子链。引物并延长子链。 41 同同一一复制叉处复制叉处由一个由一个DNA-pol同时合成前导链和后随链同时合成前导链和后随链 42 原核生物原核生物DNA双向复制在复制终止双向复制在复制终止点点(ter)汇合汇合 三、复制终止：三、复制终止：切除引物、填补空缺、连接切口切除引物、填补空缺、连接切口 43 后随链后随链上不连上不连续片续片

21、段的段的连接连接：RNase水解水解引引 物，物，DNA Pol I填补空缺，连接酶连接缺口填补空缺，连接酶连接缺口 44 真核生物真核生物DNA生物合成过程生物合成过程 The Process of DNA Biosynthesis in Eukaryotes 第第 四四 节节 45 1. 真真核生物复制子核生物复制子多，复制具有时序性；多，复制具有时序性； 2. 冈冈崎片段崎片段短，短，DNA聚合酶聚合效率低、复聚合酶聚合效率低、复制制 叉前进速度慢等叉前进速度慢等； 3. DNA复制从引发进入延伸阶段发生复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合聚合 酶酶 / 转换转换； 4. 核酸酶核酸酶R

22、NaseH I和和FEN1切除冈崎片段引物。切除冈崎片段引物。 真核生物与原核生物真核生物与原核生物DNA复制的复制的差异差异 46 1. 复制复制起始点比起始点比E. coli的的OriC短短，酵母，酵母复制起点复制起点 为为11bp富含富含AT的自主复制序列（的自主复制序列（autonomous replication sequence，ARS） 2. 双双链打开成复制叉，形成引发体、合成引物链打开成复制叉，形成引发体、合成引物 3. 复制起始需复制起始需DNA pol 、pol 、拓扑酶和复制因、拓扑酶和复制因 子子(replication factor, RF)参与。参与。 一一、真核

23、生物真核生物复制的复制的起始起始与原核生物基本相似与原核生物基本相似 47 同源 三 聚 体 ， 与同源 三 聚 体 ， 与 E.coli DNA聚合酶聚合酶III 亚基的结构亚基的结构 及功能相似，及功能相似，形成闭合环形形成闭合环形 的可滑动的可滑动DNA夹子夹子；使使pol 获得持续合成的能力获得持续合成的能力。 PCNA水平是检验细胞增水平是检验细胞增 殖的重要指标殖的重要指标。 增殖细胞核抗原（增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen, PCNA) 48 二二、真核生物复制的延长发生真核生物复制的延长发生DNA聚合酶聚合酶/转换转换 前导链

24、：出现在引发后期前导链：出现在引发后期 后随链：发生于每个冈崎片段合成之际后随链：发生于每个冈崎片段合成之际 发生发生DNA聚合酶聚合酶 / 转换的转换的原因：原因：Pol 不具备持不具备持 续合成续合成能力；冈崎片段长度仅为一个或若干个核能力；冈崎片段长度仅为一个或若干个核 小体所含的小体所含的DNA。 DNA聚合酶聚合酶 / 转换的转换的关键蛋白是关键蛋白是RFC和和PNCA。 49 原有组蛋白大部分可重新组装至子代原有组蛋白大部分可重新组装至子代DNADNA链上。链上。 三、真核生物三、真核生物DNA合成后立即组装成核小体合成后立即组装成核小体 50 染色体染色体两端两端DNA子子链链

25、最后最后复制的复制的RNA引物引物 去除去除后留下空隙后留下空隙。 DNA单链易被酶解，单链易被酶解， 经多轮复制后造成染色经多轮复制后造成染色 体缩短。体缩短。 线性染色体末端复制的问题线性染色体末端复制的问题 51 真核生物真核生物染色体线性染色体线性DNA分子末端的分子末端的结构，由富含结构，由富含 TGTG的重复序列组成。的重复序列组成。 功能功能：维持维持DNA复制的复制的完整性，保完整性，保持染色体稳定持染色体稳定 结构结构特点：特点： 由末端单链由末端单链DNA和和蛋白质构成。蛋白质构成。 末端末端DNA序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含G、T碱碱基的短基的短序序 列列，每

26、个末端的，每个末端的3端比端比5端长，形成单链端长，形成单链ssDNA。 人的端粒重复序列为人的端粒重复序列为5-(TTAGGG)n-35-(TTAGGG)n-3 端粒端粒(telomere) 52 端粒酶（端粒酶（telomerase）是一种是一种核糖核蛋白，核糖核蛋白，由由RNA 和蛋白质组成。和蛋白质组成。 端粒酶以自己的端粒酶以自己的RNA组分作为模板，以染色体的组分作为模板，以染色体的3 端端ssDNA为为引物，将端粒序列添加于染色体的引物，将端粒序列添加于染色体的3 端端 端粒酶组成：端粒酶组成：端粒酶端粒酶RNA ；端粒；端粒酶协同蛋白酶协同蛋白(hTP1) 端粒端粒酶酶逆转录酶

27、逆转录酶 四、四、端粒端粒酶参与解决染色体末端复制问题酶参与解决染色体末端复制问题 53 端粒酶催化作用的爬行模型端粒酶催化作用的爬行模型 1. 1. 端粒酶端粒酶RNARNA的（的（A An nC Cn n) )x x配对母链配对母链 DNADNA的的( (T Tn nG Gn n) )x x序列；序列； 2. 2. DNADNA母链以端粒酶母链以端粒酶RNARNA为模板为模板 进行进行33末端延伸；末端延伸； 3. 3. 端粒酶爬行至端粒酶爬行至DNADNA链新合成的链新合成的33 末端，以逆转录方式延伸末端，以逆转录方式延伸DNADNA 母链母链 4. 4. 重复上述步骤直至重复上述步骤

28、直至DNADNA母链至母链至 合适长度，端粒酶脱离母链；合适长度，端粒酶脱离母链； 5. 5. DNADNA母链母链33末端反折，在末端反折，在 DNA-DNA-polpol催化下完成末端双链复催化下完成末端双链复 制。制。 54 绝大多数体细胞绝大多数体细胞 （端粒酶活性很（端粒酶活性很 低或没有）低或没有） 端粒随细端粒随细 胞分裂而胞分裂而 逐渐缩短逐渐缩短 20-6020-60代后细胞代后细胞 老化或死亡老化或死亡 端粒酶活端粒酶活 性上调性上调 细胞永生化细胞永生化癌症癌症 端粒酶高活性的细胞：端粒酶高活性的细胞： 生殖细胞生殖细胞 早期胚胎细胞，包括胚胎干细胞早期胚胎细胞，包括胚胎

29、干细胞 成体干细胞，如造血干细胞成体干细胞，如造血干细胞 90% 90%以上的癌细胞以上的癌细胞 端粒酶基因突变或功能异常与许多人类疾病有关端粒酶基因突变或功能异常与许多人类疾病有关 端粒酶在人类发育和疾病中的作用端粒酶在人类发育和疾病中的作用 55 五、真核生物染色体五、真核生物染色体DNA在每个细胞周期中在每个细胞周期中 只能复制一次只能复制一次 G1S及及G2M受到蛋白激酶调节受到蛋白激酶调节，包括，包括调节亚基调节亚基 细胞周期蛋白细胞周期蛋白(cyclin)和催化亚基即细胞周期蛋白和催化亚基即细胞周期蛋白 依赖激酶依赖激酶(cyclin dependent kinase，CDK)。 56 复制基因的选择复制基因的选择出现于出现于G1期期，基因组的每个复，基因组的每个复 制基因位点均组装制基因位点均组装前复制复合物（前复制复合物（pre- replicative complex，pre-RC）。 复制起点的激活复制起点的激活出现于出现于细胞入细胞入S期期，激活激活pre-RC， 募集若干复制基因结合蛋白和募集若干复制基因结合蛋白和DNA聚合酶，并聚合酶，并 起始起始DNA解旋。解旋。 DNA复制起始复制起始分两步分两